При проведении трансфузий эритроцитсодержащих компонентов могут возникать проблемы, обусловлен­ные присутствием в крови реципиентов и доноров аллоиммунных антиэритроцитарных антител (антител, синтезируемых при попадании в кровь данного лица внешнего чужеродного эритроцитарного антигена, т.е. антигена, которого нет на эритроцитах этого челове­ка) и/или аутоиммунных антиэритроцитарных анти­тел (антител, синтезируемых при ряде заболеваний против собственных антигенов эритроцитов данно­го человека) [1—3]. Аллоантитела нередко являются клинически значимыми, так как могут вызывать ге­молиз донорских эритроцитов. При этом аллоанти­тела разных специфичностей имеют разные свойст­ва, что требует дифференцированного подхода к их детекции. Аутоантитела, вызывая панагглютинацию, могут затруднять определение группы крови и ре­зус-фенотипа, маскировать присутствие аллоантител. Предтрансфузионные скрининг и идентификация антиэритроцитарных аллоантител, их дифференциров- ка от аутоантител и на этой основе подбор совмести­мой донорской крови необходимы для профилактики посттрансфузионных реакций и осложнений [4—6]. Автором совместно с сотрудниками были проведены исследования антител у более чем 200 тысяч больных и более чем 100 тысяч доноров. Результаты исследова­ний опубликованы ранее [7, 8].

Цель работы — составить алгоритмы предтрансфузионного иммуногематологического тестирова­ния. Разработанные алгоритмы будут способствовать повышению качества иммуносерологического об­следования и снижению риска развития иммунных посттрансфузионных реакций и осложнений после ге­мотрансфузий.

Клинически значимыми антиэритроцитарными аллоантителами являются такие антитела, которые приводят к уменьшению срока жизни донорских эри­троцитов или могут быть причиной гемолитическо­го трансфузионного осложнения (ГТО). Некоторые аллоантитела вызывают разрушение несовместимых эритроцитов в течение нескольких часов или минут (острый гемолиз), другие снижают продолжительность жизни эритроцитов на несколько дней (отсроченный гемолиз), третьи не влияют на срок жизни перелитых эритроцитов. То же касается и антител при гемолити­ческой болезни плода и новорожденного (ГБН): одни могут стать причиной ГБН, другие дают положитель­ный прямой антиглобулиновый тест (ПАГТ) у плода при отсутствии клинической картины, а третьи во­обще не вызывают этого патологического состояния. Важнейшими трансфузионно опасными антигена­ми эритроцитов являются антигены систем АВО, Rh (прежде всего D и c), а также антиген K системы Kell. К антигенам некоторых других антигенных систем эритроцитов (Kidd, Duffy и др.) также могут выраба­тываться клинически значимые антитела [9, 10].

При поиске эритроцитарных антител необходимо учитывать их принадлежность к классу и субклассу иммуноглобулинов. Антиэритроцитарные антитела могут быть иммуноглобулинами классов IgM, IgG, IgA и субклассами IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 [2, 11, 12]. Важно учитывать также различия физических и химических свойств разных антител [9, 13—15]. К таким показате­лям относится температурный оптимум реагирования. Некоторые антитела можно обнаружить при помощи антиглобулиновых сывороток в непрямом антиглобулиновом тесте (НАГТ) разной модификации, другие выявляются лишь на холоде в реакции солевой агглю­тинации. Существуют антитела, которые становятся биологически активными только в кислой среде или же после добавления к ним свежей сыворотки, содержащей комплемент. Некоторые антитела можно обнаружить после обработки эритроцитов ферментами (папаином, бромелином и др.) или в присутствии раствора низкой ионной силы (РНИС-LISS (low ionic strength solution).

При определении аллоантител должен быть выпол­нен ряд требований:

А.      Образец крови должен быть взят не более чем за 2 дня до исследования и храниться при температуре +4...+8 °С.

Б. Тест может быть выполнен как с сывороткой, так и с плазмой, но при использовании плазмы существует опасность не выявления слабоактивных антител из-за разведения стабилизирующим раствором.

В.    Гемолизированная и хилезная кровь не использу­ются.

Методы, применяемые для скрининга антител, должны выявлять все клинически значимые антитела и включать:

А.    для выявления неполных антител:

Б. для выявления полных антител:

Для скрининга должна применяться панель стандарт­ных эритроцитов, включающая не менее 3 видов стан­дартных эритроцитов, содержащих все трансфузион­но опасные антигены в гомозиготном состоянии.

Для установления специфичности антител, выявлен­ных при первичном скрининге, необходимо использо­вать панель стандартных эритроцитов, включающую не менее 11 образцов. Применяются те же методы, что и для скрининга антител.

Если в анамнезе у больного уже обнаруживались аллоиммунные антитела какой-либо специфичности, каждый раз перед предполагаемой трансфузией необ­ходимо перепроверять специфичность, чтобы исклю­чать присутствие антител, которые могли выработать­ся дополнительно.

Для идентификации антиэритроцитарных антител необходим выбор адекватных методов исследования с учетом различия свойств разных антител. Например, антитела системы Duffy, Kidd не выявляются методом агглютинации в солевой среде, в полиглюкиновом и желатиновом тестах, но хорошо определяются в не­прямом антиглобулиновом тесте в геле [11, 13]. Совре­менные данные об эффективности различных методов в исследовании антител различных специфичностей представлены в таблице 1.

Основным тестом, позволяющим обнаружить все клинически значимые аллоантитела в исследуемой сыворотке, является непрямой антиглобулиновый тест, в том числе в гелевом методе.

Для скрининга аллоантител в непрямом антиглобулиновом тесте могут быть использованы гелевые карты ID Card Liss/Coombs, ID Card IgG фирмы GRIFOLS (Испания). Для первичного скрининга антител могут применяться стандартные эритроциты Seraskan Diana GRIFOLS I+II+III+IV (фенотипы: CCDee; ccDEE; ccdee; CwCDee). Идентификацию антител можно про­водить в том числе в гелевых картах Liss/Coombs, ID Card IgG с использованием 15 образцов стандартных эритроцитов (фирма GRIFOLS), фенотипированных по 36 антигенам.

Аутоконтроль — тест на взаимодействие сыворот­ки и эритроцитов исследуемой крови. При скрининге и идентификации аллоантител аутоконтроль необхо­димо проводить во всех случаях. В норме сыворотка крови не может вызывать агглютинацию собственных эритроцитов. Отрицательный аутоконтроль при опре­делении аллоантител подтверждает специфичность реакций исследуемой сыворотки с тестовыми эритро­цитами. Положительный аутоконтроль доказывает присутствие в тестируемой крови аутоантител. В этом случае следует проверить, есть ли в крови кроме ау­тоантител также и аллоантитела, т.е. провести дифференцировку (иногда аутоконтроль позволяет сделать предварительные предположения по этому вопросу путем сравнения реакции агглютинации с аутологич­ными и стандартными эритроцитами).

Прямой антиглобулиновый тест, в том числе в геле, проводят для определения фиксированных на поверх­ности эритроцитов антител и/или компонентов ком­племента. Положительный результат ПАГТ бывает при недавно проведенных трансфузиях эритроцитсодер­жащих компонентов, трансплантации гемопоэтических стволовых клеток или солидных органов, при гемоли­тической болезни плода и новорожденного (вследствие присутствия у матери аллоантител IgG класса, про­ходящих через плаценту), наличии антител, направ­ленных к лекарственным препаратам, при некоторых аутоиммунных заболеваниях и др. Наиболее часто как самостоятельное исследование ПАГТ применяется для выявления неполных аутоантител на эритроцитах при аутоиммунных гемолитических анемиях.

а) проверить качество реагентов: срок годности, нали­чие гемолиза стандартных эритроцитов, карты Кумбса (не высох ли гель);

б) центрифугирование выполнять строго по инструк­ции;

в) соблюдать регламентированное соотношение сыво­ротки и тест-эритроцитов.

а) при исследовании антител низкой активности (если реакция была на 1+, 2+) использовать избыток антител по отношению к эритроцитам;

б) увеличить время инкубации;

в) повторить скрининг антител в непрямом антиглобу- линовом тесте, если ранее применялся другой метод;

г)    повысить уровень экспрессии антигенов стандарт­ных эритроцитов, проведя энзимирование тестовых эритроцитов растворами протеолитических фермен­тов (бромелин, папаин), РНИС (необходимо учиты­вать, что некоторые эритроцитарные антигены при об­работке ферментом могут быть разрушены, например Fya, Fyb, S, вследствие чего возможен ложноотрица­тельный результат);

д)    учитывать возможность появления комплементсвязывающих антител (например к системам Rh, Duffy, U, Kidd); если ранее скрининг и идентификацию про­водили в гелевых картах с Anti-IgG, провести повтор­ное исследование в картах Anti-IgG + комплемент (DG Gel LISS/Coombs).

Сложные проблемы при идентификации аллоантител могут возникать, если в сыворотке крови содержатся антитела разных специфичностей (две или более разновидности антител) или если имеет место эффект «дозы» антигена (как отмечалось ранее, некоторые виды антител, например антитела к антигенам систем Kidd, Duffy, MNS, вызывают слабую реакцию при гетерозиготности тест-эритроцитов по данным антигенам).

В связи с этим врач должен помнить ряд правил:

Для идентификации антител разных специфично­стей можно выполнить несколько процедур.

При невозможности идентификации аллоантител необходимо провести прямой антиглобулиновый тест и аутоконтроль. Положительный ПАГТ свидетельствует о наличии фиксированных на эритроцитах аутоантител, положительный аутоконтроль свидетельствует о нали­чии аутоантител в сыворотке. Аутоантитела могут быть как специфическими, так и неспецифическими.

Положительный прямой антиглобулиновый тест (реакция эритроцитов исследуемой крови с антиглобулиновыми сыворотками) может предоставить цен­ную информацию о реципиенте. ПАГТ может стать положительным по целому ряду причин:

А.    Если реципиенту были перелиты несовместимые донорские эритроциты. При развитии аллоиммуни­зации и гемолитической трансфузионной реакции (посттрансфузионного осложнения) у реципиента в первые часы (дни) после гемотрансфузии НАГТ мо­жет оставаться отрицательным, так как антител еще мало и они все фиксируются на донорских эритроци­тах, не оставаясь в плазме, вследствие чего ПАГТ ста­новится положительным раньше, чем НАГТ.

Б. При трансплантации костного мозга или солид­ных органов лимфоциты, передающиеся с трансплан­татом, могут вырабатывать антитела, направленные против антигенов системы АВО и других антигенных систем эритроцитов реципиента (чаще всего это бы­вает при несовместимых по ABO трансплантациях). Фиксация антител на эритроцитах реципиента может сопровождаться появлением положительного ПАГТ, а иногда даже приводит к гемолитическому кризу.

В.    При аутоиммунной гемолитической анемии. Если у реципиента в анамнезе нет трансфузий эритроцитсо­держащих компонентов, у него могут быть аутоантите­ла, фиксированные на собственных эритроцитах. Это будет влиять на интерпретацию результатов серологи­ческого тестирования реципиента и проб на совмести­мость. Аутоантитела могут «маскировать» клинически значимые аллоантитела, поэтому важно различать ауто- и аллоантитела [1, 2, 17]. В этом, в частности, могут помочь лабораторные данные о признаках ге­молиза и анамнестические сведения о заболеваниях, при которых возможно развитие аутоиммунных про­цессов: системная красная волчанка, антикардиоли- пиновый синдром, лимфопролиферативные заболева­ния (хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфома и др.), злокачественные новообразования.

Г. В сыворотке исследуемой крови могут содержаться им­мунные комплексы различных специфичностей, не име­ющие отношения к эритроцитарным антигенам, которые могут активировать компоненты комплемента, неспеци­фически адсорбируемые на эритроциты. Но могут быть и комплементсвязывающие антитела, специфичные по от­ношению к какому-либо эритроцитарному антигену.

Д. У реципиентов, принимающих лекарственные препараты, возможно появление ассоциированного с приемом лекарств положительного ПАГТ, в основе чего лежат 4 механизма: адсорбция лекарственных препаратов (пенициллины), образование иммунно­го комплекса (хинидин, тетрациклин, хлорпромазин, р-аминосалициловая ксилота и др.), образование ле­карственных аутоантител (метилдопа, леводопа, про- каинамид, диклофенак, интерферон и др.) и неспеци­фическая адсорбция (цефалотин и др.).

С учетом этих факторов, целесообразным представ­ляется следующий алгоритм действий при положи­тельном ПАГТ:

Б. Выполнялась ли больному трансплантация костно­го мозга или солидных органов?

Г. Принимает ли больной лекарственные препараты: хинидин, прокаинамид, α-метилдопа, антибиотики (пенициллин, цефалоспорины), антилимфоцитарный или антимоноцитарный иммуноглобулины и др.?

В зависимости от конкретной причины (патоло­гического состояния) ПАГТ может быть положи­тельным с одними антиглобулиновыми реагентами и отрицательным с другими, что можно использовать для дифференциальной диагностики. В таблице 2 представлены результаты, которые можно получить при использовании моно- и полиспецифических антиглобулиновых реактивов [2, 9].

Фиксированные на эритроцитах антитела при элю- ции высвобождаются с поверхности сенсибилизиро­ванных эритроцитов в функционально активной фор­ме и поэтому могут быть идентифицированы. Принцип элюции — разрыв нековалентных связей, удерживаю­щих комплексы «антиген—антитело» на поверхности эритроцитов. Это может быть достигнуто нагревани­ем, замораживанием-оттаиванием, использованием кислот. Скрининг и идентификацию антител проводят с элюатом. Можно увеличить реактивность элюата, те­стируя его с энзимированными эритроцитами скри­нинговой или идентификационной панели (но следует помнить, что некоторые антигены эритроцитов разру­шаются ферментами).

Если причиной положительного ПАГТ является ГТР или ГБН, то в элюате обычно удается детектиро­вать специфические антитела, их же обнаруживают в сыворотке реципиента или в сыворотке крови матери (иногда реакция в НАГТ может быть слабой).

Если элюат реагирует со всеми тестовыми эритроци­тами, вероятной причиной этого являются аутоантитела.

В случае положительного ПАГТ, если в сыворотке не обнаружено аллоантител (НАГТ отрицательный) и больному не проводились трансфузии эритроцитсо­держащих компонентов в течение последних 2 меся­цев, можно сделать вывод о присутствии только ауто­антител. Дальнейшие исследования этих аутоантител проводить не нужно.

III. Алгоритм действий при положительном ауто­контроле (НАГТ и ПАГТ — положительные или от­рицательные)

Положительный аутоконтроль позволяет отличить аутоантитела от специфических аллоантител. Если проба проводится при комнатной или более низкой температурах, положительный результат позволяет предположить присутствие в исследуемой крови холо­довых аутоантител, которые, вызывая при рутинных исследованиях панагглютинацию, могут приводить к ошибочным заключениям о группе системы АВО и резус-фенотипах, а также иногда маскировать кли­нически значимые антитела (IgG). Тепловые аутоан­титела активны при более высокой температуре. При­сутствие в сыворотке тепловых аутоантител может затруднить детекцию аллоантител и интерпретацию проб на совместимость.

При положительном аутоконтроле для дальнейшего исследования на возможное наличие аллоантител не­обходимо удалить или снизить активность неспецифи­ческих аутоантител в исследуемой сыворотке. С этой целью применяются различные методы адсорбции.

Необходимо прежде всего выяснить трансфузионный анамнез реципиента:

а) процедура предварительного нагревания, когда те­стируемые сыворотки и эритроциты инкубируются при температуре 30—37 °С перед их смешиванием;

б) использование моноспецифической АГС с анти- IgG антителами вместо полиспецифической антигло- булиновой сыворотки;

в) холодовая аутоадсорбция для удаления холодовых аутоантител;

г) нейтрализация холодовых антител, для чего могут быть использованы следующие вещества: субстанция P1, субстанция Lea и Leb (растворимый антиген, обнаруженный в плазме и слюне), субстанция I (можно найти в грудном молоке), субстанция Sda, полученная из мочи человека или морской свинки.

Аутоадсорбция не проводится, если больному про­водились трансфузии эритроцитсодержащих компо­нентов в течение последних 2 месяцев и в исследуе­мом образце отмечается положительный ПАГТ, часто с появлением смешанной агглютинации. В этом слу­чае целесообразно провести элюцию, особенно если при идентификации антител получают неопределен­ные результаты. В этом случае аутоконтроль у боль­ного может быть положительным, а сыворотка может реагировать слабоположительно с большинством те­стовых клеток.

Если ПАГТ и НАГТ положительны со всеми те­стируемыми клетками, необходимо провести алло­адсорбцию. Методы аллогенной адсорбции предпоч­тительны для определения аллоантител у больных, которым в течении последних 2—4 месяцев проводи­лись трансфузии эритроцитсодержащих компонентов. При аллоадсорбции, поскольку специфичность алло­антител неизвестна, сыворотка разливается на алик­воты, и для адсорбции разных аликвот используются эритроциты нескольких фенотипов. Если известен фе­нотип реципиента, число подбираемых эритроцитов для адсорбции можно сократить.

Были разработаны схемы, определяющие алгоритм действий врача-лаборанта, врача-трансфузиолога при возникающих проблемах серологического тести­рования (рис. 1, 2).

Пример 1. Больная О., ИБ № 111827, 81 год. Посту­пила с жалобами на периодические боли в правом подреберье, слабость в течение последней недели, кожный зуд. В течение последнего месяца отмечала желтушность кожных покровов. Цвет кала и мочи, со слов больной, не менялись. Температура тела оста­валась нормальной. В анамнезе — холецистэктомия в 1995 г. Гемотрансфузии отрицала. Акушерский анамнез: 10 беременностей, 2 родов, 8 медицинских абортов. Больной в связи с нормоцитарной гипохром- ной анемией (эритроциты 2,1х1012/л, гемоглобин 48 г/л, гематокрит 19,4) показано переливание эритроцит­содержащих компонентов крови. Было выполнено стандартное иммуногематологическое обследование больной: определена группа крови по системам АВО и резус, проведен скрининг антител в гелевых картах в НАГТ(I–IV). Сыворотка больной агглютинировала все стандартные эритроциты, силу реакции оценили на 3+. Идентифицировать антитела не удалось, так как сыворотка больной агглютинировала все стан­дартные клетки (I—XV), на 3+. На собственных эри­троцитах выявлены фиксированные антитела: ПАГТ 4+, класс иммуноглобулинов IgG. Реакция собствен­ной сыворотки с аутологичными эритроцитами (ау­токонтроль) была положительной на 4+. Проведены дополнительные клинико-лабораторные исследования для выявления причины анемии. В анализах крови были идентифицированы признаки гемолиза: ретикулоциты 18,3 % (норма 0,20—2,05), или 312,3х109/л (норма 7,00—104,50), гипербилирубинемия (билирубин общий 103,5 мкмоль/л, билирубин непрямой 94,2 мкмоль/л), лактатдегидрогеназа 1212,00 ед/л. Кроме того, был выявлен дефицит витамина В12 —  111,00 пмоль/л (норма 142,00—725,00). На основании результатов вы­полненных исследований был установлен диагноз: аутоиммунная гемолитическая анемия с тепловыми антиэритроцитарными антителами класса IgG, В -де­фицитная анемия. Отсутствие в течение 2 месяцев трансфузий эритроцитсодержащих компонентов по­зволило выполнить адсорбцию тепловых аутоантител собственными эритроцитами больной (аутологичная адсорбция). Скрининг аллоиммунных антител был выполнен после проведения аутоадсорбции сыворотки в НАГТ (I—IV). Был получен отрицательный резуль­тат, свидетельствующий об отсутствии аллоиммунных антител у больной. Пробы на совместимость с донор­скими эритроцитами были проведены с сывороткой после аутоадсорбции. Подобранные 4 дозы аллогенных эритроцитов были перелиты без осложнений.

Пример 2. Больной Л., 31 год. Диагноз: Гемоли­тическая анемия неясного генеза, спленомегалия. В анамнезе было переливание донорских эритро­цитов за 3 недели до обследования. Планировалась спленэктомия. Были выполнено стандартное иммуно- гематологическое обследование больного: определена группа крови систем АВО и Резус, проведен скрининг антител в гелевых картах в НАГТ(I–IV). Сыворотка больного агглютинировала все стандартные эритро­циты, силу реакции оценили на 4+. Идентифициро­вать специфичность антител не удалось, так как сы­воротка больного агглютинировала все стандартные клетки (I-XV) на 4+. На собственных эритроцитах выявлены фиксированные антитела: ПАГТ 4+, класс иммуноглобулинов IgG. Реакция собственной сы­воротки с аутологичными эритроцитами (аутокон­троль) была положительной на 4+. Для проведения аллогенной адсорбции, учитывая недавнюю трансфу­зию эритроцитсодержащих компонентов, определяли расширенный фенотип реципиента по клинически значимым антигенам систем Rh, Kell, Duffy Kidd, MNS, Lutheran, Lewis, P. Фенотип был определен как: D+, С+, с+, Е-, е+, К-, k+, Kpa-, Kpb+, S+, s+, Fya+, Fyb+, Lea-, Leb+, P1+, Lua-, Jka +, Jkb +, антигены M, N, Lub определить не удалось, т. к. выявлены две популяции эритроцитов. Проводили адсорбцию сыворотки боль­ного донорскими эритроцитами (аллогенная адсорб­ция), учитывая результаты расширенного фенотипирования. Оценить результаты аллогенной адсорбции не представлялось возможным из-за гемолизиро- ванной сыворотки больного. Тогда была проведена тепловая элюция фиксированных на аутологичных эритроцитах антител. С полученным элюатом был выполнен скрининг антиэритроцитарных антител со стандартными эритроцитами I-IV при температуре 37 °С, были выявлены аллоиммунные антитела. Спе­цифичность выявленных аллоантител определена с помощью 15-клеточной панели стандартных эри­троцитов как анти-М, -S. Из базы данных банка за­мороженных донорских эритроцитов были подобра­ны донорские эритроциты, не содержащие антигены М и S. Перед трансфузией пробы на совместимость были проведены с элюатом, результаты которых были отрицательные, то есть совместимы с донорскими эритроцитами. Проведена трансфузия эритроцитсо­держащих компонентов без осложнений.

Таким образом, целью предтрансфузионного те­стирования реципиентов и доноров является подбор совместимых компонентов донорской крови, который может представлять трудности, обусловленные забо­леванием больного, особенностями его генетической или иммунной системы, влиянием различных анам­нестических факторов (беременностей, предыдущих гемотрансфузий и др.). Врач-иммуногематолог должен максимально полно провести иммуносерологические исследования перед трансфузией, чтобы избежать возможных осложнений. Представленные в настоящей работе алгоритмы помогут систематизировать дейст­вия по повышению иммунологической безопасности трансфузионной терапии.