bloodjourГематология и трансфузиологияRussian journal of hematology and transfusiology0234-57302411-3042ООО Издательский дом «Практика»10.35754/0234-5730-2022-67-2-172-180bloodjour-360Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESМолекулярно-генетическая верификация болезни Виллебранда тип 2NMolecular and genetic verification of von Willebrand disease type 2Nhttps://orcid.org/0000-0003-2479-2623ЧернецкаяД. М.ChernetskayaD. M.

Чернецкая Дарья Михайловна, научный сотрудник лаборатории генной инженерии

125167, Москва

Daria M. Chernetskaya, Researcher, Laboratory of Genetic Engineering

125167, Moscow

gnomicha@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1890-4492СуринВ. Л.SurinV. L.

Сурин Вадим Леонидович, старший научный сотрудник лаборатории генной инженерии

125167, Москва

Vadim L. Surin, Senior Researcher, Laboratory of Genetic Engineering

125167, Moscow

vadsurin@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-5669-3948СаломашкинаВ. В.SalomashkinaV. V.

Саломашкина Валентина Валерьевна, ведущий специалист лаборатории генной инженерии

125167, Москва

Valentina V. Salomashkina, Researcher, Laboratory of Genetic Engineering

125167, Moscow

prodoljenie-banketa@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5752-8146ПшеничниковаО. С.PshenichnikovaO. S.

Пшеничникова Олеся Сергеевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории генной инженерии

125167, Москва

Olesya S. Pshenichnikova, Cand. Sci. (Biol.), Senior Researcher, Laboratory of Genetic Engineering

125167, Moscow

pshenichnikovaolesya@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-6991-7437ЯковлеваЕ. В.YakovlevaE. V.

Яковлева Елена Владимировна, кандидат медицинских наук, гематолог отдела коагулопатий

125167, Москва

Elena V. Yakovleva, Cand. Sci. (Med.), Hematologist, Department of Coagulopathies

125167, Moscow

hemophilia2012@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7074-0926ЗозуляН. И.ZozulyaN. I.

Зозуля Надежда Ивановна, доктор медицинских наук, заведующая научно-консультативным отделом коагулопатий

125167, Москва

Nadezhda I. Zozulya, Dr. Sci. (Med.), Hematologist, Head of the Department of Coagulopathy

125167, Moscow

zozulya.n@blood.ruhttps://orcid.org/0000-0001-9463-9187СудариковА. Б.SudarikovA. B.

Судариков Андрей Борисович, доктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной гематологии

125167, Москва

Andrey B. Sudarikov, Dr. Sci. (Biol.), Head of the Laboratory of Molecular Hematology

125167, Moscow

dusha@blood.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6098-5735ЛихачеваЕ. А.LikhachevaE. A.

Лихачева Елена Аркадьевна, кандидат медицинских наук, врач-гематолог отдела коагулопатий

125167, Москва

Elena A. Likhacheva, Cand. Sci. (Med.), Hematologist, Department of Coagulopathies

125167, Moscow

likhachyova.elena@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-8701-2754ШабановаЕ. С.ShabanovaE. S.

Шабанова Елена Сергеевна, генетик, ассистент кафедры медицинской генетики

191015, Санкт-Петербург

Elena S. Shabanova, Geneticist, Assistant of Department of Medical Genetics

191015, Saint-Petersburg

le_shaja@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3531-1664ПеринаФ. Г.PerinaF. G.

Перина Фарида Галимовна, гематолог, Центр детской онкологии и гематологии

620149, Екатеринбург

Farida G. Perina, Hematologist, Sverdlovsk Regional Children’s Clinical Hospital

620148, Ekaterinburg

perinafg@mail.ruФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияNational Medical Research Center for HematologyRussian FederationФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияNorth-Western State Medical University named after I.I. MechnikovRussian FederationГАУЗ Свердловской области «Областная детская клиническая больница»РоссияSverdlovsk Regional Children’s Clinical HospitalRussian Federation202206072022672172180Copyright © Чернецкая Д.М., Сурин В.Л., Саломашкина В.В., Пшеничникова О.С., Яковлева Е.В., Зозуля Н.И., Судариков А.Б., Лихачева Е.А., Шабанова Е.С., Перина Ф.Г., 20222022Чернецкая Д.М., Сурин В.Л., Саломашкина В.В., Пшеничникова О.С., Яковлева Е.В., Зозуля Н.И., Судариков А.Б., Лихачева Е.А., Шабанова Е.С., Перина Ф.Г.Chernetskaya D.M., Surin V.L., Salomashkina V.V., Pshenichnikova O.S., Yakovleva E.V., Zozulya N.I., Sudarikov A.B., Likhacheva E.A., Shabanova E.S., Perina F.G.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.htjournal.ru/jour/article/view/360Введение

Введение. Болезнь Виллебранда (БВ) вызывается различными вариантами нарушения функции фактора фон Виллебранда (vWF), определяемыми патологическими изменениями в кодирующем его гене vWF. Особый интерес представляет тип 2N, характеризующийся близким к нормальному значением антигена vWF (vWF:Ag) при утрате им способности связываться с фактором VIII (FVIII) и отсутствием защиты последнего от протеолиза. За счет этого коагуляционная активность FVIII может быть низкой, что приводит к сходным фенотипическим проявлениям у больных с типом 2N БВ и гемофилией А.

Цель — выявление больных с типом 2N БВ на основании молекулярно-генетических методов.

Материалы и методы

Материалы и методы. Использованы данные из историй болезни больных БВ. Учитывали соотношение FVIII:C и vWF:AG, которое при 2N типе БВ должно быть меньше 0,7. Поиск патогенных вариаций проводили секвенированием экзонов и прилежащих к ним интронных областей гена vWF по методу Сэнгера. Поскольку наследование 2N типа БВ рецессивное, для диагноза требовалось найти два патогенных варианта.

Результаты

Результаты. По данным исследования параметров гемостаза (FVIII:C/vWF:Ag < 0,7) были отобраны 3 больных, у которых предполагался диагноз «2N тип БВ». Проведен анализ показателей больного, у которого предполагался диагноз «гемофилия А», который, однако, не подтвердился при секвенировании гена F8. Во всех перечисленных случаях определение первичной структуры функционально значимых областей гена vWF позволило верифицировать диагноз БВ тип 2N. Одна больная (№ 4) была гомозиготна по патогенному варианту p.Arg854Gln (c.2561 G>A). У больной № 3 была найдена гетерозиготная замена p.Arg816Trp (c.2446 C>T), соответствующая типу 2N, и ранее не описанная инсерция c.2098_2099insG, вызывающая сдвиг рамки считывания. У больной № 1, выявленной по параметру (FVIII:C/vWF:Ag < 0,7), и у больного № 2 с изначальным диагнозом «гемофилия А» было выявлено сочетание делеции c.2435delC и замены p.Thr791Met (c.2372 C>T) в гетерозиготном состоянии. Генные варианты p.Thr791Met и p.Arg854Gln ассоциированы с типом 2N, а делеция c.2435delC приводит к дисфункциональности аллеля.

Заключение

Заключение. Молекулярные методы позволили диагностировать 2N тип БВ, дифференцируя его и от других типов БВ, и от гемофилии А.

Introduction

Introduction. Von Willebrand disease (vWD) is caused by von Willebrand factor (vWF) dysfunction resulting from pathogenic variants in the vWF gene coding the vWF protein. vWD type 2N is of particular interest, as it is characterized by almost normal vWF antigen level (Ag:vWF) and vWF loss of ability to bind FVIII and protect it from premature clearance, which leads to a low FVIII coagulation activity (FVIII:C). Therefore, the same phenotype occurs in patients with 2N type of vWD and hemophilia A.

Aim — to identify patients with 2N type vWD using molecular genetic methods.

Methods

Methods. Data from the medical histories of vWD patients were used. The major parameter in consideration was FVIII:C to vWF:Ag ratio, which is expected to be below 0.7 in type 2N of vWD. Pathogenic variants in exons and exon-intron junctions of the vWF gene were identified by Sanger sequencing. Due to recessive inheritance of type 2N, verification of the 2N vWD diagnosis required the identification of two pathogenic variants.

Results

Results. Three patients were considered as suffering from type 2N of vWD according to hemostasis parameters (FVIII:C/vWF:Ag < 0.7). One patient with a preliminary hemophilia A diagnosis was included after sequencing of the F8 gene, which showed no alterations, so 2N type of vWD was suspected. In all cases, sequencing of the relevant functional regions of the vWF gene led to verification of vWD type 2N. One woman (patient # 4) had a homozygous pathogenic variant p.Arg854Gln (c.2561 G>A) associated with type 2N vWD. One woman (patient # 3) was a compound heterozygote for the pathogenic variant p.Arg816Trp (c.2446 C>T) associated with type 2N and a newly described insertion c.2098_2099insG, that leads to a frameshift. The woman with FVIII:C/vWF:Ag < 0.7 (patient # 1) and the patient # 2 with preliminary hemophilia А diagnosis were both compound heterozygotes for the same combination of pathogenic variants — c.2435delC and p.Thr791Met (c.2372 C>T). Pathogenic variant p.Thr791Met is associated with type 2N, while the deletion c.2435delC should lead to allele disabling.

Conclusion

Conclusion. Molecular methods allow more precise differentiation of type 2N from other types of vWD and hemophilia A.

2N тип болезни Виллебрандаген vWFфактор фон Виллебрандагемофилия Амолекулярно-генетические методыкровотечениеvon Willebrand disease type 2NvWF genevon Willebrand factorhemophilia Amolecular methodsbleedingработа выполнена в рамках государственных заданий РК № АААА-А18-118032290163-2 и РК № АААА-А21-121011290080-1.the study was carried out within the framework of the state tasks РК № АААА-А18-118032290163-2 and РК № АААА-А21-121011290080-1.ReferencesBerntorp E. Erik von Willebrand. Thromb Res. 2007; 120(1): S3–4. DOI: 10.1016/j.thromres.2007.03.010.Berntorp E. Erik von Willebrand. Thromb Res. 2007; 120(1): S3–4. DOI: 10.1016/j.thromres.2007.03.010.Leebeek F.W.G., Eikenboom J.C.J. Von Willebrand’s disease. N Engl J Med. 2016; 375(21): 2067–80. DOI: 10.1056/NEJMra1601561.Leebeek F.W.G., Eikenboom J.C.J. Von Willebrand’s disease. N Engl J Med. 2016; 375(21): 2067–80. DOI: 10.1056/NEJMra1601561.Goodeve A.C. The genetic bases of von Willebrand disease. Blood Rev. 2010; 24(3): 123–34. DOI: 10.1016/j.blre.2010.03.003.Goodeve A.C. The genetic bases of von Willebrand disease. Blood Rev. 2010; 24(3): 123–34. DOI: 10.1016/j.blre.2010.03.003.Sadler J.E. A revised classification of von Willebrand disease. for the Subcommittee on von Willebrand Factor of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost. 1994; 71(4): 520–5.Sadler J.E. A revised classification of von Willebrand disease. for the Subcommittee on von Willebrand Factor of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost. 1994; 71(4): 520–5.Seidizadeh O., Peyvandi F., Mannucci P.M. Von Willebrand disease type 2N: An update. Thromb Haemost. 2021; 19(4): 909–916. DOI: 10.1111/jth.15247.Seidizadeh O., Peyvandi F., Mannucci P.M. Von Willebrand disease type 2N: An update. Thromb Haemost. 2021; 19(4): 909–916. DOI: 10.1111/jth.15247.Veyradier A., Caron C., Ternisien C., et al. Validation of the first commercial ELISA for type 2N von Willebrand’s disease diagnosis. Haemophilia. 2011; 17(6): 944–51. DOI: 10.1111/j.1365-2516.2011.02499.x.Veyradier A., Caron C., Ternisien C., et al. Validation of the first commercial ELISA for type 2N von Willebrand’s disease diagnosis. Haemophilia. 2011; 17(6): 944–51. DOI: 10.1111/j.1365-2516.2011.02499.x.Federici A.B., Mazurier C., Berntorp E., et al. Biologic response to desmopressin in patients with severe type 1 and type 2 von Willebrand disease: Results of a multicenter European study. Blood. 2004; 103(6): 2032–8. DOI: 10.1182/blood-2003-06-2072.Federici A.B., Mazurier C., Berntorp E., et al. Biologic response to desmopressin in patients with severe type 1 and type 2 von Willebrand disease: Results of a multicenter European study. Blood. 2004; 103(6): 2032–8. DOI: 10.1182/blood-2003-06-2072.Mazurier C., Goudemand J., Hilbert L., et al. Type 2N von Willebrand disease: Clinical manifestations, pathophysiology, laboratory diagnosis and molecular biology. Best Pract Res Clin Haematol. 2001; 14(2): 337–47. DOI: 10.1053/beha.2001.0138.Mazurier C., Goudemand J., Hilbert L., et al. Type 2N von Willebrand disease: Clinical manifestations, pathophysiology, laboratory diagnosis and molecular biology. Best Pract Res Clin Haematol. 2001; 14(2): 337–47. DOI: 10.1053/beha.2001.0138.Абрамова А.В., Абдуллаев А.О., Азимова М.Х. и др. Алгоритмы диагностики и протоколы лечения заболеваний систем крови. Т. 1. Под ред. В.Г. Савченко. М.: Практика; 2018; 359–75.Abramova A.V., Abdullaev A.O., Azimova M.Kh., et al. Diagnostic algorithms and curing protocols of blood system diseases. Vol. 1. Ed. Savchenko V.G. Moscow: Praktika; 2018: 359–75. (In Russsian).Лихачева Е.А., Полянская Т.Ю., Зоренко В.Ю. и др. Клинические рекомендации по диагностике и лечению болезни Виллебранда. М.: Национальное гематологическое общество; 2014.Likhacheva E.A., Polyanskaya T.Yu., Zorenko V.Yu., et al. Clinical recommendations for von Willebrand disease diagnosis and treatment. Ed. Savchenko V.G. Moscow: National Hematological Society; 2014. (In Russian).Mancuso D.J., Turley E.A., Westfield L.A., et al. Structure of the gene for human von Willebrand factor. J Biol Chem. 1989; 264(33): 19514–27. DOI: 10.1016/S0021-9258(19)47144-5.Mancuso D.J., Turley E.A., Westfield L.A., et al. Structure of the gene for human von Willebrand factor. J Biol Chem. 1989; 264(33): 19514–27. DOI: 10.1016/S0021-9258(19)47144-5.Mancuso D.J., Tuley E.A., Westfield L.A., et al. Human von Willebrand factor gene and pseudogene: Structural analysis and differentiation by polymerase chain reaction. Biochemistry. 1991; 30(1): 253–69. DOI: 10.1021/bi00215a036.Mancuso D.J., Tuley E.A., Westfield L.A., et al. Human von Willebrand factor gene and pseudogene: Structural analysis and differentiation by polymerase chain reaction. Biochemistry. 1991; 30(1): 253–69. DOI: 10.1021/bi00215a036.Goodeve A. Diagnosing von Willebrand disease: Genetic analysis. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2016; 2016(1): 678–82. DOI: 10.1182/asheducation-2016.1.678.Goodeve A. Diagnosing von Willebrand disease: Genetic analysis. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2016; 2016(1): 678–82. DOI: 10.1182/asheducation-2016.1.678.Shiltagh N., Kirkpatrick J., Cabrita L.D., et al. Solution structure of the major factor VIII binding region on von Willebrand factor. Blood. 2014; 123(26): 4143–51. DOI: 10.1182/blood-2013-07-517086.Shiltagh N., Kirkpatrick J., Cabrita L.D., et al. Solution structure of the major factor VIII binding region on von Willebrand factor. Blood. 2014; 123(26): 4143–51. DOI: 10.1182/blood-2013-07-517086.Zhou Y.F., Eng E.T., Zhu J., et al. Sequence and structure relationships within von Willebrand factor. Blood. 2012; 120(2): 449–58. DOI: 10.1182/blood-2012-01-405134.Zhou Y.F., Eng E.T., Zhu J., et al. Sequence and structure relationships within von Willebrand factor. Blood. 2012; 120(2): 449–58. DOI: 10.1182/blood-2012-01-405134.Чернецкая Д.М., Лихачева Е.А., Пшеничникова О.С. и др. Болезнь Виллебранда: сопоставление клинических, коагулологических и молекулярно-генетических данных. Гематология и трансфузиология. 2019; 64(3): 246–55. DOI: 10.35754/0234-5730-2019-64-3-246-255.Chernetskaya D.M., Likhacheva E.A., Pshenichnikova O.S., et al. Von Willebrand disease: Clinical, coagulogical, molecular and genetic data comparison. Gematologiya i Transfusiologiya. 2019; 64(3): 246–55. DOI: 10.35754/0234-5730-2019-64-3-246-255. (In Russian).Richards S., Aziz N., Bale S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: A joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015; 17(5): 405–23. DOI: 10.1038/gim.2015.30.Richards S., Aziz N., Bale S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: A joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015; 17(5): 405–23. DOI: 10.1038/gim.2015.30.Zhang Z.P., Falk G., Blombäck M., et al. A single cytosine deletion is exon 18 of the von Willebrand factor gene is the most common mutation in Swedish vWD type III patients. Hum Mol Genet. 1992; 1(9): 767–8. DOI: 10.1093/hmg/1.9.767Zhang Z.P., Falk G., Blombäck M., et al. A single cytosine deletion is exon 18 of the von Willebrand factor gene is the most common mutation in Swedish vWD type III patients. Hum Mol Genet. 1992; 1(9): 767–8. DOI: 10.1093/hmg/1.9.767Gaucher C., Jorieux S., Mercier B., Mazurier C. The “Normandy” variant of von Willebrand disease: Characterization of a point mutation in the von Willebrand factor gene. Blood. 1991; 77(9): 1937–41.Gaucher C., Jorieux S., Mercier B., Mazurier C. The “Normandy” variant of von Willebrand disease: Characterization of a point mutation in the von Willebrand factor gene. Blood. 1991; 77(9): 1937–41.Mazurier C. Gaucher C., Jorieux S., et al. Evidence for a von Willebrand factor defect in factor VIII binding in three members of a family previously misdiagnosed mild haemophilia A and haemophilia A carriers: Consequences for therapy and genetic counselling. Br J Haematol. 1990; 76(3): 372–9. DOI: 10.1111/j.1365-2141.1990.tb06371.x.Mazurier C. Gaucher C., Jorieux S., et al. Evidence for a von Willebrand factor defect in factor VIII binding in three members of a family previously misdiagnosed mild haemophilia A and haemophilia A carriers: Consequences for therapy and genetic counselling. Br J Haematol. 1990; 76(3): 372–9. DOI: 10.1111/j.1365-2141.1990.tb06371.x.Montgomery R.R., Hathaway W.E., Johnson J., et al. A variant of von Willebrand’s disease with abnormal expression of factor VIII procoagulant activity. Blood. 1982; 60(1): 201–7.Montgomery R.R., Hathaway W.E., Johnson J., et al. A variant of von Willebrand’s disease with abnormal expression of factor VIII procoagulant activity. Blood. 1982; 60(1): 201–7.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.