bloodjourГематология и трансфузиологияRussian journal of hematology and transfusiology0234-57302411-3042ООО Издательский дом «Практика»10.18821/0234-5730-2016-61-4-196-200bloodjour-34Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESИспользование метода пиросеквенирования для выявления и количественной оценки аллельной нагрузки мутаций в 12-м экзоне гена JAK2Using of pyrosequencing method for the detection and quantitative determination of mutant JAK2 exon 12 allele burdenhttps://orcid.org/0000-0001-7790-5033CубботинаТ. Н.SubbotinaT. N.

Субботина Татьяна Николаевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры медицинской биологии ФГАОУ ВО Сибирский федеральный университет, старший научный сотрудник Красноярского филиала ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России

660036, г. Красноярск

Subbotina Tatiana N., BD, PhD, assistant professor of the Department of Medical Biology of the Siberian Federal University; senior researcher Krasnoyarsk branch of the Federal State budgetary Institution Hematology Research Center

Krasnoyask, 660036

stn.25@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4477-8506ДунаеваЕ. А.DunaevaE. A.

111123, г. Москва

111123, Moscow

https://orcid.org/0000-0001-8207-9215МироновК. О.MironovK. O.

111123, г. Москва

111123, Moscow

https://orcid.org/0000-0003-4918-4907ДрибноходоваО. П.DribnokhodovaO. P.

111123, г. Москва

111123, Moscow

https://orcid.org/0000-0003-3395-775XХарсекинаА. Е.HarsekinaA. E.

660036, г. Красноярск

660036, Krasnoyask

https://orcid.org/0000-0003-3780-3758ВасильевЕ. В.VasiylievE. V.

660022, г. Красноярск

660022, Krasnoyarsk

https://orcid.org/0000-0002-9196-7246ХоржевскийВ. А.KhorzhevskyiV. A.

660022, г. Красноярск

660022, Krasnoyarsk

https://orcid.org/0000-0003-2311-2219ОльховскийИ. А.OlkhovskiyI. A.

660036, г. Красноярск

660036, Krasnoyarsk

https://orcid.org/0000-0002-3668-6601ШипулинГ. А.ShipulinG. A.

111123, г. Москва

111123, Moscow

Красноярский филиал ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России; ФГАОУ ВО «Сибирский федеральный университет»РоссияKrasnoyarsk branch of the Federal State budgetary Institution «Hematology Research Center» Department of Health; Siberian Federal UniversityRussian FederationФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» РоспотребнадзораРоссияFederal Budget Institute of Science «Central research institute for Epidemiology»Russian FederationКрасноярский филиал ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава РоссииРоссияKrasnoyarsk branch of the Federal State budgetary Institution «Hematology Research Center» Department of HealthRussian FederationКГБУЗ Краевая клиническая больницаРоссияKrasnoyarsk regional hospitalRussian FederationКГБУЗ Красноярское краевое патолого-анатомическое бюроРоссияKrasnoyarsk State Regional Bureau of PathologyRussian FederationКрасноярский филиал ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России; ФГБУН «Красноярский научный центр» Сибирского отделения РАНРоссияKrasnoyarsk branch of the Federal State budgetary Institution «Hematology Research Center» Department of Health; Krasnoyask Scientific Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of SciencesRussian Federation201628022019614196200Copyright © Cубботина Т.Н., Дунаева Е.А., Миронов К.О., Дрибноходова О.П., Харсекина А.Е., Васильев Е.В., Хоржевский В.А., Ольховский И.А., Шипулин Г.А., 20192019Cубботина Т.Н., Дунаева Е.А., Миронов К.О., Дрибноходова О.П., Харсекина А.Е., Васильев Е.В., Хоржевский В.А., Ольховский И.А., Шипулин Г.А.Subbotina T.N., Dunaeva E.A., Mironov K.O., Dribnokhodova O.P., Harsekina A.E., Vasiyliev E.V., Khorzhevskyi V.A., Olkhovskiy I.A., Shipulin G.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.htjournal.ru/jour/article/view/34

Соматические мутации в кодонах 532–547 12-го экзона гена JAK2 высокоспецифичны для подтверждения диагноза истинной полицитемии. Цель настоящей работы – разработка методики для обнаружения и количественной оценки уровня аллельной нагрузки данных мутаций с использованием технологии пиросеквенирования. Определение нуклеотидной последовательности проводили на приборе PyroMark Q24. Для верификации наличия мутаций выполняли клонирование ДНК, выделенной из клинических образцов. Секвенирование клонов проводили с использованием реагентов и оборудования фирмы “Applied Biоsystems” (США). После подтверждения наличия мутации в клонах методом Сэнгера, образец, содержащий мутацию, повторно анализировали на приборе PyroMarkQ24 в количественном формате для определения уровня аллельной нагрузки. Среди 48 образцов ДНК от пациентов с высокой клинико-гематологической вероятностью диагноза истинной полицитемии и отсутствием мутации V617F в 14-м экзоне гена JAK2 был идентифицирован один образец, содержащий наиболее распространенную в области 12-го экзона данного гена соматическую мутацию N542-E543 del. Определение уровня аллельной нагрузки проводили трижды в динамике развития заболевания с августа 2013 г. по июнь 2015 г. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в ходе развития заболевания аллельная нагрузка у пациента возрастает и за 23 мес наблюдения этот показатель вырос более чем в 2 раза, что свидетельствует о соответствующем увеличении количества клеток трансформированного клона. В то же время до настоящего момента у пациента наблюдается клинико-гематологическая компенсация заболевания на фоне проведения умеренных терапевтических воздействий – эксфузионной и дезагрегационной терапии. Предложенная методика позволяет детектировать мутации в анализируемом фрагменте, а также проводить количественный мониторинг аллельной нагрузки в динамике заболевания с целью контроля эффективности используемой терапии.

Somatic mutations in codons 532--547 of JAK2 exon 12 are highly specific to confirm the diagnosis of polycythemia vera (PV). The aim of this study was to develop the pyrosequencing method for the detection and quantification of JAK2 exon 12 allele burden. The nucleotide sequencing of the JAK2 exon 12 fragment was carried out with the use of “PyroMark Q24”. To verify the presence of mutations, the DNA sequences extracted from the clinical samples were cloned and obtained clones were sequenced with the use of reagents and equipment of the “Applied Biosystems” (USA). A sample containing the mutation was analyzed again after confirming the presence of mutations in clones by Sanger sequencing with “PyroMark Q24” for the quantification of the JAK2 exon 12 allele burden. Among 48 of JAK2 V617F-negative PV patients, who had a high clinical and hematological probability of PV diagnosis, a N542-E543 del mutation of JAK2 in exon 12 has been detected in the 62-years old male patient. The detection and quantification of the JAK2 exon 12 allele burden by virtue of using a pyrosequencing method for this patient was carried out three times from August 2013 to June 2015. Our results show the JAK2 N542-E543 del allele burden to increase more than twice during 23 months of following up of the patient. These data suggest about increase of the number of the transformed clonal cells. The proposed method allows detecting and carrying out quantitative determination of the mutant JAK2 exon 12 allele burden for monitoring the efficacy of the therapy.

мутации в 12-м экзоне гена JAK2миелопролиферативные заболеванияистинная полицитемияпиросеквенированиеexon 12 JAK2 mutationsmyeloproliferative diseasepolycythemia verapyrosequencingReferencesTefferi A., Vardiman J.W. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2008 WHO criteria and point-ofcare diagnostic algorithms. Leukemia. 2008; 22(1): 14–22.Tefferi A., Vardiman J.W. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2008 WHO criteria and point-ofcare diagnostic algorithms. Leukemia. 2008; 22(1): 14–22.Baxter E.J., Scott L.M., Campbell P.J., East C., Fourouclas N., Swanton S., et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet. 2005; 365(9464): 1054–61.Baxter E.J., Scott L.M., Campbell P.J., East C., Fourouclas N., Swanton S., et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet. 2005; 365(9464): 1054–61.Catalog of somatic mutations in cancer. http://cancer.sanger.ac.uk/cosmicCatalog of somatic mutations in cancer. http://cancer.sanger.ac.uk/cosmicScott L.M. The JAK2 exon 12 mutations: a comprehensive review. Am. J. Hematol. 2011; 86(8): 668–76.Scott L.M. The JAK2 exon 12 mutations: a comprehensive review. Am. J. Hematol. 2011; 86(8): 668–76.Wu Z., Zhang X., Xu X., Chen Y., Hu T., Kang Z., et al. The mutation profile of JAK2 and CALR in Chinese Han patients with Philadelphia chromosome-negative myeloproliferative neoplasms. J. Hematol. Oncol. 2014; 7: 48. doi: 10.1186/s13045-014-0048-6.Wu Z., Zhang X., Xu X., Chen Y., Hu T., Kang Z., et al. The mutation profile of JAK2 and CALR in Chinese Han patients with Philadelphia chromosome-negative myeloproliferative neoplasms. J. Hematol. Oncol. 2014; 7: 48. doi: 10.1186/s13045-014-0048-6.Pardanani A., Lasho T.L., Finke C., Hanson C.A., Tefferi A. Prevalence and clinicopathologic correlates of JAK2 exon 12 mutations in JAK2V617F-negative polycythemia vera. Leukemia. 2007; 21(9): 1960–3.Pardanani A., Lasho T.L., Finke C., Hanson C.A., Tefferi A. Prevalence and clinicopathologic correlates of JAK2 exon 12 mutations in JAK2V617F-negative polycythemia vera. Leukemia. 2007; 21(9): 1960–3.Passamonti F., Elena C., Schnittger S., Skoda R.C., Green A.R., Girodon F., et al. Molecular and clinical features of the myeloproliferative neoplasm associated with JAK2 exon 12 mutations. Blood. 2011; 117(10): 2813–6.Passamonti F., Elena C., Schnittger S., Skoda R.C., Green A.R., Girodon F., et al. Molecular and clinical features of the myeloproliferative neoplasm associated with JAK2 exon 12 mutations. Blood. 2011; 117(10): 2813–6.Pietra D., Li S., Brisci A., Passamonti F., Rumi E., Theocharides A., et al. Somatic mutations of JAK2 exon 12 in patients with JAK2 (V617F)-negative myeloproliferative disorders. Blood. 2008; 111(3): 1686–9.Pietra D., Li S., Brisci A., Passamonti F., Rumi E., Theocharides A., et al. Somatic mutations of JAK2 exon 12 in patients with JAK2 (V617F)-negative myeloproliferative disorders. Blood. 2008; 111(3): 1686–9.Scott L.M., Tong W., Levine R.L., Scott M.A., Beer P.A., Stratton M.R., et al. Green AR. JAK2 exon 12 mutations in polycythemia vera and idiopathic erythrocytosis. N. Engl. J. Med. 2007; 356(5): 459–68.Scott L.M., Tong W., Levine R.L., Scott M.A., Beer P.A., Stratton M.R., et al. Green AR. JAK2 exon 12 mutations in polycythemia vera and idiopathic erythrocytosis. N. Engl. J. Med. 2007; 356(5): 459–68.Percy M.J., Scott L.M., Erber W.N., Harrison C.N., Reilly J.T., Jones F.G., et al. The frequency of JAK2 exon 12 mutations in idiopathic erythrocytosis patients with low serum erythropoietin levels. Haematologica. 2007; 92(12): 1607–14.Percy M.J., Scott L.M., Erber W.N., Harrison C.N., Reilly J.T., Jones F.G., et al. The frequency of JAK2 exon 12 mutations in idiopathic erythrocytosis patients with low serum erythropoietin levels. Haematologica. 2007; 92(12): 1607–14.Jones A.V., Cross N.C., White H.E., Green A.R., Scott L.M. Rapid identification of JAK2 exon 12 mutations using high resolution melting analysis. Haematologica. 2008; 93(10): 1560–4.Jones A.V., Cross N.C., White H.E., Green A.R., Scott L.M. Rapid identification of JAK2 exon 12 mutations using high resolution melting analysis. Haematologica. 2008; 93(10): 1560–4.Ugo V., Tondeur S., Menot M.L., Bonnin N., Le Gac G., Tonetti C., et al.; French Intergroup of Myeloproliferative disorders. Interlaboratory development and validation of a HRM method applied to the detection of JAK2 exon 12 mutations in polycythemia vera patients. PLoS One. 2010; 5(1): e8893.Ugo V., Tondeur S., Menot M.L., Bonnin N., Le Gac G., Tonetti C., et al.; French Intergroup of Myeloproliferative disorders. Interlaboratory development and validation of a HRM method applied to the detection of JAK2 exon 12 mutations in polycythemia vera patients. PLoS One. 2010; 5(1): e8893.Schnittger S., Bacher U., Haferlach C., Geer T., Müller P., Mittermüller J., et al. Detection of JAK2 exon 12 mutations in 15 patients with JAK2V617F negative polycythemia vera. Haematologica. 2009; 94(3): 414–8.Schnittger S., Bacher U., Haferlach C., Geer T., Müller P., Mittermüller J., et al. Detection of JAK2 exon 12 mutations in 15 patients with JAK2V617F negative polycythemia vera. Haematologica. 2009; 94(3): 414–8.Laughlin T.S., Moliterno A.R., Stein B.L., Rothberg P.G. Detection of exon 12 Mutations in the JAK2 gene: enhanced analytical sensitivity using clamped PCR and nucleotide sequencing. J. Mol. Diagn. 2010; 12(3): 278–82.Laughlin T.S., Moliterno A.R., Stein B.L., Rothberg P.G. Detection of exon 12 Mutations in the JAK2 gene: enhanced analytical sensitivity using clamped PCR and nucleotide sequencing. J. Mol. Diagn. 2010; 12(3): 278–82.Furtado L.V., Weigelin H.C., Elenitoba-Johnson K.S., Betz B.L. A multiplexed fragment analysis-based assay for detection of JAK2 exon 12 mutations. J. Mol. Diagn. 2013; 15(5): 592–9.Furtado L.V., Weigelin H.C., Elenitoba-Johnson K.S., Betz B.L. A multiplexed fragment analysis-based assay for detection of JAK2 exon 12 mutations. J. Mol. Diagn. 2013; 15(5): 592–9.Дунаева Е.А., Миронов К.О., Дрибноходова О.П., Субботина Т.Н., Башмакова Е.Е., Ольховский И.А., Шипулин Г.А. Количественное определение мутации V617F в гене JAK2 методом пиросеквенирования. Клиническая лабораторная диагностика. 2014; 11: 60–3.Dunaeva E.A., Mironov K.O., Dribnokhodova O.P., Subbotina T.N., Bashmakova E.E., Olkhovskiy I.A., Shipulin G.A. The quantitative testing of V617F mutation in gen JAK2 using pyrosequencing technique. Russian Clinical Laboratory Diagnostics Journal(Klinicheskaya laboratornaya diagnostika). 2014; 59(11): 60–3. (in Russian)Миронов К.О., Дунаева Е.А., Дрибноходова О.П., Шипулин Г.А. Детекция генетических полиморфизмов с использованием системы генетического анализа на основе пиросеквенирования PyroMark Q24. Справочник заведующего КДЛ. 2011; 4: 39–48.Mironov K.O., Dunaeva E.A., Dribnokhodova O.P., Shipulin G.A. Detection of genetic polymorphism with the use of Genetic analysis based on pyrosequencing PYROMARK Q24. Directory manager of clinical laboratory diagnostics. Russian Journal (Spravochnik zaveduyushchego KDL). 2011; 4: 39–48. (in Russian)Лилли Р. Патогистологичекая техника и практическая гистохимия. Пер с англ. М.: Мир; 1969.Lillie R.D. Histopathologic technic and practical histochemistry. New York: McGraw Hill Book Co; 1965.Kjær L., Westman M., Hasselbalch Riley C., Høgdall E., Weis Bjerrum O., Hasselbalch H. A highly sensitive quantitative real-time PCR assay for determination of mutant JAK2 exon 12 allele Burden. PLoS One. 2012; 7(3): 1–8.Kjær L., Westman M., Hasselbalch Riley C., Høgdall E., Weis Bjerrum O., Hasselbalch H. A highly sensitive quantitative real-time PCR assay for determination of mutant JAK2 exon 12 allele Burden. PLoS One. 2012; 7(3): 1–8.Theocharides A., Passweg J.R., Medinger M., Looser R., Li S., Hao-Shen H., et al. The allele burden of JAK2 mutations remains stable over several years in patients with myeloproliferative disorders. Haematologica. 2008; 93(12): 1890–3.Theocharides A., Passweg J.R., Medinger M., Looser R., Li S., Hao-Shen H., et al. The allele burden of JAK2 mutations remains stable over several years in patients with myeloproliferative disorders. Haematologica. 2008; 93(12): 1890–3.Li S., Kralovics R., De Libero G., Theocharides A., Gisslinger H., Skoda R.C. Clonal heterogeneity in polycythemia vera patients with JAK2 exon12 and JAK2-V617F mutations. Blood. 2008; 111(7): 3863–6.Li S., Kralovics R., De Libero G., Theocharides A., Gisslinger H., Skoda R.C. Clonal heterogeneity in polycythemia vera patients with JAK2 exon12 and JAK2-V617F mutations. Blood. 2008; 111(7): 3863–6.Tsiatis A.C., Norris-Kirby A., Rich R.G., Hafez M.J., Gocke C.D., Eshleman J.R., et al. Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications. J. Mol. Diagn. 2010; 12(4): 425–32.Tsiatis A.C., Norris-Kirby A., Rich R.G., Hafez M.J., Gocke C.D., Eshleman J.R., et al. Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications. J. Mol. Diagn. 2010; 12(4): 425–32.Дрибноходова О.П., Миронов К.О., Дунаева Е.А., Демидова И.А., Баринов А.А., Войцеховская Я.А. и др. Выявление активирующих соматических мутаций в гене KRAS методом пиросеквенирования. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 6: 49–51.Dribnokhodova O.P., Mironov K.O., Dunaeva E.A., Demidova I.A., Barinov A.A., Voytsekhovskaya Ya.A., et al. The detection of activating somatic mutations in gene kras using pyrosequencing technique. Russian Clinical Laboratory Diagnostics Journal (Klinicheskaya laboratornaya diagnostika). 2013; 58(6): 49–51. (in Russian)Xie G., Xie F., Wu P., Yuan X., Ma Y., Xu Y., et al. The mutation rates of EGFR in non-small cell lung cancer and KRAS in colorectal cancer of Chinese patients as detected by pyrosequencing using a novel dispensation order. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2015; 34(1): 63. doi: 10.1186/s13046-015-0179-9.Xie G., Xie F., Wu P., Yuan X., Ma Y., Xu Y., et al. The mutation rates of EGFR in non-small cell lung cancer and KRAS in colorectal cancer of Chinese patients as detected by pyrosequencing using a novel dispensation order. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2015; 34(1): 63. doi: 10.1186/s13046-015-0179-9.MilburyС.A., Li J., Makrigiorgos G.M. Ice-COLD-PCR enables rapid amplification and robust enrichment for low-abundance unknown DNA mutations. Nucleic Acids Res. 2011; 39(1): e2. doi: 10.1093/nar/gkq899/MilburyС.A., Li J., Makrigiorgos G.M. Ice-COLD-PCR enables rapid amplification and robust enrichment for low-abundance unknown DNA mutations. Nucleic Acids Res. 2011; 39(1): e2. doi: 10.1093/nar/gkq899/

The authors declare that there are no conflicts of interest present.