bloodjourГематология и трансфузиологияRussian journal of hematology and transfusiology0234-57302411-3042ООО Издательский дом «Практика»10.35754/0234-5730-2025-70-2-156-164bloodjour-632Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESСравнение функционального и иммунофенотипического профиля анти-CD19 модифицированных Т-клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор, полученных от здоровых доноров и больных B-клеточным острым лимфобластным лейкозом, при длительной рестимуляции in vitroComparison of the functional and immunophenotypical profi le of anti-CD19 CAR T-cells derived from healthy donors and patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia during prolonged restimulation in vitrohttps://orcid.org/0000-0002-1669-5244НенашеваТ. А.NenashevaT. A.

Ненашева Татьяна Анатольевна - старший научный сотрудник лаборатории трансляционной иммунологии.

125167, Москва

Tatiana A. Nenasheva - Senior researcher, Laboratory of Translational Immunology.

125167, Moscow

dreminat@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3296-503XФефеловаЕ. И.FefelovaE. I.

Фефелова Екатерина Игоревна - стажер-исследователь лаборатории трансплантационной иммунологии.

125167, Москва

Ekaterina I. Fefelova - Assistant researcher, Laboratory of Transplantation Immunology.

125167, Moscow

eifefelova27@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-1573-7614СердюкЯ. В.SerdyukY. V.

Сердюк Яна Викторовна - научный сотрудник лаборатории трансляционной иммунологии.

125167, Москва

Yana V. Serdyuk - Researcher, Laboratory of Translational Immunology.

125167, Moscow

serdyuk.ya.v@gmail.comhttps://orcid.org/0009-0005-1842-4498СальманР.SalmanR.

Салман Рэнд - лаборант лаборатории трансляционной иммунологии.

125167, Москва

Rand Salman - Laboratory assistant, Laboratory of Translational Immunology.

125167, Moscow

randsalman1@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-4725-6391ИвановаН. О.IvanovaN. O.

Иванова Наталия Олеговна - молекулярный биолог лаборатории трансляционной иммунологии.

125167, Москва

Natalia O. Ivanova - Molecular biologist, Laboratory of Translational Immunology.

125167, Moscow

ivanova.n@blood.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9969-8482АлешинаО. А.AleshinaO. A.

Алешина Ольга Александровна - кандидат медицинских наук, заведующая отделом клеточной и иммунной терапии, врач-гематолог.

125167, Москва

Olga A. Aleshina - Cand Sci (Med), Head of the Laboratory of Cellular and Immune Therapy, hematologist, Department of Hematology and Chemotherapy of Acute Leukemia and Lymphomas.

125167, Moscow

dr.gavrilina@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-8664-6341БоголюбоваА. В.BogolyubovaA. V.

Боголюбова Аполлинария Васильевна - кандидат биологических наук, заведующая лабораторией трансляционной иммунологии.

125167, Москва

Apollinariya V. Bogolyubova - Cand. Sci. (Biol.), Head of the Laboratory of Translational Immunology.

125167, Moscow

apollinariya.bogolyubova@gmail.comФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияNational Medical Research Center for HematologyRussian Federation202510072025702156164Copyright © Ненашева Т.А., Фефелова Е.И., Сердюк Я.В., Сальман Р., Иванова Н.О., Алешина О.А., Боголюбова А.В., 20252025Ненашева Т.А., Фефелова Е.И., Сердюк Я.В., Сальман Р., Иванова Н.О., Алешина О.А., Боголюбова А.В.Nenasheva T.A., Fefelova E.I., Serdyuk Y.V., Salman R., Ivanova N.O., Aleshina O.A., Bogolyubova A.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.htjournal.ru/jour/article/view/632Введение

Введение. Важной характеристикой терапии модифицированными Т-клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (chimeric antigen receptor, CAR), является продолжительность персистенции CAR T-клеток в организме больного. Длительная рестимуляция CAR T-клеточного продукта in vitro с последующим анализом его субпопуляционного состава и цитотоксической активности является одним из способов моделирования поведения клеток в организме больных.

Цель

Цель: изучить иммунофенотип, показатели истощения и функциональные характеристики анти-CD19 CAR T-клеточных продуктов, полученных из клеток здоровых доноров и больных В-клеточным острым лимфобластным лейкозом (В-ОЛЛ), в условиях длительной рестимуляции in vitro.

Материалы и методы

Материалы и методы. Анти-CD19 CAR T-клеточный продукт получили из клеток 5 здоровых доноров и 3 больных B-ОЛЛ. Проведено изучение иммунофенотипа полученных клеточных продуктов в условиях повторяющейся антигенной рестимуляции in vitro с использованием таргетной клеточной линии NALM6, несущей антиген CD19, в течение 7–10 дней. В каждой точке эксперимента были оценены пролиферативная и цитотоксическая активность, экспрессия маркеров истощения и динамика изменения субпопуляционного состава CAR-Т-клеток памяти (иммунофенотип).

Результаты

Результаты. Анти-CD19 CAR T-лимфоциты обладали выраженной цитотоксической активностью вне зависимости от источника лимфоцитов (здоровые доноры/больные). В процессе длительной антигенной рестимуляции всех клеточных продуктов наблюдалось уменьшение доли наивных (TN) и эффекторных (TE) CAR T-клеток и увеличение доли клеток центральной (ТСМ) и эффекторной памяти (ТЕМ). CAR T-клетки демонстрировали повышение экспрессии маркеров истощения (PD1, TIM3) вне зависимости от происхождения клеток и соотношения эффектор : таргет.

Заключение

Заключение. Анализ цитотоксической активности и иммунофенотипического состава CAR T-клеточных продуктов в условиях длительной рестимуляции выявил тенденцию к снижению цитотоксической активности и отличия в динамике пролиферации и популяционного состава между клеточными продуктами, полученными от больных В-ОЛЛ и здоровых доноров.

Introduction

Introduction. An important characteristic of therapy with modified T-cells expressing the chimeric antigen receptor (CAR) is the duration of CAR T-cell persistence in the patient’s body. Prolonged re-stimulation of CAR T-cell product in vitro with further analysis of its subpopulation composition and cytotoxic activity is one of the approaches to model cell behavior in patients.

Aim

Aim: to study the immunophenotype, exhaustion and functional characteristics of anti-CD19 CAR T-cell products derived from healthy donors and patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) at prolonged re-stimulation conditions in vitro.

Materials and methods

Materials and methods. Anti-CD19 CAR T-cell products were generated from 5 healthy donors and 3 patients with B-ALL. The immunophenotype of the obtained cell products was studied under conditions of repeated antigenic re-stimulation in vitro using the target cell line NALM6 carrying the CD19 antigen over 7-10 days. At each experimental timepoint, the following parameters were assessed: proliferative and cytotoxic activity, expression of exhaustion markers, and changes in the subpopulation composition of CAR T-memory cells (immunophenotype).

Results

Results. Anti-CD19 CAR T-cells had significant cytotoxic activity regardless of the lymphocyte source (healthy donors/patients). During prolonged antigenic re-stimulation of all products, a decrease in the proportion of naive (TN) and effector (TE) CAR T-cells, and an increase in the proportion of central (TCM) and effector memory (TEM) cells was observed. CAR T-cells showed increased expression of exhaustion markers (PD1, TIM3) irrespective of the origin of the cell and E:T ratio.

Conclusion

Conclusion. Analysis of cytotoxic activity and immunophenotypic composition of CAR T-cell products under conditions of prolonged re-stimulation revealed a trend toward decreased cytotoxicity, as well as differences in proliferation dynamics and population composition between cell products obtained from B-ALL patients and healthy donors.

анти-CD19 CAR TCAR T-клеточная терапияиммунофенотипистощениецитотоксичностьanti-CD19 CAR TCAR T-cell therapyimmunophenotypeexhaustioncytotoxicityработа выполнена в соответствии с государственным заданием «Разработка анти-BCMA CAR T-клеточного лекарственного препарата для нужд онкогематологии» РК № 125030703310–3 на выполнение научных исследований ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава Россииthe study was performed in accordance with the State Assignment “Development of anti-BCMA CAR T-cell drug for the needs of oncohematology” RK № 125030703310-3 for the performance of scientifi c research of the National Medical Research Center for HematologyReferencesMaude S.L., Frey N., Shaw P.A., et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells for Sustained Remissions in Leukemia. N Engl J Med. 2014;371(16):1507–17. DOI: 10.1056/NEJMoa1407222.Maude S.L., Frey N., Shaw P.A., et al. Chimeric Antigen Receptor T Cells for Sustained Remissions in Leukemia. N Engl J Med. 2014;371(16):1507–17. DOI: 10.1056/NEJMoa1407222.Xu X., Sun Q., Liang X., et al. Mechanisms of Relapse After CD19 CAR T-Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia and Its Prevention and Treatment Strategies. Front Immunol. 2019;10:2664. DOI: 10.3389/fimmu.2019.02664.Xu X., Sun Q., Liang X., et al. Mechanisms of Relapse After CD19 CAR T-Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia and Its Prevention and Treatment Strategies. Front Immunol. 2019;10:2664. DOI: 10.3389/fimmu.2019.02664.Garfall A.L., Dancy E.K., Cohen A.D., et al. T-cell phenotypes associated with effective CAR T-cell therapy in postinduction vs relapsed multiple myeloma. Blood Adv. 2019;3(19):2812–5. DOI: 10.1182/bloodadvances.2019000600.Garfall A.L., Dancy E.K., Cohen A.D., et al. T-cell phenotypes associated with effective CAR T-cell therapy in postinduction vs relapsed multiple myeloma. Blood Adv. 2019;3(19):2812–5. DOI: 10.1182/bloodadvances.2019000600.Si X., Xiao L., Brown C.E., et al. Preclinical Evaluation of CAR T Cell Function: In Vitro and In Vivo Models. Int J Mol Sci. 2022;23(6):3154. DOI: 10.3390/ijms23063154.Si X., Xiao L., Brown C.E., et al. Preclinical Evaluation of CAR T Cell Function: In Vitro and In Vivo Models. Int J Mol Sci. 2022;23(6):3154. DOI: 10.3390/ijms23063154.García-Calderón C.B., Sierro-Martínez B., García-Guerrero E., et al. Monitoring of kinetics and exhaustion markers of circulating CAR T cells as early predictive factors in patients with B-cell malignancies. Front Immunol. 2023;1–14. DOI: 10.3389/fimmu.2023.1152498.García-Calderón C.B., Sierro-Martínez B., García-Guerrero E., et al. Monitoring of kinetics and exhaustion markers of circulating CAR T cells as early predictive factors in patients with B-cell malignancies. Front Immunol. 2023;1–14. DOI: 10.3389/fimmu.2023.1152498.Haradhvala N.J., Leick M.B., Maurer K., et al. Distinct cellular dynamics associated with response to CAR T therapy for refractory B cell lymphoma. Nat Med. 2022;28(9):1848–59. DOI: 10.1038/s41591-022-01959-0.Haradhvala N.J., Leick M.B., Maurer K., et al. Distinct cellular dynamics associated with response to CAR T therapy for refractory B cell lymphoma. Nat Med. 2022;28(9):1848–59. DOI: 10.1038/s41591-022-01959-0.Deng Q., Han G., Puebla-Osorio N., et al. Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas. Nat Med. 2020;26(12):1878–87. DOI: 10.1038/s41591-020-1061-7.Deng Q., Han G., Puebla-Osorio N., et al. Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas. Nat Med. 2020;26(12):1878–87. DOI: 10.1038/s41591-020-1061-7.Schober K., Voit F., Grassmann S., et al. Reverse TCR repertoire evolution toward dominant low-affinity clones during chronic CMV infection. Nat Immunol. 2020;21(4):434–41. DOI: 10.1038/s41590-020-0628-2.Schober K., Voit F., Grassmann S., et al. Reverse TCR repertoire evolution toward dominant low-affinity clones during chronic CMV infection. Nat Immunol. 2020;21(4):434–41. DOI: 10.1038/s41590-020-0628-2.Graham C.E., Jozwik A., Quartey-Papafio R., et al. Gene-edited healthy donor CAR T cells show superior anti-tumour activity compared to CAR T cells derived from patients with lymphoma in an in vivo model of high-grade lymphoma. Leukemia. 2021;35(12):3581–4. DOI: 10.1038/s41375-021-01324-z.Graham C.E., Jozwik A., Quartey-Papafio R., et al. Gene-edited healthy donor CAR T cells show superior anti-tumour activity compared to CAR T cells derived from patients with lymphoma in an in vivo model of high-grade lymphoma. Leukemia. 2021;35(12):3581–4. DOI: 10.1038/s41375-021-01324-z.Fraietta J.A., Lacey S.F., Orlando E.J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nat Med. 2018;24(5):563–71. DOI: 10.1038/s41591-0180010-1.Fraietta J.A., Lacey S.F., Orlando E.J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nat Med. 2018;24(5):563–71. DOI: 10.1038/s41591-0180010-1.Das R.K., Vernau L., Grupp S.A., et al. Naïve T-cell Deficits at Diagnosis and after Chemotherapy Impair Cell Therapy Potential in Pediatric Cancers. Cancer Discov. 2019;9(4):492–9. DOI: 10.1158/2159-8290.CD-18-1314.Das R.K., Vernau L., Grupp S.A., et al. Naïve T-cell Deficits at Diagnosis and after Chemotherapy Impair Cell Therapy Potential in Pediatric Cancers. Cancer Discov. 2019;9(4):492–9. DOI: 10.1158/2159-8290.CD-18-1314.Zhang D.K.Y., Adu-Berchie K., Iyer S., et al. Enhancing CAR T cell functionality in a patient-specific manner. Nat Commun. 2023;14(1):506. DOI: 10.1038/s41467-023-36126-7.Zhang D.K.Y., Adu-Berchie K., Iyer S., et al. Enhancing CAR T cell functionality in a patient-specific manner. Nat Commun. 2023;14(1):506. DOI: 10.1038/s41467-023-36126-7.Arcangeli S., Falcone L., Camisa B., et al. Next-Generation Manufacturing Protocols Enriching TSCM CAR T Cells Can Overcome Disease-Specific T Cell Defects in Cancer Patients. Front Immunol. 2020;1–11. DOI: 10.3389/fimmu.2020.01217.Arcangeli S., Falcone L., Camisa B., et al. Next-Generation Manufacturing Protocols Enriching TSCM CAR T Cells Can Overcome Disease-Specific T Cell Defects in Cancer Patients. Front Immunol. 2020;1–11. DOI: 10.3389/fimmu.2020.01217.Ren H., Cao K., Wang M. A Correlation Between Differentiation Phenotypes of Infused T Cells and Anti-Cancer Immunotherapy. Front Immunol. 2021;1–12. DOI: 10.3389/fimmu.2021.745109.Ren H., Cao K., Wang M. A Correlation Between Differentiation Phenotypes of Infused T Cells and Anti-Cancer Immunotherapy. Front Immunol. 2021;1–12. DOI: 10.3389/fimmu.2021.745109.Jackson Z., Hong C., Schauner R., et al. Sequential Single-Cell Transcriptional and Protein Marker Profiling Reveals TIGIT as a Marker of CD19 CAR T Cell Dysfunction in Patients with Non-Hodgkin Lymphoma. Cancer Discov. 2022;12(8):1886–903. DOI: 10.1158/2159-8290.CD-21-1586.Jackson Z., Hong C., Schauner R., et al. Sequential Single-Cell Transcriptional and Protein Marker Profiling Reveals TIGIT as a Marker of CD19 CAR T Cell Dysfunction in Patients with Non-Hodgkin Lymphoma. Cancer Discov. 2022;12(8):1886–903. DOI: 10.1158/2159-8290.CD-21-1586.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.