В нормальных условиях нейтрофилы образуются в костном мозге из морфологически неидентифицируемых гемопоэтических стволовых клеток, способ­ных пролиферировать и дифференцироваться в белые и красные кровяные клетки и клетки — предшествен­ники миелопоэза (гранулоцитарно-макрофагальная колониеобразующая единица (КОЕ-ГМ) гранулоци- тарная колониеобразующая единица (КОЕ-Г) [3, 5—7]. Деление и созревание этих клеток стимулируются факторами роста (интерлейкинами, гранулоцитарно- макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ) и гранулоцитарным КСФ — основными цитокинами, регулирующим гранулопоэз в норме через рецептор гранулоцитарного колониестимули­рующего фактора, что приводит к формированию миелоидных пулов делящихся клеток (миелобластов, промиелоцитов и миелоцитов) и нейтрофилов, кото­рые в процессе дифференцировки утратили способ­ность к делению (метамиелоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных гранулоцитов). Неделящийся пул составляет основную массу гранулоцитарного кост­номозгового резерва, превышающий по численности клетки, циркулирующие в периферической крови, в 30—70 раз [5, 8, 9]. Основные функции костномозго­вого резерва — поддерживать гомеостаз гранулоцитов («гомеостатический гранулопоэз»), циркулирующих в крови, и мобилизовать дополнительное количество клеток («экстренный гранулопоэз») при возникающей необходимости (воспаление, инфекции, рак и другие) [10, 11]. О значении гранулопоэза для организма гово­рит тот факт, что клетки миелоидных пулов занимают около 2/3 объема костного мозга [10].

Для поддержания гомеостаза уровня нейтрофилов других клеток в периферической крови пролиферация и дифференцировка клеток-предшественников жестко регулируется и контролируется несколькими внутрен­ними и внешними факторами. Например, в нишах костного мозга гемопоэтические стволовые клетки со­храняются посредством взаимодействия мембранных β-интегринов с остеобластами и внеклеточным мат­риксом [4, 12, 13].

После созревания ПМН попадают в перифериче­ский кровоток (5х1010—1011 клеток в сутки), мигриру­ют в ткани, где они выполняют свои антимикробные функции. Соответственно, эквивалентное количество стареющих нейтрофилов должно быть удалено из кро­вообращения для сохранения гомеостаза. Нейтрофильный гомеостаз в периферической крови строго регулируется благодаря многокомпонентному меха­низму поддержания баланса между ростом ПМН, их дифференцировкой и элиминацией [4, 12]. Этот ба­ланс обеспечивает выполнение этими клетками мно­гочисленных функций с помощью фенотипической пластичности [3, 13]. Нарушение гомеостаза перифе­рических нейтрофилов влияет на врожденный и адап­тивный иммунитет, может привести к возникновению опасных для жизни инфекций, аутоиммунным или он­кологическим заболеваниям.

На протяжении всей их жизни нейтрофилы по мере созревания претерпевают фенотипические переходы, которые могут быть продиктованы местным микро­окружением в кровообращении и периферических тканях. Во время развития и созревания нейтрофилы проходят ряд последовательных стадий до формирова­ния генерации зрелых нейтрофилов [12, 13]. Грануло­поэтическая популяция нейтрофилов в костном мозге делится на 3 различных пула: стволовых клеток, мито­тический и постмитотический. Пул стволовых клеток состоит из недифференцированных полипотентных клеток-предшественников. Митотический пул пред­ставлен миелоидными клетками-предшественниками, такими как миелобласты, промиелоциты, метамиело­циты и миелоциты. Постмитотический пул состоит из метамиелоцитов и палочкоядерных нейтрофилов. Наконец, зрелые нейтрофилы являются полностью дифференцированной клеточной генерацией, которая выходит из костного мозга и циркулирует в перифери­ческой крови.

По мере созревания и на разных стадиях диффе- ренцировки в цитоплазме нейтрофилов появляются гранулы (азурофильные, специфические и желати- назные) и секреторные пузырьки, которые содержат антимикробные пептиды и ферменты: эластазы, мие- лопероксидазы, кателицидины, дефензины и матрикс- ные металлопротеиназы, являющиеся эффективным инструментом для реализации антибактериальных стратегий ПМН [2, 10, 12].

Гранулярный аппарат нейтрофилов необходим для выполнения ими своей роли при врожденном им­мунном ответе. Биологические молекулы, входящие в состав гранул, реагируют на окружающие сигна­лы, стимулирующие миграцию нейтрофилов к оча­гу инфекции и фагоцитоз вторгающихся микробов, инициируют генерацию активных форм кислорода из НАДФН-оксидазы, протеаз и антимикробных пеп­тидов, которые, действуя совместно, создают агрес­сивную внутрифагосомальную среду и вызывают ми­кробную эрадикацию [10, 13—16].

Важность образования активных форм кислорода проявляется при хронических гранулематозных за­болеваниях с дефектной окислительной функцией ПМН. Для этих пациентов характерны частые реци­дивирующие бактериальные и грибковые инфекции [4, 12, 14].

Являясь важными эффекторами иммунной систе­мы, нейтрофилы ведут постоянный мониторинг орга­низма, выявляя признаки микробных инфекций. По­сле их обнаружения они мигрируют через эндотелий кровеносных сосудов в очаг инфекции или воспаления с помощью механизма, известного как каскад адгезии лейкоцитов (в котором принимают также участие селектины, лиганды и интегрины), и убивают вторгшие­ся микроорганизмы [2, 5, 15, 16].

Миграция нейтрофилов в ткани имеет решающее значение для защиты от микробных инфекций. Важ­ность этой функции проявляется у больных с дефек­тами адгезии этих клеток, что приводит к нарушению их миграции через эндотелий кровеносных сосудов. Такие больные страдают от множественных бактери­альных инфекций из-за неспособности нейтрофилов к фагоцитозу [17, 18].

После выполнения своей функции в тканях нейтро- филы подвергаются апоптозу или элиминируются по­средством фагоцитоза резидентными макрофагами и дендритными клетками. Запрограммированная ги­бель нейтрофилов — апоптоз — критичный процесс, модулирующий их количество и функции, запуская каскад противовоспалительных реакций и снижения продукции нейтрофилов [3, 17, 19—21].

В настоящее время признаны три основные проти- вомикробные стратегии нейтрофилов: фагоцитоз, дегрануляция, и формирование нейтрофильных вне­клеточных ловушек (neutrophil extracellular traps, NETs) (рис. 1). NETs представляют собой защитный механизм, впервые описанный как средство улавли­вания и уничтожения бактерий и других патогенов [11, 22, 23]. Осуществляя такого рода внеклеточный киллинг микроорганизмов, нейтрофилы погибают через NETosis [11, 24].

Для выпуска сети активированные нейтрофилы пре­терпевают драматические морфологические измене­ния. Через минуты после активации они сплющива­ются и крепко прикрепляются к субстрату. В течение следующего часа ядро теряет свои дольки, происходит деконденсация хроматина, а внутренние и внешние ядерные мембраны постепенно отделяются друг от дру­га. Одновременно гранулы распадаются. Через 1 ч ядерная оболочка дезагрегируется в везикулы, а нук- леоплазма и цитоплазма образуют гомогенную массу. Наконец, клетки округляются и, по-видимому, сжима­ются до тех пор, пока клеточная мембрана не разрыва­ется, а внутренняя часть клетки выбрасывается во вне­клеточное пространство, образуя NETs [25].

Эти противомикробные стратегии до настоящего времени считались единственной функцией нейтро- филов. Однако недавние исследования биологии этих клеток показали, что они обладают разнообразным набором функциональных реакций, которые выходят за рамки простого уничтожения микроорганизмов [17, 18, 25].

Широкий спектр функциональных ответов нейтро- филов индуцируется активацией транскрипции и из­менениями в экспрессии поверхностных молекул и их активности. Эти фенотипические изменения обычно обнаруживаются только в подгруппе нейтрофилов, что позволяет предположить наличие гетерогенных фенотипов этих клеток [3, 17, 19, 26].

Теория гетерогенности нейтрофилов зародилась бо­лее 50 лет назад, когда была предложена концепция маргинального пула нейтрофилов [4, 19, 27], либо при­крепленных к сосудам, либо находящихся полностью вне циркуляционного русла. Они могут быть мобили­зованы при стимуляции [5, 28]. Эксперименты прово­дились с использованием радиоактивной метки нейтрофилов и помогли определить в качестве резервуаров для них селезенку, печень и костный мозг, так как тре­буется меньше времени для прохождения через эти ор­ганы. Вопрос о легких в качестве резервуара для нейтрофилов остается открытым [12, 26, 29]. При оценке гетерогенности нейтрофилов могут быть исследованы такие параметры, как функции клеток, маркеры кле­точной поверхности, зрелость, плотность и локализа­ция. Концепция подмножества нейтрофилов справед­лива при заболевании раком, инфекционном процессе, аутоиммунитете, воспалении и репарации [27, 28].

В нормальных условиях нейтрофилы остаются в кровообращении всего несколько часов, прежде чем начинают мигрировать в ткани [30]. В течение этого времени нейтрофилы, по-видимому, меняют свой фе­нотип. Наблюдения каждые 4 часа за циркулирующи­ми у здоровых мышей нейтрофилами в течение дня, показали, что эти клетки меняют свою морфологию и фенотип [21, 30, 31].

Известно много описанных фенотипов нейтрофилов, но в литературе приводится отличная друг от друга информация, поскольку в каждом опыте исследовались разные функции, использовались различные методы изучения, виды ткани, биомаркеры [32, 33].

J.M. Adrover и соавт. [22] обратили внимание на циркадные ритмы изменения функционализации нейтрофилов. Недавно вышедшие из костного мозга нейтрофилы («свежие» клетки) претерпевали несколь­ко метаболических изменений, которые накаплива­лись до начала миграции из кровотока в ткани. Авто­ры назвали эти изменения в фенотипе гранулоцитов в отсутствие воспаления старением [22].

Нейтрофилы считаются дифференцированными клетками, которые прогрессируют от незрелых форм в костном мозге до циркуляции зрелых неактивных клеток. При последующей активации во время вос­палительных состояний они перемещаются из сосу­дов в ткани и выполняют свои функции (например фагоцитоз, производство активных форм кислорода и уничтожение бактерий) [34]. Нейтрофилы могут быстро изменять свои характеристики и манеру пове­дения по мере активации, созревания или изменения внешней среды [35]. Кроме того, активность нейтро- филов в ответ на различные медиаторы при остром или хроническом воспалительном процессе может продлить жизнь клетки, дать возможность произвести альтернативные эффекторные и иммунорегуляторные молекулы [34, 35].

Наконец, нейтрофилы играют совершенно полярные роли в различных врожденных иммунных реакциях, возникающих в ответ на стерильную травму, инфекцию, рак, а также в реакциях аутоиммунитета. Поэтому не­удивительно, что нейтрофилы с многочисленными раз­новекторными функциями были идентифицированы в последние годы в разных условиях [33, 36, 37].

Такая пластичность функций нейтрофилов, отмечен­ная и российскими учеными [32], побудила исследо­вателей изучить область фенотипической и функцио­нальной гетерогенности нейтрофилов, как это было сделано для лимфоцитов [38]. Появилась возможность вычленить регуляторные, супрессорные, провоспали- тельные, воспалительные, противоопухолевые, про- опухолевые и гибридные субпопуляции нейтрофилов [39]. Помимо классического антагонистического уча­стия в антимикробных реакциях, нейтрофилы также играют значительную роль в модуляции различных типов раковых опухолей.

В вопросах влияния на опухолевый процесс нейтрофилы в течение длительного времени были обделены вниманием исследователей по сравнению с другими иммунокомпетентными клетками [39, 40]. Одной из причин этого, по-видимому, является небольшая продолжительность жизни гранулоцитов, которая, как считалось, слишком мала (в среднем 7 ч в циркулирующей крови и еще около 5 суток в тканях), чтобы влиять на прогрессию рака [41].

Однако в публикации М. Kurashige и соавт. [41] были подтверждены результаты экспериментальных иссле­дований Y. Sawanobori и соавт. [42] с использованием молекулярных маркеров, которые позволили пересмо­треть и эти фундаментальные положения [41, 42].

Экспериментальные исследования, выполненные на животных, показали, что продолжительность жиз­ни тканевых нейтрофилов увеличивается на несколь­ко дней в опухолях, микроокружение которых способ­ствует их выживанию как локально, так и системно. Установлено, что средний период продолжительности жизни циркулирующих нейтрофилов у больных ра­ком увеличен до 5,4 дня [44, 45], что более чем в 20 раз больше, чем было обнаружено ранее [44], и расцене­но исследователями как следствие передачи сигналов опухолевыми цитокинами на Г-КСФ [42].

Использование современных молекулярно-генетиче­ских инструментов позволило получить новые данные об участии ПМН на всех стадиях процесса канцероге­неза: от инициации опухолевого генотипа до инвазив­ного роста и метастазирования злокачественной опу­холи [39, 40, 46]. По результатам этих исследований установили ведущую роль нейтрофилов в канцероге­незе, связанную с их способностью изменять поведе­ние других иммунокомпетентных клеток в развитии опухолевого процесса [46].

Изменения функций нейтрофилов и их фенотипи­ческая гетерогенность при раке являются в насто­ящее время наиболее изученными и наиболее инте­ресными метаморфозами. Эти клетки крови играют важную и противоречивую роль в развитии раковых опухолей, что отражено в ряде современных обзоров [39, 40, 43, 46-49].

Этот функциональный дуализм нейтрофилов по от­ношению к опухолям в течение длительного времени был предметом споров, в которых оппоненты приво­дили убедительные доказательства в пользу как про-, так и противоопухолевой роли этих гранулоцитов. Это привело к возникновению гипотезы о неоднородности популяции ПМН и существовании нескольких субпо­пуляций, функции которых при раковых опухолях мо­гут значительно отличаться. На всех этапах развития рака нейтрофилы формируют разные клеточные фено­типы, которые выполняют разновекторные функции. Установлено, что эти гранулоциты в организме опосре­дуют про- (клеточный фенотип N2) и противоопухоле­вые реакции (фенотип N1), которые вызывают прогрес­сию или ингибирование опухолевых клеток [47, 48].

С одной стороны, клетки N2 способствуют росту опухоли [39, 47], ангиогенезу — новообразованию в опухоли сети кровеносных сосудов [49] и активи­руют метастазирование опухолевых клеток [48], ин­дуцируя иммунодепрессию [40] и инициируя под­готовку тканей к раковой колонизации — создание предметастатической ниши [50]. С другой стороны, клетки N1 проявляют противоопухолевую актив­ность, уничтожая раковые клетки непосредственно [51, 52] либо через антителозависимую цитотоксич­ность, ограничивающую распространение опухоли [33, 40, 46].

Индукция этих фенотипов ПМН регулируется сигналами, исходящими от раковых или стромаль- ных клеток из микроокружения опухоли, связана как с местными, так и системными реакциями и в на­стоящее время является предметом пристального вни­мания и изучения исследователей [33, 39, 46, 49].

Мы сосредоточимся на регуляции поведения ПМН сигналами, исходящими из микроокружения опухо­ли, а также на диагностическом и терапевтическом потенциале гетерогенных фенотипов миелоидных клеток. Чем же обусловлен этот функциональный ду­ализм нейтрофилов по отношению к раковым опухо­лям? В последние годы установлено, что вектор про- опухолевой активности этих клеток зависит от двух условных типов подмножеств ПМН в зависимости от их плотности: высокой (HDN, от англ. high density neutrophils), обеспечивающих противоопухолевую за­щиту организма (соответствует фенотипу N1), и низ­кой (LDN, low density neutrophils) — с проопухолевой и иммунодепрессирующей активностью (соответству­ет фенотипу N2), а также отношением этих клеточных фенотипов [53-56].

В практике выделения нейтрофильных кластеров HDN и LDN для последующего изучения их функ­циональных характеристик применяются несколько протоколов, включающих в себя сбор и очистку клеток крови человека или мыши [53, 55, 56] (рис. 2). В ос­нове всех методов — выделение гранулоцитов путем градиентного центрифугирования разведенной пери­ферической крови (1:5) с полисахаридами соответст­вующей плотности (Histopaque-1077, перколл или фи- колл — 3 мл). Кровь забирается с гепаринатом лития, эритроциты перед центрифугированием лизируются. Центрифугирование проводится при 1600 g в течение 20 мин (1000 g /30 мин) [53, 57].

От вариаций протоколов зависит чистота выделенных клеточных фракций HDN и LDN, которые могут быть дополнительно обогащены при использовании специфических нейтрофильных антител, магнитных бус и разделительных колонок [53, 55, 56].

В последние годы интерес к субпопуляциям высокой и низкой плотности в контексте их проопухолевой активности значительно увеличился, появляется все больше данных о важной роли этих клеточных фенотипов в биологии опухолевого роста, а также механизмах регуляции раковыми клетками индукции N2-нейтрофилов [39, 53, 58, 59].

В связи с этим концепции о терминальной дифференцировке ПМН и их функциях, ограниченных антимикробной защитой и участием в воспалениях, постепенно пересматриваются [39, 47-49, 53, 59, 60]. Например, было установлено [53, 59], что у здоровых мышей более 95 % нейтрофилов в крови представлены клетками высокой плотности (N1), в то время как при возникновении злокачественной опухоли (рак молочной железы, легких, мезотелиома) у них возникала активная генерация нейтрофилов низкой плотности (N2), которые становились доминирующей циркулирующей субпопуляцией. При этом в костном мозге было достаточно много HDN, и увеличение соотношения субпопуляций в пользу LDN не было следствием простого медуллярного истощения клеток высокой плотности [53].

Аналогичная картина наблюдалась и у больных опу­холями различной локализации. При этом и у мышей, и у людей доминирующая субпопуляция LDN была неоднородной и состояла из зрелых и незрелых кле­ток, в то время как фенотип HDN был однородным и представлен только зрелыми клетками [49, 53].

Механизмы, с помощью которых опухоли индуци­руют N2-нейтропоэз, до конца не изучены, хотя в ряде исследований была показана активация клеток-пред- шественников гранулопоэза (ГМ-КСФ и Г-КСФ) и про­гностическое значение отношения численности LDN- кластера гранулоцитов к лимфоцитам при нескольких типах злокачественных новообразований [51, 52].

Недавние исследования R. Kanamaru и соавт. [9] по­казали, что внеклеточные ловушки (NETs), высвобо­жденные нейтрофилами LDN-кластера, выделенными из перитонеального лаважа у больных, прооперирован­ных по поводу рака желудка, не только не уничтожали свободные раковые клетки, но и активировали их про­лиферацию после прикрепления к NETs [9].

Один из механизмов индукции образования N2-нейтрофилов, выявленный указанными исследователями, связан со стимулирующим влиянием микроокруже­ния опухоли, точнее, с трансформирующим фактором роста-β, который индуцирует созревание в костном мозге и миграцию в ткани проопухолевого фенотипа нейтрофилов N2, изменяя локальное соотношение гранулоцитов N2:N1 в пользу первых.

Функциональная дифференциация нейтрофилов приводит к появлению различных фенотипов под вли­янием конкретных опухолевых факторов, среди кото­рых наиболее изученными являются трансформирую­щий фактор роста-β, Г-КСФ и интерферон-β.

Таким образом, в дополнение к классическим ан­тимикробным стратегиям, в последние годы был охарактеризован ряд других функций нейтрофилов, что вызвало большой интерес врачей и биологов в мире. Многочисленные свидетельства того, что раз­ные фенотипы нейтрофилов обнаружены в различных тканях и при различных патологических состояниях, позволяют предположить, что действительно сущест­вуют подмножества нейтрофилов [39, 47—49, 53, 59]. Однако отсутствие прямых экспериментальных дока­зательств, основанных на многократных исследовани­ях, не дает основания утверждать о наличии гетеро­генных подгрупп нейтрофилов. Поэтому большинство практикующих врачей и гематологов считают этот клеточный пул относительно гомогенной популяцией с минимальным фенотипическим и функциональным разнообразием [48, 49, 57, 58]. Среди причин этого за­блуждения тот факт, что исследования нейтрофилов все еще в значительной степени определяются их мор­фологией [59, 60].

Недавно выявленные с помощью градиентного цент­рифугирования факты наличия нейтрофилов разной плотности и их разновекторного участия в физиологи­ческих и патологических состояниях организма, воз­можно, вызовут смену парадигмы о функциональной гомогенности нейтрофилов [50].

Пока же приведенные в обзоре результаты исследо­ваний вызывают ряд вопросов относительно феноти­пической специализации нейтрофилов. Бывают ли эти клетки запрограммированными на определенный фе­нотип уже до выхода из костного мозга в перифериче­скую кровь, или высокая пластичность позволяет им трансформироваться в определенные субпопуляции уже в тканях? Возможно ли перепрограммировать уже имеющиеся фенотипы? По-прежнему остается актуальной проблема поиска надежных молекуляр­ных маркеров, позволяющих эффективно дифферен­цировать фенотипы нейтрофилов, установить степень их диагностической специфичности при различных патологиях. И, наконец, обозначить перспективы оп­ределения нейтрофилов как терапевтической страте­гии в иммунопатологии. В любом случае, полученные результаты выявляют потенциальные направления, на которые могут быть направлены терапевтические и диагностические стратегии усиления противоопухо­левой нейтрофильной активности для раннего выявле­ния и ограничения опухолевого роста.