Потребление донорской крови и ее компонентов про - должает увеличиваться, что неизбежно ведет к росту посттрансфузионных осложнений. Развитие высоко­технологичной медицинской помощи обуславливает повышение требований к качеству компонентов крови. Предупреждение большинства нежелательных трансфузионных последствий заключается в повышении ка­чества трансфузионных сред [1]. Иммунологическая и инфекционная безопасность компонентов крови яв­ляется основным критерием качества трансфузионной терапии. Лейкоциты, их фрагменты и продуцируемые ими цитокины обуславливают посттрансфузионные осложнения. Переливание реципиенту свободных от лейкоцитов продуктов крови предотвращает HLA- аллоиммунизацию, фебрильную посттрансфузионную реакцию, реакцию «трансплантат против хозяина», острое трансфузионное поражение легких, передачу цитомегаловирусной инфекции, вируса Эпштейна — Барр, вируса Т-клеточного лейкоза человека, резко снижает вероятность передачи гепатотропных виру­сов, иммуномодуляцию и передачу прионов (возбуди­теля болезни Крейтцфельдта — Якоба) [2].

В соответствии с техническим регламентом, утвер­жденным постановлением правительства от 26 ян­варя 2010 года № 29 [3], определены приемлемые ха­рактеристики качества различных трансфузионных сред: в эритроцитсодержащих компонентах, получен­ных методом афереза, должно содержаться не более 1х106 лейкоцитов в одной дозе, для концентрата тром­боцитов — не более 0,05х109 лейкоцитов в одной дозе, для плазмы — не более 0,1х109 лейкоцитов в литре. В соответствии с требованиями Совета Европы [4] компонент крови для трансфузии после удаления лей­коцитов должен содержать менее 1х106 клеток для про­филактики посттрансфузионных реакций, обуслов­ленных «остаточными лейкоцитами» [5]. Фильтрация компонентов крови необходима, что, в свою очередь, стимулирует разработку методов валидации контроля остаточных лейкоцитов. Согласно требованиям стан­дарта качества [5], концентрации лейкоцитов долж­ны находиться в области значений, которые могут быть определены только на приборах с высокой раз­решающей способностью. Гемоцитометрия Nageotte была первым практическим методом для подсчета остаточных клеток в компонентах крови и считалась подходящей для рутинного контроля качества [6—8]. Описанный в 1990-х годах данный способ определе­ния с использованием метода световой микроскопии и гемоцитометра большого объема (счетной камеры Nageotte) не позволяет провести экспертную оценку качества фильтрации в силу недостаточной чувстви­тельности метода и характеризуется высокой вари­абельностью получаемых результатов [6—8]. Метод Nageotte слишком трудоемкий и неуместен в качестве метода выбора, когда нужно тестировать большое ко­личество образцов [9].

Для преодоления этих трудностей были разрабо­таны альтернативные методы подсчета: автоматизи­рованный объемный капиллярный цитометр [10], проточные цитометрические методы [11, 12] и мето­ды полимеразной цепной реакции [13]. В нескольких исследованиях [10, 14, 15] сравнили количество лей­коцитов, подсчитанных автоматическими методами, с результатами подсчета лейкоцитов, полученными с помощью гемоцитометрии Nageotte. Использование многократных разбавлений показало, что точность ге- моцитометра Nageotte была низкой при малых концен­трациях остаточных клеток, а результаты были ниже по сравнению с результатами, полученными с помо­щью автоматизированных методов [6, 16]. Большое количество исследований посвящено сравнению гемоцитометрии Nageotte с различными автоматизирован­ными методами подсчета, основанными на технологии проточной цитометрии [17]. Использование гематоло­гических анализаторов для подсчета остаточных лей­коцитов крайне ограничено в связи с недостаточной чувствительностью анализа и отсутствием контроль­ных материалов. А.И. Костин и соавт. [1] отмечают при подсчете лейкоцитов в эритроцитсодержащих компонентах сходство результатов подсчета лейкоци­тов до фильтрации обоими методами и допускают воз­можность использования обычного гематологическо­го анализатора, прошедшего процедуру валидации, при необходимости определения количества лейко­цитов в эритроцитсодержащих компонентах, не под­вергавшихся лейкоредукции. Авторы [1] отмечают, что количество остаточных лейкоцитов было выше ре­комендованного экспертами Совета Европы [4].

Целью данного исследования была сравнительная характеристика использования проточного цитометра и гематологического анализатора для контроля содер­жания остаточных лейкоцитов в плазме крови.

В качестве анализируемой трансфузионной среды была выбрана плазма крови. Выбор плазмы крови в ка­честве анализируемой трансфузионной среды был обу­словлен тем, что плазма крови — один из самых широко востребованных компонентов крови, при этом стан­дарты качества в отношении «остаточных лейкоцитов» для плазмы стали применяться относительно недавно по сравнению с эритроцитсодержащими компонентами крови и концентратами тромбоцитов [18].

Для исследования использован 191 образец донор­ской плазмы крови, произведенный в ФГБУ «НМИЦ им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России, г. Но­восибирск.

Для подсчета «остаточных лейкоцитов» в плазме кро - ви на проточном цитометре Navios Beckman Coulter (США) использовали набор реагентов Beckman Coul­ter LeukoSure (США). Образец плазмы крови лизиро- вали и проводили через процедуру повышения прони­цаемости мембран с использованием оригинального лизирующего реагента LeukoSure, Beckman Coulter (США). При помощи РНКазы удаляли РНК, и крася­щий реагент, содержащий йодид пропидия, связывал­ся только с ДНК. Ядросодержащие клетки в образце флуоресцировали с интенсивностью пропорциональ­ной содержанию ДНК. Зрелые эритроциты и тромбо­циты, не содержащие ДНК, не связывают краситель. Непосредственно перед анализом добавляли 100 мкл гомогенизированных флуоросфер LeukoSure, осто­рожно перемешивали, пробирки загружали в карусель для автоматического анализа. Для анализа использо­валось фиксированное количество — 10 000 клеток: после того как на проточном цитометре проанализи­ровали 10 000 клеток, протокол измерения останавли­вали. В регион обнаружения были включены только неповрежденные лейкоциты. При помощи проточного цитометра Navios Beckman Coulter измеряли флуорес­ценцию каждой помеченной клетки. Так как зрелые тромбоциты и «красные клетки» крови не содержат

ДНК, то помеченные клетки представляли собой лей­коцитарный компонент образца.

Процедура лизиса и окрашивания, настройка про­точного цитометра и создание протоколов измере­ния проходили согласно инструкции производителя к комплекту реагентов. Линейность измерения лейко­цитов, заявленная производителем, определена диапа­зоном от 0 до 400 клеток в 1 мкл образца. Контроль каче­ства измерений содержания лейкоцитов в плазме крови проводили с использованием двух уровней контроль­ных материалов, Leuko-Trol Platelet Control Cells Low/ High Beckman Coulter в каждой аналитической серии. Контрольные материалы для оценки качества измере­ния остаточных лейкоцитов соответствовали следу­ющим диапазонам измерений: 0,5-4,5 клетки в 1 мкл и 14,5-25,5 клетки в 1 мкл соответственно.

В этих же образцах плазмы крови содержание лей­коцитов определяли при помощи автоматическо­го гематологического анализатора Sysmex XT-4000i (Япония) согласно стандартному протоколу работы на автоматическом гематологическом анализаторе. В данном гематологическом анализаторе для подсче­та количества лейкоцитов используется также прин­цип флуоресцентной проточной цитометрии. Проба направляется в проточную кювету. Образец подсве­чивается лучом полупроводникового лазера, кото­рый может разделять клетки посредством трех раз­личных сигналов: прямо рассеянный свет (прямое рассеяние/FSC), боковой рассеянный свет (боковое рассеяние/SSC), боковой флуоресцентный свет (бо­ковая флуоресценция/SFL). Интенсивность прямо­го рассеяния указывает на объем клетки. Боковое рассеяние предоставляет информацию о содержи­мом клетки: о ядре и гранулах. Боковая флуоресцен­ция указывает на количество ДНК и РНК в клетке. Клетки со схожими физико-химическими свойствами формируют кластер на графическом изображении, из­вестном как диаграмма рассеивания.

Линейность измерения содержания лейкоцитов в режиме анализа биологической жидкости, заяв­ленная производителем, определена в диапазоне 0,05х103 до 10,000х103 клеток в 1 мкл образца. В свя­зи с тем что нет коммерческих контрольных мате­риалов, разработанных для контроля остаточных лейкоцитов и аттестованных для автоматическо­го гематологического анализатора Sysmex XT-400, контроль качества измерений содержания лейкоци­тов в образцах плазмы крови проводили с исполь­зованием трех уровней контрольных материалов: Liquichek Hematology Control (X) Levels 1, 2 and 3 Bio-Rad. Контрольные материалы для оценки ка­чества измерения остаточных лейкоцитов соответ­ствовали следующим диапазонам измерений: (3,0- 4,6)х103 клеток в 1 мкл, (6,3-8,3)х103 клеток в 1 мкл и (16,7-20,9)х103 клеток в 1 мкл соответственно.

Статистическая обработка результатов произве­дена с использованием статистических критериев в программе Statistica 6.0. Полученные результаты измерения количества остаточных лейкоцитов мето­дом проточной цитометрии проверены на нормаль­ность распределения при помощи метода Колмого­рова — Смирнова. Результаты представлены в виде медианы, межквартильного интервала (25 и 75 % квартили).

Количество лейкоцитов в анализируемых образцах плазмы, определенных при помощи проточного цито­метра и гематологического анализатора, представлено в таблице 1.

Обращала на себя внимание неоднородность рас­пределения количества остаточных лейкоцитов в раз­личных образцах донорской плазмы (рис. 1). 98,95 % анализируемых образцов донорской плазмы имели количество остаточных лейкоцитов менее 100 кл/мкл. 2 образца донорской плазмы содержали лейкоци­ты 140 и 217 кл/мкл соответственно. Большая часть (83 %) анализируемых образцов плазмы имела коли­чество остаточных лейкоцитов меньше либо равное 15 кл/мкл, из них 20 % имело нулевое содержание остаточных лейкоцитов, определенное методом про­точной цитометрии.

Количество лейкоцитов 0,05х103 кл/мкл соответ­ствовало нижней границе линейности измерения анализатора в режиме биологической жидкости. Со­ответственно результаты измерения количества лейко­цитов, находящиеся ниже предела линейности (85 % образцов), не могли быть оценены достоверно.

При оценке остаточного количества лейкоци­тов повышенного внимания заслуживали образцы с малым количеством лейкоцитов, поскольку в свя­зи с повышающимися требованиями к компонентам крови приоритет должен быть отдан использованию образцов с наименьшим содержанием остаточных лейкоцитов.

Имелась значимая корреляция (r = 0,96718, p = 0,95) между количеством остаточных лейкоцитов, опреде­ленных при помощи проточного цитометра, и количе­ством лейкоцитов, определенных при помощи гемато­логического анализатора (рис. 2).

Развитие технологий афереза позволяет произво­дить плазму, практически не содержащую клеток крови, что, в свою очередь, требует наличия просто­го, объективного и точного метода подсчета остаточ­ных клеток крови. В данном исследовании сравнили использование автоматического гематологического анализатора Sysmex XT-4000i и проточной цитомет­рии (Navios) с коммерческим набором для подсчета остаточных лейкоцитов в плазме крови. В отсутствие метода «золотого стандарта», учитывая, что не прово­дили эксперименты по разбавлению, основной целью было выяснить соответствие между этими методами и преимущества использования в реальных условиях работы лаборатории.

Обнаружена сильная корреляция значений количе­ства лейкоцитов, измеренных при помощи проточно­го цитометра Navios и гематологического анализатора Sysmex XT-400 (г=0,96718, p=0,95), что свидетельствует о хорошей сопоставимости методов и, вероятно, воз­можной взаимозаменяемости в условиях работы лабо­ратории.

Согласно анализу на гематологическом анализаторе, все компоненты донорской плазмы соответствовали техническому регламенту, но пороговые значения при­бора не позволяли точно оценить низкие значения кон­центраций клеток после лейкоредукции.

Лейкоциты в плазме крови способны к активации во время хранения и секреции цитокинов и факторов роста, что, в свою очередь, может вызвать трансфузионные реакции у реципиента [19, 20]. Относительно большое количество остаточных лейкоцитов (до 100 кл в мкл) допускается согласно техническому регламенту [3], но адаптации Европейского совета [4] рекомен­дуют использовать продукты плазмы с наименее воз­можным содержанием остаточных клеток. С учетом того, что отдается предпочтение использованию образ­цов с минимальным содержанием остаточных клеток, предпочтительнее использовать проточную цитомет­рию с коммерческим набором реагентов для подсче­та остаточных лейкоцитов в продуктах крови. Кроме того, наличие аттестованных контрольных материалов с диапазонами значений низких концентраций лейко­цитов свидетельствует в пользу выбора метода про­точной цитометрии для рутинной оценки количества остаточных клеток в продуктах крови, так как позво­ляет сделать выводы о воспроизводимости и правиль­ности проводимых измерений. К недостаткам данного метода можно отнести высокую стоимость по сравне­нию с использованием гематологического анализатора и наличие технической подготовки оператора прибора при настраивании протоколов. Оба метода не являют­ся трудоемкими и могут использоваться для большого потока исследований.

Таким образом, для полноценного удаления лей­коцитов из трансфузионных сред с целью снижения риска трансфузионных осложнений необходим пра­вильный контроль качества компонентов крови в отношении количества остаточных лейкоцитов. Результа­ты настоящего исследования показали, что подсчет остаточных лейкоцитов плазмы крови для проверки на соответствие техническому регламенту возможен как при использовании технологии проточной цито­метрии, так и при использовании автоматического гематологического анализатора. Применение метода проточной цитометрии позволяет с высокой точно­стью производить подсчет остаточных лейкоцитов в компонентах крови за счет улавливания наимень­ших значений. Использование проточного цитометра с коммерческим анализом набора лучше подходит для образцов с минимальным количеством клеток до 15 клеток в мкл по сравнению с использованием гематологического анализатора.

Значительная вариабельность содержания остаточ­ных лейкоцитов в образцах плазмы крови свидетель­ствует о целесообразности проверки содержания лей­коцитов во всех компонентах крови.