Болезнь Виллебранда (БВ) относится к наиболее распространенным наследственным коагулопатиям. По результатам эпидемиологического исследова­ния [1], частота встречаемости индивидов со снижен­ной плазменной активностью фактора Виллебранда в различных популяциях может достигать 1 %, хотя по оценкам специализированных медицинских цен­тров, основанным на данных комплексного анализа, включающего коагулогические и генетические тесты, частота встречаемости БВ не превышает 1:10 000 [2]. Заболевание вызывается дефицитом или структур­но-функциональными нарушениями фактора фон Виллебранда (vWF) — крупного мультимерного гли­копротеина, играющего важную роль в поддержании гемостаза. Разные домены этого белка взаимодейству­ют с фактором свертывания крови VIII (FVIII), гли­копротеинами на поверхности тромбоцитов и коллаге­ном [3]. Ген vWF локализован в прителомерной области короткого плеча 12-й хромосомы (12p13.31), занимает на ней около 178 тпн и состоит из 52 экзонов [4]. Суще­ствует также частичная копия этого гена — непроцессированный псевдоген на длинном плече хромосомы 22 (22q11—13), включающий экзоны 23—34 и имеющий гомологию с геном 97 % [5].

Различают первый, второй и третий типы БВ, при­чем для второго типа выделяют также четыре подтипа заболевания (2A, 2B, 2M и 2N) [6]. Общая и диффе­ренциальная (по типам) диагностика БВ осуществля­ется на основе определения клинического, лаборатор­ного и молекулярного фенотипов. Геморрагический синдром преимущественно по микроциркуляторному типу варьирует в широких пределах — от легких, малосимптомных, до тяжелых клинических форм. Фенотипы БВ во многом определяются генетическим фоном и зависят от типа мутации, степени экспрессии гена, а также остаточной функциональной активности гликопротеина. В этой связи внутри каждого типа БВ могут наблюдаться субпопуляции с тяжелыми или бо­лее легкими проявлениями [7]. При тяжелых формах, преимущественно 3-м типе БВ, помимо кровоточиво­сти из слизистых оболочек, могут возникать гемартро­зы. Однако данные о частоте артропатии при БВ не­многочисленны [8—10].

При коагулогическом исследовании оценивают ан­тиген vWF (vWF:Ag), активность FVIII (FVIII:C) (она снижается, если снижена активность vWF) и ристоцетин-кофакторную активность (vWF:RCo). Для уточ­нения типа заболевания исследуют агрегацию тром­боцитов, индуцированную ристоцетином, и профиль мультимеров vWF с помощью электрофореза в агароз­ном геле.

Наиболее распространена БВ 1-го типа, она состав­ляет от 55 до 70 % всех диагностированных случаев. Чаще всего при этом варианте заболевания наблю­дается снижение количества vWF без нарушения его функций. Самая редкая (1—3 %) и тяжелая форма БВ 3-го типа характеризуется практически полным от­сутствием vWF. Поскольку одной из функций vWF является связывание с FVIII и его защита от прежде­временного протеолиза, у больных БВ 3-го типа на­блюдается не только отсутствие vWF, но и очень низ­кое значение FVIII:C.

При БВ 2-го типа наблюдаются качественные дефек­ты vWF, которые у большинства больных выражают­ся в непропорциональном снижении vWF:RCo (или vWF:CB) по отношению к vWF:Ag. Для диагностики подтипов БВ типа 2 используют анализ структуры мультимеров vWF.

У больных БВ типа 2A наблюдаются изолирован­ный дефицит высокомолекулярных мультимеров vWF и сниженная vWF- зависимая адгезия тромбоцитов.

Тип 2B БВ включает различные варианты качествен­ного дефекта vWF, выражающиеся в его повышенном сродстве к рецептору гликопротеину Ib-тромбоцитов.

Тип 2М БВ включает различные варианты качест­венного дефекта vWF, выражающиеся в снижении vWF-зависимой адгезии тромбоцитов без изолиро­ванного дефицита высокомолекулярных мультимеров vWF. Функциональный дефект обусловлен мутация­ми, в результате которых происходит нарушение свя­зывания vWF с тромбоцитами или субэндотелием.

Тип 2N БВ (Нормандия) был впервые описан в 1990 г. [11]. У больных с БВ типа 2N имеется дефект vWF в ме­сте связывания с В результате этого не может образоваться комплекс vWF—FVIII. Данный вариант БВ определяют с помощью теста связывания vWF с FVIII [12]. У многих больных с данным вариантом БВ ранее диагностировали гемофилию А легкой или умеренной степени тяжести (FVIII:C составляет 5—22 %) [13].

Анализ мутаций в гене vWF позволяет не только вери­фицировать диагноз БВ, но и способствует уточнению типа заболевания, поскольку генные дефекты, соот­ветствующие различным типам и подтипам БВ, раз­личаются по своему характеру и локализации [14, 15]. Так, для БВ 1-го и 3-го типов характерны «тяжелые» мутации, приводящие к полному отсутствию функци­онального белка (нонсенс-мутации, frameshift-мута­ции, мутации в канонических динуклеотидах сайтов сплайсинга) и рассеянные по всему пространству гена, тогда как при 2-м типе (кроме рецессивных вариантов 2A и 2N) встречаются только приводящие к аминокис­лотным заменам миссенс-мутации, причем преимуще­ственно в самом большом экзоне 28 гена vWF (1399 пн), кодирующем домены А1 и А2, отвечающие за мульти- меризацию белка. Варианты БВ 3-го типа и подтипа 2N наследуются рецессивно, и, следовательно, для их проявления необходимо наличие мутаций в обоих аллелях гена vWF. Для подтипов 2В и 2М характерно доминантное наследование, то есть достаточно нару­шения только в одном из аллелей. Тип 1 и подтип 2A в генетическом плане более сложны и могут иметь оба варианта наследования [14].

Цель настоящей работы — сопоставление клиниче­ских, коагулогических и молекулярно-генетических данных, полученных при обследовании российских больных различными типами БВ.

В исследование было включено 15 больных с установ­ленным диагнозом БВ и один больной с генетически не подтвердившимся первичным диагнозом гемофилия А. Критериями диагноза БВ были: клинические про­явления геморрагического синдрома, семейный анам­нез и снижение vWF:RCo. Диагностический алгоритм выполнялся в соответствии с Национальными клини­ческими рекомендациями Российской Федерации [16]. Характеристика больных: 4 больных 1-м типом БВ (25 %), 5 больных 2-м типом БВ (31 %), 6 больных 3-м типом БВ (37 %), один больной, у которого первоначаль­но был установлен диагнозом легкой формы гемофилии А (7 %); средний возраст (лет) 47 (21—71), средняя масса тела (кг) 72 (48—90); пол м/ж 5/11. Больные старше 40 лет составили 69 % (11/16). Проводилась оценка клинико­анамнестических данных, результатов исследования свертывающей системы крови и генеалогических дан­ных. Тяжелое проявление болезни наблюдалось у 50 % больных, средняя частота геморрагических эпизодов по микроциркуляторному типу была 3—4 раза в месяц. У одной больной 3-м типом БВ в анамнезе было тоталь­ное эндопротезирование коленного сустава. Коморбид- ные состояния у 11 больных старшей возрастной груп­пы: заболевания желудочно-кишечного тракта были у 27 % (3), онкологические заболевания — у 9 % (1), аутоиммунные заболевания — у 9 % (1), кардиальная патология — у 27 % (3).

С гемостатической целью применялись концентра­ты FVIII, сбалансированные по vWF в соотношении FVIII/vWF (500/1200); FVIII/vWF (450/400). Шесть больных получали лечение в профилактическом ре­жиме 40 МЕ/кг массы тела два раза в неделю. Де­сяти больным лечение проводилось концентратами FVIII+vWF по необходимости в стандартных терапев­тических дозах.

Определение FVIII:C, vWF:RCo выполнялось од­ностадийным клоттинговым методом; vWF-Ag — методом иммуноферментного анализа; агрегацию тромбоцитов, индуцированную ристоцетином, опре­деляли оптическим методом. Оценивали соотношение vWF:RCo/vWF:Ag, значение данного показателя >0,7 соответствует 1-му типу БВ, до 0,7 — 2-му типу БВ.

ДНК выделяли из периферической крови фенол- хлороформным методом. ПЦР проводили с исполь­зованием набора PCR Master Mix (2x) ((Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Нуклеотидные последовательности праймеров, температура отжига при ПЦР и использование бетаина (1/5 объема реак­ционной смеси) для амплификации GC-богатых фраг­ментов приведены в таблице 1. Очистку ПЦР про­дуктов для секвенирования проводили при помощи системы Wizard® PCR Preps DNA Purification System (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Олигонуклеотидные праймеры синтезировали в ЗАО «Синтол» (Москва). Секвенирование проводили в ЦКП «Ге­ном» ИМБ РАН с помощью набора реактивов BigDye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, США) с после­дующим анализом продуктов реакции на автомати­ческом секвенаторе ABI PRISM 3100Avant (Applied Biosystems, США).

Найденные мутации анализировали с использо­ванием баз данных EAHAD (https://grenada.lumc.nl/LOVD2/VWF/home.php?select_db=VWF) и HGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php).

Для определения патогенности новой мутации (Pro2527His) использовались следующие ресурсы: Mutation Taster, Provean, SIFT и PolyPhen.

В данной работе проведен анализ мутаций в гене vWF у 15 больных БВ. В исследование был также вклю­чен больной, у которого первоначально была диагно­стирована легкая форма гемофилии А (FVIII 3,8 %), но при полном анализе гена F8 не найдено никаких отклонений от нормы. Исследовали структуру 23 эк- зонов из 52 (табл. 1), в которых сосредоточено около 90 % известных к настоящему времени мутаций в гене vWF. Патологические варианты гена vWF были выяв­лены у всех 16 больных (табл. 2, 3).

Микроделеция c.2435delC, локализованная в экзоне 18, оказалась в исследованной выборке больных самой распространенной, она трижды встретилась в гомози­готном состоянии (№ 6, 8 и 15) и шесть раз — в гете­розиготном (№ 4, 5, 8, 10, 13 и 16). У больных № 9 и 16 эта мутация сочеталась с миссенс-мутацией c.2372 C>T в том же экзоне.

В экзоне 28 выявили пять различных мутаций. У больного № 4 найдена не только мутация c.2435delC в 18-м экзоне, но и c.4975 C>T в 28-м экзоне. В гетеро­зиготном состоянии в этом экзоне найдены мутации: c.4120 C>T у больного № 3, c.4825 G>A у больного № 7, c.4790 G>A у больного № 11 и c.4517 C>T у боль­ного № 12.

В пяти экзонах было обнаружено по одной мутации. У больного № 2 в 26-м экзоне c.3437 A>G, у больно­го № 14 в 7-м экзоне c.817 C>T. У больных № 5 и 13 мутация c.2435delC была дополнена гетерозиготны­ми мутациями в других экзонах: в 37-м с.6532 и 25-м c.3301 T>C соответственно.

Отдельный интерес представляет мутация с.7580 C>A у больного № 1 в экзоне 45. Она не встречалась ранее в литературе, поэтому для определения пато­генности найденной вариации использовали различ­ные системы анализа белковых структур, которые дали следующие результаты: Mutation Taster (disease causing: p = 0,799), Provean (neutral: score —2,38), SIFT (damaging: score 0,018) и PolyPhen (HumDiv probably damaging: score 1,000, HumVar probably damaging: score 0,972). Таким образом, три из четырех использован­ных программ указали на патогенность найденной за­мены, а в системе Provean полученный коэффициент был близок к границе между нейтральностью и пато­генностью.

В соответствии с клинической картиной заболевания и коагулогическими характеристиками, у 4 больных был определен тип 1 БВ, у 5 — тип 2 и у 6 — тип 3. У боль­ных БВ 3-го типа наблюдалось тяжелое течение болезни с высокой частотой геморрагических эпизодов и опреде­лялись низкие значения vWF-Ag (0—3,8 %) и vWF:RCo (1,21—3,5 %). У всех 6 больных была найдена одна и та же микроделеция в экзоне 18 c.2435delC, приводящая к синте­зу сильно укороченного нефункционального белка, при­чем у 3 больных в гомозиготном состоянии (№ 6, 8 и 15).

В группе больных, у которых мутации выявлены в го­мозиготном состоянии, наиболее выраженное пораже­ние опорно-двигательного аппарата наблюдалось у боль­ной № 6 (рис. 1). Дебют геморрагического синдрома у нее возник в раннем детском возрасте, а с 4 лет наблюдались рецидивирующие гемартрозы коленных суставов с последующим формированием тяжелой артропатии. В воз­расте 39 лет было произведено тотальное эндопротезиро­вание левого коленного сустава. Кроме того, у больной в анамнезе были меноррагии и апоплексия яичников.

Мутация с.2435delC широко распространена в странах Балтии, но найдена также и в других европейских популя­циях [17, 18]. У больной № 4 она встретилась в сочетании с нонсенс-мутацией Arg1659X, также приводящей к синте­зу укороченного нефункционального белка и являющейся мажорной в Финляндии [19], а у больной № 13 — в соче­тании с миссенс-мутацией Cys1101Arg в области гена vWF, кодирующей домен D3. Замены цистеина в домене D3 обычно приводят к нарушению мультимеризации vWF.

Кроме того, данная микроделеция в сочетании с дру­гими мутациями была выявлена у больных БВ 1-го (№ 5) и 2-го (№ 9) типов, а также у больного, у кото­рого первоначально были диагностирована гемофилия А (№ 16). У больного № 10 мутация c.2435delC оказа­лась в гетерозиготном состоянии и других мутаций не найдено. Возможно, у него есть дополнительная му­тация в одном из экзонов, не охваченных в данном ис­следовании. У больной № 5 микроделеция c.2435delC была идентифицирована в сочетании с миссенс-мутацией Ala2178Ser. Низкие уровни vWF-Ag (6,5 %) и активности FVIII (3,3 %) в сочетании с высокой оста­точной vWF:RCo (21,1 %) свидетельствуют в данном случае в пользу редкой рецессивной формы БВ 1-го типа. У этой больной наблюдался геморрагический синдром (меноррагии, длительные кровотечения по­сле удаления зубов), и по поводу поликистоза яични­ков, полипов эндометрия, внематочной беременности ей выполнялись оперативные вмешательства на фоне гемостатической терапии концентратом FVIII, сбалан­сированным по vWF. К настоящему времени отмечает­ся отсутствие геморрагического синдрома, специфиче­ская гемостатическая терапия не требуется.

У больной № 9 и больного № 16 вторым дефек­том была миссенс-мутация Thr791Met, относящаяся к группе рецессивных вариантов vWF, при которых нарушено связывание с FVIII [20]. Таким образом, оба этих случая можно классифицировать как БВ типа 2N. У многих больных данным вариантом БВ ранее диагностировали гемофилию А легкой или умеренной степени тяжести [13, 21]. У больной № 9 наблюдалась клиническая картина рецидивирующих десневых кро­вотечений, длительных луночковых кровотечений по­сле удаления зубов, меноррагий, послеоперационных (аппендэктомия) гематом. Диагноз БВ был верифи­цирован в возрасте 23 лет. Амбулаторно наблюдается в НМИЦ гематологии с 1994 г. Отмечено волнообраз­ное течение заболевания с отсутствием клинических проявлений до 6 мес. В настоящее время, учитывая сопутствующий множественный генерализованный пародонтит, больной планируется хирургическая са­нация полости рта на фоне гемостатической терапии концентратом FVIII/vWF (450/400) (нагрузочная доза 70 МЕ/кг, поддерживающая доза 25 МЕ/кг).

Дифференциальная диагностика БВ по типам и под­типам довольно часто представляет собой непростую задачу, особенно это относится к 1-му типу заболе­вания, которое может иметь как доминантную, так и рецессивную форму наследования. У больной № 14 с предполагаемым 1-м типом БВ на настоящий момент времени выявлена только миссенс-мутация Arg273Trp в гетерозиготном состоянии. Известно, что гомозиготность по этому генетическому дефекту приводит к нарушению мультимеризации и секреции vWF и ассоциируется с 3-м типом заболевания [22, 23]. Наблю­дающиеся крайне низкие показатели vWF:RCo (2,21 %) и vWF-Ag (1,4 %) предполагают возможное наличие у больной нарушения и во втором аллеле, и в данном случае необходимо полное исследование гена vWF.

У больной № 3 выявлена в гетерозиготной форме миссенс-мутация Arg1374Cys, которую ранее относили к 1-му типу БВ, но затем было показано, что она соот­ветствует 2А/2М типам заболевания [24, 25]. Данное нарушение локализовано в домене А1 и вызывает абер­рантную мультимеризацию белка.

У больного № 1 с предполагаемым 1-м типом БВ была обнаружена в гетерозиготном состоянии миссенс-мутация Pro2527His, единственная из найденных нами в данном исследовании мутаций, не описанная в литературе. Локализованные в соседних участках домена С1 замены Gln2520Pro и Gly2518Ser нарушают мультимеризацию белка и соответствуют 1-му типу БВ [25]. По нашим данным, она оказалась патогенной. Ос­новные геморрагические проявления у этого больного представляли собой рецидивирующие носовые крово­течения, кроме того, возникали кровоизлияния в скле­ру глаз на фоне подъема АД до 130/90 мм рт. ст. В воз­расте 62 лет после операции уретеролитоэкстракции возникла гематурия. При обследовании был верифи­цирован диагноз БВ 1-го типа и диагностирована моно­клональная гаммапатия. Секреция белка Бенс-Джонса не выявлена. Больной получает гемостатическую тера­пию концентратом FVIII/vWF (450/400) в профилакти­ческом режиме 2700 МЕ х 2 раза в неделю.

У 4 больных БВ 2-го типа были выявлены в гетеро­зиготном состоянии известные доминантные миссенс- мутации, нарушающие мультимеризацию vWF. В трех случаях (№ 7, 11 и 12) они были найдены в экзоне 28, где чаще всего встречаются нарушения, приводящие к БВ 2-го типа [14]. Все три мутации (Ser1506Leu, Arg1597Gln, Gly1609Arg) были локализованы в области гена, коди­рующей домен А2. У больной № 2 мутация Tyr1146Cys была найдена в экзоне 26, кодирующем домен D3.

Таким образом, в данном исследовании были опреде­лены мутации в гене vWF у 16 больных БВ. Всего было выявлено 12 различных мутаций, одна из которых (Pro2527His) оказалась новой. Наиболее распростра­ненной в отечественной популяции является микро­делеция c.2435delC, встретившаяся у 9 из 16 больных преимущественно с 3-м типом заболевания, причем у 3 больных — в гомозиготном состоянии. В целом, данные молекулярно-генетического анализа соответ­ствовали результатам дифференциальной диагностики типа БВ, основанной на клинической картине заболева­ния и коагулогических характеристиках. Только в од­ном случае у больной предполагаемым 1-м типом БВ была выявлена мутация, характерная для типа 2 (A/M), и еще в 2 случаях уточнен подтип 2-го типа заболева­ния (2N). Из 24 найденных мутаций 14 пришлись на эк- зон 18 (преимущественно это была делеция c.2435delC) и еще 5 — на экзон 28. Из этих результатов следует, что начинать поиск мутаций в гене vWF целесообразно с экзонов 18 и 28. Полученные данные могут послужить основой для создания экономичного алгоритма поиска мутаций в гене vWF у отечественных больных БВ.