Гем выступает в качестве простетической группы для многочисленных гем-содержащих белков, включа­ющих цитохромы, каталазы, синтазу оксида азота, ге­моглобин и миоглобин, и участвует в многочисленных регуляторных системах, управляющих процессами транскрипции, трансляции, процессинга микроРНК и циркадными ритмами [1—4]. Избыток гема и его предшественников приводит к образованию реактив­ных форм кислорода. Биосинтез гема в эукариоти­ческих организмах осуществляется в 8 стадий, и на­рушения в любом из участвующих в них ферментов приводят к развитию различных вариантов порфирии, обусловленных накоплением в организме токсичных предшественников гема. Острая перемежающаяся порфирия (ОПП) связана с дефицитом третьего фер­мента биосинтеза гема — гидроксиметилбилан синта­зы (HMBS), или другое название — порфобилиноген дезаминазы (PBGD) [5, 6]. Заболевание имеет присту­пообразное течение, сопровождающееся прогрессиру­ющим поражением нервной системы, что обусловлено воздействием токсичных порфириновых предшествен­ников (δ-аминолевулиновой кислоты и порфобилиногена) на висцеральную, периферическую, автономную и центральную нервные системы (ЦНС). Приступ проявляется болями в животе, тошнотой, рвотой, та­хикардией и гипертонией. Нарушения ЦНС проявля­ются в виде тревожности, бессонницы, галлюцинаций, депрессии, паранойи, дезориентации. Перифериче­ская невропатия вызывает боль и слабость и может прогрессировать до тетрапареза и затруднения ды­хания [7—10]. К факторам, провоцирующим развитие приступа, относятся лекарственные препараты (бар­битураты, антиконвульсанты, рифампицин и суль­фаниламидные антибиотики), лютеальная фаза мен­струального цикла, гормональные контрацептивы, голодание и низкокалорийная диета, алкоголь, стресс, инфекции и др. [8, 9, 11]. Все провоцирующие экзоген­ные и эндогенные факторы стимулируют экспрессию синтазы дельта-аминолевулиновой кислоты (ALAS1), стартового фермента цикла биосинтеза гема [2, 4].

ОПП имеет доминантный тип наследования, и по­чти все больные являются гетерозиготными носите­лями патогенного варианта в гене HMBS. Этот ген расположен на хромосоме 11 (11q24.1—24.2) и имеет длину около 10 000 п. н., из которых 1300 п. н. пред­ставляют собой кодирующую часть, состоящую из 15 экзонов. Белок HMBS имеет две изоформы, одна экс­прессируется только в эритроидных клетках, а другая повсеместно [12]. Эти изоформы кодируются двумя независимыми мРНК, транскрибирующимися с раз­ных промоторов одного гена. В настоящее время в раз­ных странах зафиксировано свыше 400 мутаций в гене HMBS [13, 14] (база данных HGMD: http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php).

Однако далеко не все носители патогенных вари­антов в этом гене имеют клинические проявления заболевания. В большинстве стран пенетрантность составляет 10—20 % [8, 13, 15]. В ходе наших много­летних исследований и в работах зарубежных ла­бораторий [13, 14, 17, 18] ассоциации между типом мутации в гене HMBS и проявлением заболевания выявлено не было. Высказывалось предположение о том, что пенетрантность ОПП может определяться сочетанием патологической мутации в одном из ал­лелей гена HMBS с гипоморфным аллелем (аллеля­ми) дикого типа этого гена со сниженной экспресси­ей фермента [19]. Такая взаимосвязь была выявлена для эритропоэтической протопорфирии, при которой найдена очевидная корреляция между клиническим фенотипом и сочетанием мутантного и слабоэкспрес- сирующегося аллелей гена феррохелатазы. Аллель «дикого типа» со сниженной экспрессией был най­ден также для копропорфириногеноксидазы. Одна­ко авторы данного исследования не нашли подобной связи для ОПП [19]. В настоящей работе, в которой была определена полная первичная структура гена HMBS для двух больных ОПП, также не было най­дено гипоморфных аллельных вариантов, сочетание которых с мутантным аллелем могло бы определять клинические проявления заболевания [17]. Таким образом, более вероятной выглядит гипотеза о суще­ствовании дополнительных генетических детерми­нант пенетрантности ОПП [13, 14, 16, 17]. О наличии генетической предрасположенности к клиническому проявлению ОПП свидетельствует схожесть карти­ны заболевания (возраст при первой манифестации, периодичность и тяжесть приступов, симптоматика) у женщин-близнецов [18].

В нашем предыдущем исследовании [20] были выбо­рочно изучены гены различных метаболических и регу­ляторных систем (всего 24 гена, в том числе гены систем детоксикации), нарушения в которых могут приводить к клиническому проявлению ОПП. Работа была осно­вана на поиске различий в частотах встречаемости по­лиморфных аллельных вариантов этих генов в группах больных и бессимптомных носителей. Предположи­тельная ассоциация с клиническим проявлением забо­левания была показана только для глутатионтрансфераз (GSTT, GSTM), сочетание гомозиготности по нулевым делеционным вариантам которых выявлялось только у больных и ни разу не встретилось у пожилых бессим­птомных носителей мутации в гене HMBS [20].

Целью данного исследования был поиск допол­нительных генетических факторов, предопре­деляющих клиническую пенетрантность ОПП, с использованием современной технологии высоко­производительного секвенирования (next-generation sequencing, NGS).

Данная работа является пилотным исследовани­ем, так как для изучения молекулярно-генетических основ порфирий технология NGS до сих пор не при­менялась.

Для проведения секвенирования полного экзома (Whole Exom Sequencing, WES) были отобраны образ­цы ДНК 6 женщин, больных ОПП, с известными му­тациями в гене HMBS, у которых заболевание проте­кало в тяжелой форме с неоднократными приступами. От всех больных получено добровольное информиро­ванное согласие на обработку и публикацию данных молекулярно-генетического исследования на условиях анонимности. Научная тема, в рамках которой прово­дилась данная работа, одобрена локальным этическим комитетом ФГБУ НМИЦ гематологии Минздрава России.

ДНК выделяли из ядерных клеток периферической крови после селективного лизиса эритроцитов в 0,8 % растворе хлорида аммония по стандартной методике, включающей обработку додецилсульфатом натрия (0,5 %) и протеиназой К (200 мкг/мл) в течение ночи при 37 °С или 2 часов при 65 °С с последующей фенол- хлороформной экстракцией.

Концентрацию выделенной ДНК определяли на спек­трофотометре Ultrospec 3000 (Pharmacia Biotech), чи­стоту контролировали по отношению поглощения све­та 260/280 нм. ДНК всех выбранных для исследования больных подходила по качеству для NGS.

Ранее для всех исследуемых больных амплифици- ровали и секвенировали по методу Сэнгера все функ­ционально значимые участки гена HMBS: 5'-UTR, 3'-UTR, 15 экзонов с прилегающими достаточно про­тяженными интронными участками. У каждой боль­ной были выявлены следующие патогенные варианты (нумерация аминокислот начинается со стартового ко­дона (+1 позиция), в качестве референсной последова­тельности использованы NG_008093.1 для геномных позиций и NP_000181.2 для нумерации кДНК):

Используемая номенклатура генетических вари­антов соответствует рекомендациям HGVS вер. 15.11 (http://varnomen.hgvs.org/).

Полный экзом секвенировали в лаборатории россий­ской инновационной биотехнологической компании «Евроген» (Москва) с набором TruSeq Exome Library Prep kit (Illumina) на приборе Illumina HiSeq4000 с длиной прочтения 2x75 пн. В результате мы получи­ли 777 млн прочтений отличного качества. Более 99 % прочтений прошли фильтрацию по качеству, длине и были использованы в работе (от 104 млн до 144 млн для каждого образца).

В качестве референсного использовали версию ге­нома человека hg19. Картирование прочтений прово­дилось в программе bwa mem, эффективность карти­рования была более 99 %. Варианты, отличающиеся от референсного, детектировались с помощью програм­мы GATK для каждого образца отдельно с перекали- бровкой на известные варианты базы dbSNP138_hg19. Весь полученный массив данных был использован для дальнейшей биоинформатической обработки.

Первая часть анализа была основана на функцио­нальном подходе, при котором выполнена попытка вы­явить для больных с манифестировавшим заболева­нием общие функциональные полиморфизмы в генах, продукты экспрессии которых участвуют в метаболиз­ме гема или в регуляции этого процесса.

Во второй части исследования был проведен поиск патогенных вариантов. При этом учитывали только генетические варианты, не зарегистрированные в ба­зах данных SNP. Среди вариаций учитывали stopgain, frameshift, 5-UTR (ближняя область до позиции около -200), nonframe, нарушение сплайсинга и несинонимич­ные замены. Из несинонимичных замен оставили только те, которые идентифицировались как патогенные четырь­мя программами анализа белковых структур, наиболее часто используемыми для характеристики влияния ген­ных дефектов (SIFT [21], PolyPhen-2 [22], MutationTaster [23], Provean [24]). Оставшиеся после такой фильтрации варианты с наибольшей вероятностью могут рассматри­ваться как патогенные варианты. На последнем этапе анализа к найденным патогенным вариантам добавили SNP в тех же генах, зарегистрированных в базах дан­ных, но с очень низкой частотой встречаемости.

В среднем для каждой из 6 больных ОПП было по­лучено около 37 000 различных вариантов, отличаю­щихся от референсной геномной последовательности.

В первую очередь рассмотрели вариации в генах, которые на основании функций кодируемых ими белков были выбраны в качестве кандидатных и частично исследовались ранее, но только точечно по отдельным полиморфизмам. На наличие мутаций или редких полиморфных вариаций были проана­лизированы гены, относящиеся к системам деток­сикации, регуляции каскада биосинтеза гема и экс­прессии ALASl. Ни в одном из генов не выявлено вариаций, которые можно было бы с большой вероятностью отнести к мутациям, но для ряда генов у двух и более больных были найдены достаточно редкие функциональные (гипоморфные) аллельные варианты (табл. 1).

Полноэкзомное секвенирование выявило у каждой больной около 275—309 (в среднем 290) генных вари­антов, не зарегистрированных в базах данных SNP. У каждой больной эти варианты приходились на 177— 227 (в среднем на 200) различных генов, в сумме в об­щей выборке генные дефекты такого типа были найде­ны в 970 генах.

Полученные после жесткой фильтрации генные варианты (не зарегистрированные в базах данных по SNP и определяемые протеомными программами как патогенные) приведены в таблице 2. Следует учи­тывать, что результаты, получаемые при помощи этих аналитических программ, достаточно часто противо­речат друг другу, что отмечалось и другими исследо­вателями [25—27]. Например, в таблицу вошли толь­ко 5 из 6 вариантов в гене HMBS, найденных ранее с использованием секвенирования по методу Сэнгера. Мутация c.731T>C (p.Leu244Pro) (Пп537) признана патогенной только программой MutationTaster, хотя у данной больной она была единственным отличием от референсной последовательности.

Для оставшихся после жесткой фильтрации вари­антов был проведен функциональный анализ (табл. 2), который начали с генов, вариации которых встре­тились у нескольких больных. Далее оценивали возможную причастность к клиническому проявле­нию ОПП дефектов в остальных генах, основыва­ясь на известных функциях кодируемых ими бел­ков и характере связанных с ними наследственных патологий. У 4 больных была найдена одна и та же инсерция —                                 NM_001007026:c.1461_1462insCAG:p.Gln487delinsGlnGln в гене атрофина 1 (AZAl). Пато­генные нарушения в этом гене вызывают нейродеге- неративное наследственное заболевание — дентаторубро-паллидолюисову атрофию, ассоциированную с экспансией CAG-повтора в гене ATN1 и симптома­тически отчасти сходную с ОПП (полинейропатия, выражающаяся в спинально-мышечной атаксии, эпилепсии, деменции) [28, 29]. Патология проявля­ется при увеличении числа триплетов CAG до 49—88 при норме в менее чем 36. Наблюдающееся в данном исследовании отличие от референсной последова­тельности всего на один мотив CAG свидетельствует о том, что в данном случае имеет место не мутация, а обычный полиморфизм. Такой же вывод можно сде­лать на основании анализа вариации NM_001128164: c.626_627insGCA:p.His209delinsGlnHis (CAG) в гене ATXN1 (атаксин 1), встретившуюся у 3 больных, де­фекты которого приводят к аутосомной доминантной церебральной атаксии [30]. Среди генов, вариации ко­торых обнаружены у 2 больных (LIN9, ALMS1, AGAP6, ALG8, MYADML2), на основании анализа функций, ко­дируемых ими белков и ассоциации с наследственны­ми патологиями только ген альфа-1,3-глюкозилтранс- феразы (ALG8), участвующей в гликозилировании белков, с определенными оговорками, может рассма­триваться как кандидатный, поскольку его дефекты также связаны с целым рядом нейродегенеративных наследственных заболеваний, некоторые из которых по своей симптоматике отчасти сходны с ОПП [31].

Далее проанализировали вариации для всех извест­ных на данный момент генов (31), нарушения в ко­торых ассоциируются с развитием наследственного миастенического синдрома (НМС) [32], однако в боль­шинстве этих генов отличий от референсного генома не было или же были отмечены часто встречающиеся в мировой популяции варианты. Выявленные в этих генах патогенные варианты приведены в таблице 3. В этой таблице приведены также данные по редким аллелям генов — регуляторов нервной системы, которые могут быть гипоморфными, т.е. иметь снижен­ную активность. В целом, патогенные варианты генов, нарушения в которых могут ассоциироваться с нейродегенеративными заболеваниями, обнаружены у 5 из 6 больных, а редкие гипоморфные аллели — у всех 6 больных.

Клинические проявления ОПП обусловлены воз­действием предшественников гема, которые накапли­ваются в организме и не успевают выводиться из него [7—10]. Это может быть связано с тем, что синтезирует­ся слишком большое количество продукта на стадиях, предшествующих работе гидроксиметилбилан синтазы, то есть в результате чрезмерной активности синтазы или дегидратазы δ-аминолевулиновой кислоты, и/или происходят нарушения в процессе деградации гема. Показано, что экзогенные и эндогенные факто­ры, провоцирующие развитие острого приступа, сти­мулируют экспрессию ALASl и apoCYP, являясь ли­гандами для целого ряда транскрипционных факторов и их медиаторов [2, 4, 33—38]. Неконтролируемая ин­дукция ALASl в сочетании с дефицитом ферментов по­следующих стадий биосинтеза гема может приводить к созданию избыточного пула токсичных порфирино- вых предшественников и клиническому проявлению заболевания. Таким образом, именно ALASl является основной потенциальной мишенью, которую рассма­тривают в качестве провокатора манифестации ОПП и других острых порфирий. В связи с этим на первом этапе были проанализированы вариации в гене ALASl и в генах, кодирующих другие ферменты биосинтеза гема (ALAD, UROD, FECH, PPOX, CPOX), а также фер­менты, участвующие в деградации гема, к которым от­носятся HMOXl и HMOX2, кодирующие гемоксигеназы 1 и 2 [7], LONPl, CLPX и CLPP, кодирующие митохон­дриальные АТФ-зависимые протеазы [4, 39]. В ходе широкомасштабного анализа экспрессии генов были найдены еще 5 потенциальных участников биосинтеза гема — три гена (SLC25A39, SLC22A4 и TMEM14C), ко­дирующие предполагаемые митохондриальные тран­спортеры, и два гена (Clorf69 и ISCAl), кодирующие белки Fe-S кластеров [36]. Эти гены также проверяли на наличие вариаций.

В гене ALASl ни у одной из 6 больных ОПП не было выявлено вариаций. У одной из исследованных боль­ных (Пп537) был выявлен вариант в гене ALAD (неси­нонимичная замена NM_000031:c.T574G:p.Ser192Ala, (SIFT: 0,022 T; PolyPhen-2: 0,208 B; MutationTaster: 0,81 D; Provean: 0,249 N) в гетерозиготном состоянии. Такое двойное нарушение в цикле биосинтеза гема теоретически могло бы иметь прямо противополож­ные последствия. С одной стороны, дополнительный дефект во второй стадии цикла может в определенных условиях спровоцировать клиническое проявление ОПП, а с другой — наоборот, послужить защитным механизмом за счет снижения нагрузки на третью ста­дию цикла. У больной есть родные брат и сестра, оба старше 30 лет, также являющиеся носителями нару­шений в генах HMBS и ALAD, но у них никаких про­явлений заболевания до сих пор не было, у самой же больной ОПП манифестировала в 21 год. Из чего сле­дует, что дополнительное нарушение в гене ALAD вряд ли оказывает существенное влияние на пенетрантность ОПП.

Вариаций в генах HMOXl и HMOX2, а также в генах, кодирующих субъединицы ClpXP, ни у одной из 6 больных выявлено не было. Зато у трех из них (Пп442, Пп530 и Пп533) в гене LONPl была найдена редкая (f = 0,06) несинонимичная замена rs11085147 (NM_001276480:c.G134A:p.Arg45Gln, табл.1), и у одной (Пп537) — еще более редкая (f = 0,02) замена rs1062373 (NM_001276480:c.G2143A:p.Val715Ile, табл. 1).

Обе эти замены могли бы оказаться функциональны­ми. Однако по результатам дальнейшего исследова­ния на выборке еще из 20 больных ОПП редкий вари­ант rs11085147 был выявлен только у одного больного, то есть частота его встречаемости среди больных ока­залась такой же, как и в мировой популяции. Второй вариант (rs1062373) в настоящее время исследуется.

В генах, кодирующих предполагаемые митохондри­альные транспортеры (SLC25A39, SLC22A4 и TMEM14C) и белки Fe-S кластеров (Clorf69 и ISCA1), ни у одной больных функционально значимых замен не выявили.

Индукция ALASl происходит в ответ на необходи­мость в геме для формирования гемопротеинов и, среди прочих, цитохромов P450 (CYPs), вовлеченных в первую и вторую фазы метаболизма ксенобиотиков, и опосре­дована несколькими транскрипционными факторами, которые активируются, связываясь с ксенобиотиками или гормональными стероидами [33, 35, 40—42]. У че­ловека индуцированная ксенобиотиками транскрипци­онная активация генов ALASl и CYPs при метаболизме более 50 % лекарств опосредована ядерными рецеп

торами CAR (constitutively androstane receptor) и PXR (pregnane xenobiotic receptor). Медиаторами для PXR/ CAR-индуцированной транскрипции ALASl могут вы­ступать отвечающий на сигналы гипоталамо-гипофи- зарно-надпочечниковой системы глюкокортикоидный рецептор (glucocorticoid receptor, GR), HNF4 (hepatocyte nuclear factor 4), инсулин-зависимый транскрипцион­ный фактор FOXO (Forkhead box class O) и неинсулин-зависимый транскрипционный фактор PGC-1a, активируемый глюкагоном [33]. Внешние и внутренние факторы, вызывающие приступы ОПП, могут запу­скать один из четырех описанных выше путей воздей­ствия на ALAS1 посредством активации системы CAR/ PXR или несколько одновременно.

Все выявленные у больных замены в генах, коди­рующих RXR (гены RXRA, RXRB, RXRG), FOXO1 (ген FOXO1), CAR (ген NR1I3), PXR (ген NR1I2), GR (ген NR3C1), NRF1 (ген NRF1), были интронными или синонимичными. У 5 больных в гене, кодирую­щем γ-субъединицу HNF4 (HNF4G), были выявле­ны две однонуклеотидные несинонимичные замены rs2943549 (NM_004133:c.G86A:p.Ser29Asn, табл.         1)

и rs1805098 (NM_004133:c.G681A:p.Met227Ile, табл. 1), но они встречаются с частотой около 44 % и среди здо­ровой популяции и аналитическими программами как патогенные не определяются.

В гене, кодирующем α-субъединицу HNF4 (HNF4A), у больной (Пп533) был выявлен очень редкий (f = 0,002) вариант rs142204928 (NM_000457:c.G505A:p.Val169Ile, табл. 1), который может быть ассоциирован с сахарным диабетом 2-го типа. У 4 больных в гене, кодирующем PGC-1a (PPARGC1A), был выявлен распространенный (f = 0,43) вариант rs8192678 (NM_013261:c.G1444A:p. Gly482Ser, табл. 1) являющийся, по всей вероятности, нейтральным.

ALASl также играет важную роль в биосинтезе сте­роидных гормонов, в частности, участвует в продук­ции прогестерона в стероидогенных клетках [38], что могло бы объяснять тот факт, что стресс, приме­нение оральных контрацептивов и лютеальная фаза менструального цикла часто являются факторами, провоцирующими развитие приступа при острых пор- фириях. В стероидогенных тканях в регуляции ALASl участвуют рецепторы SF-1 (orphan nuclear receptor steroidogenic factor 1) и LRH-1 (liver receptor homolog 1) [38]. Был проведен поиск вариаций в генах NR5A1, ко­дирующем SF-1, и NR5A2, кодирующем LRH-1, однако все они находились в интронных или межгенных об­ластях.

Как отмечалось выше, экспрессия ALASl тесно свя­зана с работой цитохромов P450 (CYPs), вовлеченных в первую и вторую фазы метаболизма ксенобиотиков, в состав которых входит гем [33, 43, 44]. Нарушения экспрессии и активности этих белков могут приводить к менее эффективному метаболизму ксенобиотиков, что, в свою очередь, будет стимулировать экспрессию

ALASl. Анализ генов, кодирующих CYPs у включен­ных в данное исследование больных, не выявил нару­шений в одном из самых представленных в пуле пе­ченочных гемопротеинов человека [43, 44] — CYP3A4, отвечающем за метаболизм более 60 % применяемых препаратов [45]. Однако среди других подтипов были выявлены однонуклеотидные замены, которые, воз­можно, являются функциональными. У всех 6 боль­ных был выявлен часто встречающийся в европейской популяции (f = 0,4) вариант rs1056836 (NM_000104:c. G1294C:p.Val432Leu, табл. 1) в гене CYP1B1, кодиру­ющем белок, отвечающий за метаболизм эйказонои- дов, эстрогена и чужеродных химических соедине­ний [45], причем у 4 больных (Пп442, Пп533, Пп537, Пп570) он был выявлен в гомозиготном состоянии, что существенно превышает ожидаемую частоту по­добного события. Ранее было показано, что данный аллель, особенно в гомозиготном состоянии, связан с меньшей восприимчивостью к ряду лекарственных препаратов [46]. В гене, кодирующем CYP2B6, который отвечает за метаболизм эйказоноидов, лекарств и чу­жеродных химических соединений [45] и, в частно­сти, участвует в метаболизме барбитуратов и взаимо­действует с ядерными рецепторами CAR и PXR [47], у 3 больных (Пп442, Пп530, Пп533) был выявлен вариант rs3745274 (NM_000767:c.G516T:p.Gln172His, табл. 1). Он встречается с частотой 15—60 % в раз­ных популяциях и связан со снижением экспрессии белка на 50—75 % [48—50]. У одной больной (Пп530) этот вариант был в гомозиготной форме. У 3 больных (Пп442, Пп570, Пп597) выявили вариант rs1057910 (NM_000771:c.A1075C:p.Ile359Leu, табл. 1) (f = 0,06) в гене, кодирующем CYP2C9, который отвечает за ме­таболизм эйказоноидов, лекарств и чужеродных хи­мических соединений [45, 49]. Его максимальная ин­дукция требует задействования одновременно сайта связывания CAR/PXR и HNF4a за счет участия мега­комплекса из кофакторов, связанных с HNF4a, в том числе PGC-1a, SRC-1 и NCOA6 [47, 51]. Выявленный вариант встречается в мировой популяции с часто­той около 6 % и снижает активность белка до 70 % в зависимости от субстрата и ниже в случае гомози­готного состояния [47], однако среди обследованных больных он был только в гетерозиготном состоянии. Более того, на расширенной выборке больных ОПП было показано, что частота его встречаемости у них не отличается от таковой в общей популяции. Также были выявлены SNP в генах, кодирующих цитох- ромы CYP2D6, CYP4F2 и CYP4F11, которые отвечают за метаболизм эйказоноидов, лекарств и чужеродных химических соединений [45]. Все эти полиморфные варианты (rs1065852, rs1135840, rs16947, rs2108622 и rs1060467, табл. 1) встречаются в мировой попу­ляции с частотой около 30 % и, возможно, связаны с пониженной чувствительностью к ряду лекарств [45, 47, 52].

Анализ результатов жесткой фильтрации дан­ных WES показал, что наиболее перспективными в плане влияния их аномальных вариантов на пене- трантность ОПП являются гены, продукты которых имеют отношение к регуляции нервной системы и на­рушения в которых приводят к развитию заболева­ний, по симптоматике отчасти схожих с ОПП. Среди генов, вариации в которых обнаружились у единич­ных больных, были выделены патогенные варианты в генах AGRN (NM_198576:c.G3598A:p.Val1200I1e), DOK7 (NM_001164673:c.C139T:p.Arg47Cys) и FBXO38 (NM_001271723:c.G2261A:p.Arg754His) (табл. 3).

Ген AGRbN кодирует один из белков, которые важны для нейромышечного синаптогенеза. Патогенные на­рушения в нем вызывают наследственный НМС, ас­социированный с дефектами в большой группе генов, регулирующих нервную систему, и имеющий доста­точно разнообразную симптоматику в зависимости от затронутого гена [32], в ряде случаев частично пе­ресекающуюся с симптоматикой ОПП. Присутствие варианта р.Val1200Ile в этом гене у больной Пп537 было подтверждено секвенированием по Сэнгеру. Дан­ный вариант можно считать условно патогенным, так как из 4 использованных протеомных аналитических программ только MutationTaster признает его соб­ственно патогенным. Однако вариация p.Leu244Pro в гене HMBS у этой же больной тоже признается па­тогенной только программой MutationTaster, хотя других отличий от референсной последовательности нет, и, следовательно, именно она является причиной развития ОПП. Был проведен анализ найденной ва­риации в гене AGRbN у родственников больной, явля­ющихся носителями дефекта в гене HMBS. У самой больной диагностирована тяжелая форма заболева­ния с множественными приступами. У отца и родной сестры больной, также являющихся носителями этого варианта в гене AGRbN, ранее наблюдались единичные кратковременные приступы, сопровождавшиеся абдо­минальной болью и затруднением дыхания. У брата больной, не являющегося носителем патогенного ва­рианта в гене AGbRN, подобных отклонений от нормы никогда не наблюдалось. Ген DOK7 кодирует белок, необходимый для нейромышечного синаптогенеза и постсинаптической дифференциации. Как и в слу­чае гена AGRN, нарушения в нем вызывают НМС. Па­тогенные варианты в гене FBXO38, кодирующем один из регуляторов роста и репарации аксонов, могут вы­зывать мышечную атрофию [53], однако они встреча­ются редко и в настоящее время их известно всего 5 (база данных HGMD).

В результате проведенного анализа мы выявили генные варианты в генах белков, регулирующих фор­мирование и передачу нервных сигналов у 5 из 6 об­следованных больных. В гене DOK7, кроме патоген­ного варианта Arg47Cys, о котором говорилось выше, выявлена замена rs62272670 (NM_001164673:c.C134T: p.Ser45Leu), зарегистрированная в базе данных HGMD (CM071708). В другом исследовании она была выявлена у больного НМС [54]. Еще одна редкая ва­риация rs191800156 (NM_173660:c.-6 C>G), возможно, ведет к уменьшению экспрессии белка за счет сни­жения активности промотора гена. Выявлены новые варианты в гене нейротрансмиттера UNC13A, генах SCN4A и FBXO38, идентифицируемые тремя-четырьмя использованными программами анализа белковых структур, как патогенные (табл. 3). Вариантам в гене ALG8 дают статус патогенных все 4 использованные протеомные программы.

Таким образом, анализ данных WES для 6 больных тяжелой формой ОПП по генам, относящимся к сис­темам детоксикации, регуляции каскада биосинтеза гема и экспрессии ALAS1, не выявил вариаций, кото­рые можно было бы отнести к очевидно патогенным, но для ряда генов у двух и более больных были найде­ны достаточно редкие и предположительно функцио­нальные аллельные варианты. Эти варианты требуют дальнейшего изучения на расширенных выборках больных с манифестацией ОПП и их родственников, являющихся бессимптомными носителями патоген­ных нарушений в гене HMBS.

Результаты проведенного анализа позволили нам также высказать гипотезу о возможной роли сочета­ния гетерозиготных мутаций в гене HMBS и одном из генов-регуляторов нервной системы в клиниче­ском проявлении ОПП. Большинство наследственных нейропатий являются рецессивными заболеваниями, а все выявленные и приведенные вариации встрети­лись в гетерозиготном состоянии. Данная гипотеза представляется правдоподобной, и на следующем эта­пе исследования предполагается уделить внимание ее проверке, начав с мутационного анализа при по­мощи секвенирования по методу Сэнгера генов DOK7 и SCN4A, дефекты в которых найдены суммарно более чем у половины больных наследственным миастениче­ским синдромом.