Шведова Евгения Владимировна, эксперт 1-й категории лаборатории биохимии медицинских иммунобиологических препаратов
expert of laboratory of biochemistry
Устинникова Ольга Борисовна, к. б. н., начальник лаборатории биохимии медицинских иммунобиологических препаратов
Рунова Ольга Борисовна, к. х. н., главный эксперт лаборатории биохимии медицинских иммунобиологических препаратов
Волкова Рауза Асхатовна, д. б. н., начальник лаборатории молекулярно-биологических и генетических методов испытаний
Бондарев Владимир Петрович, д. м. н., профессор, директор
Смолов Максим Александрович, к. х. н., н. с. лаборатории физико-химических методов отдела аналитических методов
Шукуров Рахим Рахманкулыевич, к. б. н., начальник лаборатории физико-химических методов отдела аналитических методов
Вишневский Александр Юрьевич, к. б. н., начальник отдела аналитических методов
Введение. Использование европейского стандартного образца с подтвержденной структурой СRS Нuman coagulation factor в качестве образца сравнения позволяет подтвердить подлинность первичной структуры вновь производимой серии рекомбинантного белка. Ввиду высокой коммерческой стоимости европейского образца, а также с целью обеспечения независимости отечественного продукта от зарубежного референсного образца производители традиционно используют производственный стандартный образец (СО). Нормативные требования к порядку аттестации СО и полноте его характеристики отсутствуют.
Материалы и методы. В качестве кандидата в СО была выбрана серия препарата рекомбинантного активированного фактора свертывания крови VII (rFVIIa) (Эптакога альфа) «Коагил VII». В ходе анализа применена схема оптимизированного протеолиза с предварительным дегликозилированием молекулы. В качестве референсной аминокислотной последовательности использована последовательность рекомбинантного фактора свертывания VII (rFVII), приведенная в монографии 01/2015:2534 Европейской Фармако пеи (издание 9.0). Исследование проводилось с применением методов пептидного картирования и масс-спектрометрического анализа.
Результаты. Разработан порядок аттестации производственного СО rFVIIa. Образец предназначен для подтверждения подлинности rFVIIa методом пептидного картирования с последующим детектированием результатов методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Представленный порядок аттестации производственного СО rFVIIa позволяет получить полностью охарактеризованный образец сравнения с подтвержденной первичной структурой. Применение данного СО гарантирует достоверную оценку подлинности методом пептидного картирования вновь производимого rFVIIa, как при наличии европейского образца CRS, так и при его отсутствии.
Заключение. Исследование позволило подтвердить аминокислотную последовательность тяжелой и легкой цепей rFVIIa. Для кандидата в СО, в сравнении с образцом CRS и оригинальным препаратом «НовоСэвен», получена характерная пептидная карта и обоснован выбор опорных пиков.
Конфликт интересов. Авторы Смолов М. А., Шукуров Р. Р., Вишневский А. Ю. являются сотрудниками ООО «Международный биотехнологический центр „Генериум”».
Introduction. The use of European reference standard with the known structure (СRS Нuman coagulation factor) as a reference allows to confirm identity of the primary structure of new batches of the recombinant protein. Manufactures normally use an industry standard sample due to the high cost of the European reference standard and to make sure that national samples are independent from the international reference standards. Regulatory requirements for the qualification procedure of an industry standard sample are absent.
Materials and methods. Batch of recombinant activated clotting factor VII (rFVIIa) (Eptacog alpha) («Koagil») was selected as a candidate material. The method of strong hydrolysis with the initial deglycosylation of the molecule was used. Amino acid sequence of rFVIIa, described in the monograph 01/2015:2534 of European Pharmacopoeia (Ed. 9.0) was used as a reference. Peptide mapping and mass-spectrometric assay were used in the study.
Results. Qualification procedure of industry standard sample of rFVIIa was developed. The standard sample was used for the proof of identity of rFVIIa by RP-HPLC peptide mapping. Qualification procedure of an industry standard sample of rFVIIa allows to obtain fully characterized reference sample with the established structure. The use of this standard sample guarantees accurate assessment of the identification by peptide mapping of the new batches of rFVIIa with or without European reference standard.
Conclusion. Peptide mapping and mass-spectrometric assay allows us to confirm amino acid sequence of light and heavy chains of rFVIIa with 100 % coverage. The peptide map was established for the candidate material in comparison with the original drug NovoSeven and the selection of сharacteristic peaks was justified. These peaks were characterized by stability and symmetry factors. Amino acid sequence of peptides corresponding to the reference peaks and their primary localization in the molecule were established by the use of tandem mass-spectrometry.
Conflict of interest. The authors Smolov M. А., Shukurov R. R., Vishnevskiy A. Yu. are the employees of the International Biotechnology Center «Generium».
The authors declare that there are no conflicts of interest present.