Множественная миелома (ММ) относится к злокаче­ственным заболеваниям системы крови с клональной пролиферацией плазматических клеток. Патогенез ММ представляет собой многоступенчатый процесс трансформации генетического материала клетки, ко­торый изучен лишь частично [1]. Молекулярно-ци­тогенетическое исследование клеток костного мозга у больных ММ является рутинным методом обсле­дования, по результатам которого проводится стра­тификация больных на группы риска и стадирование ММ. При цитогенетическом исследовании определя­ются: транслокации с вовлечением локуса генов IGH 14-й хромосомы, наличие трисомий по целому ряду нечетных хромосом, делеция короткого плеча 17-й хромосомы, моносомия или делеция длинного плеча 13-й хромосомы (del13q) и амплификация локуса 1q21 (amp1q21) [2]. Наряду с этим для тестирования точеч­ных мутаций в генах, ассоциированных с развитием ММ, широко используется метод секвенирования по Сэнгеру, позволяющий получать надежные резуль­таты при анализе последовательности ДНК на пред­мет единичных нуклеотидных замен, микроделеций и микроинсерций коротких участков длиной от одного нуклеотида до нескольких десятков оснований. Одна­ко этот метод пригоден только для анализа мутаций, носящих клональный характер или присутствующих в субклонах, составляющих не менее 10 % от общей опухолевой массы. Исследования с использованием современных методов секвенирования показали высо­кую гетерогенность различных генетических наруше­ний при ММ [3, 4].

По данным, полученным на большой выборке боль­ных с использованием секвенирования полного эк- зома (whole exome sequencing, WES), наиболее часто встречающимися нарушениями у больных ММ явля­ются точечные мутации в генах сигнального MAPK- пути (N-RAS, K-RAS, BRAF) и онкосупрессора ТР53, которые суммарно встречаются примерно у половины больных [5].

В патогенезе ММ нарушается регуляция транс­крипции целого ряда генов, таких как C-MYC, MMSET (NSD2), CCND1, CCND2, CKS1B, Notch2, IL-6, MDM2. В результате появляется понятие «профиля» экспрес­сии генов, различные варианты которого могут иметь прогностическое значение, определяя характер тече­ния заболевания и его резистентность к терапии [6].

Гены семейства RAS. Гены семейства RAS — наибо­лее часто мутирующие гены при ММ. В исследовании W. Chng и соавт. [7] частота встречаемости мутаций генов семейства RAS составила 23 % (102/561), из них у 74 (17 %) были выявлены мутации в гене N-RAS, у 28 (6 %) — в гене К-RAS. Большинство мутаций было детектировано в кодоне 61-го гена N-RAS (64 из 74). По данным литературы [8], активирующие миссенсмутации в генах N-RAS и К-RAS изменяют свойства соответствующих белков и превращают протоонкоге­ны в онкогены. Функциональная нагрузка таких му­таций заключается в том, что белки RAS теряют ГТФазную активность, вследствие чего нарушается их нормальная регуляция цитокинами в передаче митоген-активирующего сигнала к ядру, что приводит к по­вышенной пролиферации клеток [8]. Стадия, предше­ствующая ММ, моноклональная гаммапатия неясного генеза (МГНГ), на молекулярном уровне отличается от ММ отсутствием мутаций в генах семейства RAS [9]. Имеющиеся в литературе сведения о роли акти­вирующих мутаций в генах K-RAS и N-RAS в патоге­незе ММ весьма противоречивы. По одним данным, они считаются фактором неблагоприятного прогноза, ассоциируются с прогрессией заболевания и меньшей общей выживаемостью, по другим — могут влиять только на резистентность к терапии определенными препаратами (например, бортезомибом) [7, 10, 11].

BRAF. Киназа BRAF передает сигнал от RAS бел­ков к нижестоящим эффекторным белкам сигнально­го пути МАРК. Частота мутаций в гене BRjAF при ММ варьирует от 4 до 14,9 % [12]. Чаще всего встречает­ся активирующая мутация в 600-м кодоне с заменой валина на глютаминовую кислоту (V600E). Показано [13], что эта мутация ассоциируется с клинически бо­лее агрессивным течением ММ, более низкими пока­зателями общей выживаемости, а также с высокой ча­стотой (>50 %) выявления экстрамедуллярных очагов.

TP53. Опухолевый супрессор p53 является транс­крипционным фактором. Этот белок связывается с промоторами различных генов и может как активи­ровать, так и ингибировать их транскрипцию. Белок p53 вовлечен в репликацию и репарацию ДНК. От­сутствие гена ТР53 ведет к развитию синдрома Ли — Фраумени, проявляющегося предрасположенностью к отдельным новообразованиям и возникновению пер­вично-множественных опухолей [14]. Известен спектр нарушений, ведущих к дисфункции белка p53. Сюда относятся мутации гена TP53, метилирование его регу­ляторных областей, нарушение транспорта белка p53 в ядро, амплификация ингибитора p53 белка mdm2, связывание с вирусным белком E6, которое ведет к деградации p53 [14]. Кроме того, при делеции ко­роткого плеча хромосомы 17 (p17del) одна копия гена утрачивается полностью. Инактивация белка p53 счи­тается универсальным изменением в опухолевой клет­ке и встречается в 50—60 % новообразований. В основ­ном генные нарушения встречаются в гетерозиготном состоянии, представлены миссенс-мутациями, приво­дящими к аминокислотным заменам, и затрагивают чаще всего ДНК-связывающий домен. В результате подобных мутаций происходит изменение вторичной структуры белка и появление новых свойств, таких как способность активировать экспрессию некоторых генов, к которым относятся с-MYC, CCND1, MRD1. Усиление экспрессии MRD1 связано с появлением множе­ственной лекарственной устойчивости у клеток опухо­ли [15].

с-MYC. Протоонкоген с-MYC задействован во многих путях передачи сигналов от рецепторных комплексов на поверхности мембраны клетки. Его экспрессия на­ходится под контролем целого набора транскрипцион­ных регуляторов [16]. Белок c-myc вовлечен в большое число внутриклеточных взаимодействий, его повы­шенная экспрессия ассоциирована с начальными ста­диями неопластической трансформации клеток и уси­лением их пролиферации [17]. В спектр функций c-myc входит регуляция внутриклеточных систем энергообе­спечения — гликолиза, метаболизма глютамина и би­огенеза митохондрий, которые приводят к аккумуля­ции энергии для репликации ДНК и деления клетки [18]. Повышенная экспрессия этого белка ассоцииру­ется с геномной нестабильностью, вызываемой стиму­ляцией митохондрий, которая приводит к наработке активных форм кислорода [19], и в частности может быть связана с появлением транслокаций [20].

MMSET (NSD2). Белок MMSET (multiple myeloma SET domain) является гистонметилтрансферазой и принимает участие в реорганизации хроматина. Его повышенная экспрессия наблюдается на началь­ных стадиях патогенеза ММ. Транслокация с участи­ем гена MMSET t(4;14) является фактором неблаго­приятного прогноза. Искусственная репрессия белка MMSET приводит к пониженному темпу пролифера­ции, индукции апоптоза и клеточной агдезии [21].

CCND1 и CCND2. Высококонсервативные белки из семейства D-циклинов, CCND1 и CCND2, пред­ставляют собой регуляторные субъединицы киназ, необходимые для перехода клетки из G1 в S-фазу кле­точного цикла. Эти белки взаимодействуют с опухоле­вым супрессором Rb, и их экспрессия положительно регулируется Rb. Результатом ранних событий в пато­генезе множественной миеломы, таких как IGH-транс­локации, появление гипердиплоидности и трисомии, является гиперэкспрессия этих циклинов [22].

CKS1B. Увеличение экспрессии гена субъединицы 1В циклинкиназы является фактором неблагоприятного прогноза при ММ. Функция CKS1B заключается в ак­тивации циклина через его фосфорилирование [23]. Ген расположен на длинном плече 1-й хромосомы, его амплификация регулярно встречается среди генетиче­ских нарушений множественной миеломы [24].

Notch2. Белки семейства Notch вовлечены в регу­ляцию гемопоэза. Отсутствие белков этого семейства ведет к нарушению поздних стадий дифференцировки В-клеток [25]. Нарушение регуляторных механизмов работы рецепторов или их лигандов, входящих в сиг­нальный путь Notch, исследовано в различных типах злокачественных солидных и гематологических опу­холей, в том числе и при ММ. Ингибирование Notch индуцирует апоптоз в клетках опухоли, уменьшает устойчивость к лекарственным препаратам, изменяет характеристики миграции/рециркуляции плазма­тических клеток и их обновление [26]. Notch может участвовать в прогрессии ММ, увеличивая уровень интерлейкина-6 (IL-6), одного из ключевых факторов, стимулирующих клеточную пролиферацию [27].

Интерлейкин-6. Представляет собой цитокин плей- отропного действия. Он индуцирует дифференцировку и рост разных типов клеток, в том числе дифференцировку нормальных B-клеток в плазматические клетки, производящие антитела. Пролиферативная активность клеток множественной миеломы зависит от IL-6, осуществляющего ее аутокринную регуляцию [28]. Экспрессия IL-6 ассоциирована с агрессивным течением заболевания, высоким пролиферативным индексом и устойчивостью к лекарственным препара­там, запускающим апоптоз [29]. Повышение активно­сти IL-6 связано с остеодеструкцией — повышенной активностью и пролиферацией остеокластов и пони­жением количества остебластов при ММ [30]. Высо­кий уровень экспрессии IL-6 является фактором пло­хого прогноза при ММ.

MDM2 (murine double minute 2) — белок ингибитор TP53. Изначально ген этого белка был идентифи­цирован в экстрахромосомной ДНК, образующейся в раковых клетках. Его взаимодействие с TP53 ве­дет к тому, что комплекс MDM2/TP53 направляется из ядра в цитоплазму, где подвергается убиквитинированию. В условиях стресса сайты связывания MDM2 и TP53 фосфорилируются, и комплекс, в ко­тором TP53 не активен, не образуется. В результате белок TP53 переходит из латентной формы в активи­рованную форму, запускает процессы остановки кле­точного цикла и апоптоза. Гиперэкспрессия MDM2 — типичный механизм разоружения раковой клетки, лишающий ее защитных функций опухолевого су­прессора TP53 [31].

Цель исследования — проанализировать молеку­лярно-генетический статус опухоли у больного ММ с коротким периодом ремиссии в дебюте и рецидиве заболевания и сопоставить с клиническим течением заболевания.

Пункцию костного мозга для молекулярно-генети­ческого скрининга (fluorescence in situ hybridization (FISH), измерение экспрессии и мутационный статус генов) проводили дважды — в дебюте и рецидиве ММ.

Для оценки значимости изменения величин экс­прессии генов регуляторных белков у больного ММ в дебюте и рецидиве заболевания сравнивали их с со­ответствующими показателями для клеток CD138+, по­лученных от 10 доноров (5 женщин, 5 мужчин в возра­сте от 25 до 41 года). Если значение экспрессии гена у больного вписывалось в диапазон значений, харак­терных для доноров, считали, что оно находится в пре­делах нормы.

Выделение мононуклеаров из костного мозга и CD138-кле­ток. Используя градиент плотности фиколла (1,077 г/ см3), из костномозговой взвеси выделяли фракцию мононуклеаров. В дальнейшем проводилась высоко­активная магнитная сепарация согласно протоколу Miltenyi Biotec (Miltenyi Biotec GmbH, Germany, http://www.miltenyibiotec.com) с использованием магнитного сепаратора OctoMacs, антител anti-CD138, конъюги­рованных с 50-нм частицами оксида железа и анти­тел anti-CD138, конъюгированных с фикоэритрином. Чистота выделения мононуклеаров, обогащенных С0138+-клетками, в дебюте (установка диагно­за 29.05.2013) и прогрессии (констатация рецидива 01.08.2014) составила 80 и 70 % соответственно. В даль­нейшем полученные мононуклеары и С0138+-клетки использовали для проведения FISH-исследования, из­мерения уровня экспрессии генов и определения мута­ционного статуса генов.

Флуоресцентная гибридизация in oitu (FISH). Молеку­лярно-цитогенетическое исследование клеток костно­го мозга выполняли в лаборатории кариологии ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России. В дебюте заболевания FISH-исследование проводилось на моно- нуклеарах костного мозга для выявления первичных (t(14q32)/IGH, множественные трисомии) и вторичных (del 17p13/TP53, del13q14/-13, del1p32, amp1q21 и t(8q24)/ cMYC) хромосомных аномалий. В прогрессии заболе­вания на сепарированных С0138+-клетках проводил­ся повторный FISH-анализ с ДНК-зондами для вы­явления del17p13/TP53, del13q14/-13, del1p32, amp1q21, t(8q24)/cMYC и множественных трисомий. В работе использовали различные центромерные и локус-спе- цифичные ДНК-зонды: XL IGHplus, XL P53, XL cMYC BA, XL 1p32/1q21, XL 5p15/9q22/15q22 Hyperdiploidy Amplification Probe (MetaSystems, Germany) и D13S25 (Cytocell, UK). Исследование проводили согласно про­токолам производителей. Для каждого зонда анализи­ровали по 200 интерфазных ядер с четкими сигналами. Результаты FISH-анализа описывали в соответствии с международной номенклатурой (International System for Cytogenetic Nomenclature, ISCN, 2013) [32].

Анализ экспрессии генов. Тотальную фракцию РНК выделяли из плазматических клеток костного мозга с поверхностным маркером CD138+ при помощи лизи­са в гуанидин-изотиоцианатном буфере с последую­щей очисткой стандартным фенол-хлороформным ме­тодом. Полученную РНК хранили при температуре —70 °С в EtOH. Для анализа экспрессии генов исполь­зовали метод секвенирования РНК нового поколения (RNA-seq). Анализ проводили на приборе Illumina HiSeq (Illumina, США) с использованием наборов для подготовки библиотеки транскриптома тоталь­ной РНК (Whole-transcriptome analysis with total RNA sequencing). Выравнивание полученных после секвенирования последовательностей на референсный геном и сборка транскриптома проводилось с помо­щью программного обеспечения STAR [33]. Пересчет уровня экспрессии генов был выполнен в программе DESeq2. Числовые значения экспрессии (normalized gene counts, ngc) представляют собой абсолютные значения, полученные при сборке и выравнивании транскрипта гена на последовательность референс- ного гена с последующим нормированием на глубину секвенирования [34]. Для определения значимости различий между экспрессией в опухолевых клетках в дебюте и рецидиве заболевания полученные зна­чения приведены с меньшим и большим диапазоном значений экспрессии в плазматических клетках 10 до­норов (табл. 1).

Анализ соматических мутаций. Соматические мута­ции в геномной ДНК плазматических клеток CD138+ костного мозга анализировали методом секвенирования по Сэнгеру. В данной работе исследовались кодирующие области генов N-RAS, K-RAS, TP53, и экзон 15 гена BRAF. Геномную ДНК выделяли ме­тодом фенол-хлороформной экстракции. Клетки лизировали в 1 мл STE (Sodium Chloride-Tris-EDTA) буфера, содержащего 1 % додецлсульфат натрия (SDS) и протеиназу К (200 мкг/мл), в течение ночи при 37 °С или двух часов при 60 °С с последующей фенольной экстракцией.

Для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали смесь PCR Master Mix (2X) Thermo Scientific™, 0,01—0,02 мкг геномной ДНК и 10 пкмоль каждого из праймеров в усредненных условиях (94 °С — 1 мин., 60—62 °С — 1 мин., 72 °С — 1—2 мин., 30 циклов). Все праймерные системы и зонды являются оригинальными и разработаны в ходе прове­дения данного исследования. Для гена BRAF праймеры были синтезированы для 15-го экзона: прямой прай­мер BRAF15D: gatctcttacctaaactcttca; обратный праймер BRAF15R: ccttcaatgactttctagtaact, для гена NRAS и KRAS праймеры были подобраны таким образом, чтобы ам- плифицировать 2, 3 и 4-й экзоны обоих генов: RAS1D: atgtggctcgccaattaacc и RAS1R tgggtaaagatgatccgacaa; RAS1: cccttaccctccacaccccc; RAS2 ctcatttccccataaagattcag; NRAS3x: ttcaagcagtctgccctcct; NRAS4: aactgatgcaaactcttgcaca; KRASD1: gatacacgtctgcagtcaac; KRASR1: tcctgcaccagtaatatgcat; KRASD2: ccagactgtgtttctcccttg; KRASR2: ttactccactgctctaatccc; KRAS3: gacaaaagttgtggacaggtt; KRAS4:ggacactggattaagaagcaa. Все ко­дирующие экзоны TP53, кроме 11-го, были включены в анализ и амплифицировались с использованием сле­дующих праймеров: TP53D1: gccgagctgtctcagacact; TP53R1: gaggaatcccaaagttccaaacaa; TP53D2: acg ccaactctctctagctc; TP53R2: ggccactgacaaccaccctta; TP53D3: ggcctcccctgcttgccaca; TP53R3: caaccacccttgtcctttct; TP53D4: ggcttctcctccacctacct; TP53R4: gcaggctaggctaagctatga; TP53D5: catgttgcttttgtaccgtca; TP53R5: cagctgcctttgaccatgaa.

Продукты ПЦР разделяли при помощи электрофо­реза в 6 % полиакриламидном геле (ПААГ) и визу­ализировали в УФ-свете после окрашивания броми­стым этидием. Для секвенирования ПЦР-продукты реакции очищали на колонках Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Promega.

Праймеры синтезировали в ООО «Синтол». Секве- нирование проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM®BigDyeTM Terminator v.3.1 с последую­щим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3500 в ЦКП «Геном». Полученные с секвенатора электрофореграммы ана­лизировали в программе Vector NTI.

Больной И. Ю. И., 1957 года рождения, наблюдал­ся в ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России с мая 2013 г. с диагнозом ММ IIA ст. по Durie-Salmon, I ст. по ISS, I ст. по R-ISS. Диагноз был установлен в соответствии с критериями, разработанными Ме­ждународной рабочей группой по изучению ММ (The International Myeloma Working Group — IMWG) [35]. На момент диагностики заболевания был выполнен первый молекулярно-генетический скрининг (FISH, определение экспрессии и мутационный статус ге­нов). При проведении индукции ремиссии было вы­полнено пять курсов по программе PAD (бортезомиб + адриабластин + дексаметазон). После второго кур­са была достигнута частичная ремиссия (ЧР), а после пяти — очень хорошая частичная ремиссия (ОХЧР).

На фоне ОХЧР были выполнены мобилизация и сбор аутологичных стволовых клеток крови по схеме 4 г/м2 и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор 5 мкг/кг. За две процедуры лейкафереза было заготов­лено 13,0 X 106/кг CD34+-клеток. В перерыве между сбо­ром аутологичных стволовых клеток крови и выполне­нием трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ауто-ТГСК) с целью сдерживания достигнутого противоопухолевого ответа проведено четыре бортезомиб-содержащих курса (VCD: борте- зомиб + дексаметазон). По результатам обследования непосредственно перед ауто-ТГСК была констатирова­на полная строгая ремиссия заболевания (результаты иммунохимического исследования, данные костного мозга). Однако сохранялись остеодеструктивные очаги, замещенные содержимым жировой плотности. При об­следовании на +100-й день после ауто-ТГСК была кон­статирована прогрессия заболевания (В-симптомы, по данным иммунохимического исследования сыво­ротки крови и мочи помимо исходного парапротеина G-лямбда, впервые за весь период наблюдения была вы­явлена секреция парапротеина М-лямбда 5,3 г/л). Реин- дукционные бортезомиб-содержащие курсы оказались неэ фф ективными. Больной был переведен на вторую линию терапию иммуномодулирующими препаратами, на фоне которой удалось достичь лишь частичного про­тивоопухолевого ответа. Спустя четыре месяца от мо­мента констатации рецидива заболевания больной умер от тяжелых инфекционных осложнений.

Молекулярно-цитогенетическое исследование (FISH). При молекулярно-цитогенетическом ис­следовании (FISH) в дебюте заболевания был вы­явлен лишь гипердиплоидный тип ММ (трисомии 5, 9, 15) в 50 % ядер. При повторном цитогенетиче­ском исследовании на фоне прогрессии заболевания сохранялся гипердиплоидный тип ММ, однако по­явилась amp1q21 в 170 интерфазных ядрах из 200 исследованных, то есть в 85 % ядер. На рисунке 1 представлены результаты FISH-исследования мо- нонуклеаров костного мозга в дебюте заболевания, а на рисунке 2 — результаты FISH CD138+-клеток костного мозга в рецидиве ММ.

Анализ экспрессии генов с-MYC, MMSET, CCND1, CCND2, CKS1B, NOTCH2, IL-6, BCL2, TP53, MDM2. Анализ экспрессии гена с-MYC показал, что в реци­диве заболевания в плазматических клетках костного мозга больного незначительно повысилось количест­во мРНК с-MYC (в 1,5 раза по сравнению с моментом диагностики заболевания). Экспрессия с-MYC на мо­мент диагностики была в 4,4 раза выше, чем сред­нее значение, полученное в результате измерений для 10 доноров.

Значительноеувеличениеуровня экспрессии при раз­витии рецидива заболевания было выявлено для гена Notch2. Экспрессия Notch2 увеличилась в 3,2 раза, при­чем в дебюте заболевания она не превышала верхние показатели, полученные для доноров, но была выше усредненного значения. Наиболее заметное повыше­ние экспрессии наблюдалось для гена IL-6 в рециди­ве заболевания, его экспрессия увеличилась в 29 раз по сравнению с дебютом заболевания. Уже до нача­ла лечения значение экспрессии гена IL-6 было выше в три раза, чем среднее значение у доноров. Высокий уровень экспрессии гена MDM2 — репрессора р53 — был зарегистрирован в дебюте и при рецидиве заболе­вания, причем при рецидиве его количество возросло в 2,5 раза. Во время диагностики ММ его уровень был выше верхних показателей у доноров в два раза. Повы­шенное значение экспрессии в рецидиве по сравнению с дебютом заболевания можно также отметить у генов MMSET и CKS1B (в 3,5 и 1,8 раза соответственно). Зна­чительное снижение экспрессии во время прогрессии ММ было детектировано у генов CCND1 и CCND2. Од­нако ее значения находятся в диапазоне колебаний уровня экспрессии у доноров, и, вероятно, эти измене­ния не несут функциональной нагрузки. Экспрессия гена TP53 у больного не выходила за рамки значений, полученных для доноров (166 и 479 ngc соответствен­но) и существенно не изменилась в рецидиве по срав­нению с дебютом заболевания.

Отмечено снижение на порядок при рецидиве экс­прессии генов клональных иммуноглобулинов, характеризующих опухолевые клетки (IGHV3-33/IGHG2, IGLV1-44/IGLC2'), что соответствует выявленному при иммунохимическом исследовании уменьшению моноклональной секреции парапротеина G-лямбда с 23,8 до 5 ,4 г/л. В то же время экспрессия неклональ­ных иммуноглобулинов (в таблице 1 для примера при­ведены IGHV3-23 и IGHV2-5) снизилась почти на два порядка, что свидетельствует о наличии у больного с рецидивом заболевания глубокого иммунодефици­та. Полученные результаты анализа экспрессии генов представлены на рисунке 3 и в таблице 1.

Секвенирование экзонов 2, 3 и 4 генов N-RAS и K-RAS выявило у больного активирующую соматическую миссенс-мутацию с.182А> C в кодоне 61-го гена N-RAS (p.Q61P). В материале, взятом у больного во время рецидива, диагностированная ранее мутация в той же позиции сохранилась (рис. 4). Соотношение нор­мального и мутантного пиков на электрофореграмме, близкое к 1, свидетельствует о клональном характере данного нарушения.

При параллельном секвенировании ДНК и РНК гена N-RAS в клетках CD138+ опухоли в дебюте и рецидиве заболевания, электрофореграммы практически не отличались друг от друга (соотношение нормально­го и мутантного пиков 1:1), что свидетельствует об от­сутствии различий в экспрессии мутантного аллеля и аллеля «дикого типа».

Секвенирование экзона 15 гена BRAF, в котором обычно локализуются активирующие соматические мутации, в том числе наиболее распространенная p.V600E, показало отсутствие каких-либо отклонений от референсной последовательности как в первичном, так и в рецидивном материале.

Была проанализирована также первичная структу­ра всех функционально важных областей гена TP53 в материале опухоли как при диагностике ММ, так и при рецидиве заболевания. Соматических мутаций найдено не было. Выявлен только полиморфный вари­ант (p.P72R, rs1042522 в базе данных NCBI/SNP) в ге­терозиготном состоянии, не имеющий функциональ­ного значения [36].

В работе был сопоставлен молекулярно-генети­ческий статус опухолевых клеток у больного ММ в дебюте и при рецидиве заболевания. Исходно про­тивоопухолевый ответ на индукционную терапию бортезомиб-содержащими курсами расценивался как полная иммунохимическая ремиссия, однако при рецидиве заболевания была констатирована рези­стентность к терапии бортезомибом. Рецидив заболе­вания сопровождался не только сохранением прежне­го клонального парапротеина IgG-λ, но и появлением не выявлявшегося ранее парапротеина IgM-λ. Имму- нохимический рецидив характеризовался появлением симптомокомплекса CRAB: включающего гиперкаль- циемию (Calcium), почечную недостаточность (Renal failure), анемию (Anemia) и остеолитическое пораже­ние костей (Bone lesions). Больной умер в результа­те инфекционных осложнений через четыре месяца от момента диагностики прогрессии заболевания.

При молекулярно-цитогенетическом исследовании в дебюте и при рецидиве заболевания была выявлена трисомия хромосом 5, 9 и 15. Гипердиплоидия при ММ ассоциируется с благоприятным прогнозом и лучшей выживаемостью больных [37].

На фоне прогрессии ММ у больного возникла но­вая цитогенетическая аберрация — амплификация локуса хромосомы 1 (amp1q21). Анализ экспрессии гена CKS1B, расположенного в этом локусе, показал ее возрастание при рецидиве примерно в два раза по сравнению с дебютом заболевания, что согласу­ется с увеличением его копийности. Данная хро­мосомная аномалия считается фактором плохого прогноза. Отчасти это может быть связано с увели­чением числа копий гена CKS1B и усилением его экспрессии, которое может влиять на общую и без- рецидивную выживаемость, а также резистентность к бортезомиб-содержащим курсам [38]. Показано [39] также, что amp1q21 значительно реже встречает­ся при МГНГ, чем при ММ, и может способствовать прогрессии заболевания, однако авторы этой работы пришли к выводу о том, что уровень экспрессии гена CKS1B на этот процесс не влияет, и он обусловлен, скорее всего, генетической нестабильностью длинно­го плеча хромосомы 1 как таковой.

Анализ транскриптомных данных  показал, что при рецидиве в сравнении с дебютом заболева­ния повышена экспрессия генов с-MYC, Notch2, MDM2 и IL-6. Однако, если экспрессия первых трех генов повысилась всего в 1,5—3 раза, количество транскрип­та гена IL-6 возросло почти в 30 раз. Не исключено, что именно резкое усиление экспрессии этого цитоки- на послужило пусковым механизмом прогрессии ММ у больного, поскольку IL-6 стимулирует клеточную пролиферацию, активируя различные сигнальные пути (MAPK, JAK-STAT, PI3K) [1, 40].

При рецидиве внутри каждого из этих путей наблю­далось повышение экспрессии по крайней мере одного гена регуляторного белка (RAF1, STAT4 и mTOR соот­ветственно). В свою очередь, индукция IL-6 может, по крайней мере отчасти, объясняться усилением экс­прессии гена Notch2 (в 3,3 раза по сравнению с дебю­том заболевания). Notch2 активирует экспрессию IL-6 в клетках костномозговых ниш (клетках стромы) и плазматических клетках костного мозга. Показано, что IL6 является одним из ключевых факторов, влия­ющих на жизнеспособность и неконтролируемое деле­ние миеломных клеток [30].

Экспрессия гена транскрипционного фактора с-MYC повысилась при рецидиве заболевания незначитель­но, всего в 1,5 раза, однако, как и в дебюте заболева­ния, была на существенно более высоком уровне, чем у доноров. Механизм повышенной экспрессии в дан­ном случае остается не ясен, так как при FISH-иссле­довании ни транслокации с вовлечением локуса гена с-MYC, ни трисомия 8 не были выявлены. Возможно, имеет место эпигенетическая регуляция гена с-MYC. Клетки, конститутивно экспрессирующие высокий уровень с-MYC, обладают пониженной зависимостью от ростовых факторов и большей скоростью пролифе­рации. Таким образом, повышенный уровень с-MYC также мог быть одним из факторов, спровоцировав­ших прогрессию ММ.

Экспрессия гена TP53 при рецидиве существенно не изменилась, оставаясь в пределах диапазона значе­ний экспрессии гена TP53 у доноров (табл. 1), и ника­ких мутаций в нем выявлено не было. При этом экс­прессия гена белка mdm2, являющегося ингибитором ТР53, увеличилась в 2,5 раза, что вполне могло повлечь за собой ослабление функции ТР53 при прогрессии за­болевания.

Резкое снижение экспрессии всех генов иммуногло­булинов, в том числе и клональных, соответствующих парапротеину G-лямбда, свидетельствовало о нали­чии глубокого иммунодефицита при прогрессии ММ.

В дебюте заболевания больной не относился к группе высокого риска по клиническим и цитогенетическим данным, однако у него была выявлена клональная ге­терозиготная мутация p.Q61P в гене N-RAS, благода­ря которой происходит неконтролируемая активация сигнального пути MAPK, ведущая к повышению про­лиферативного потенциала опухолевых клеток. После проведения курсов терапии при рецидиве заболевания мутация сохранилась в клональном состоянии. Вли­яние активирующих мутаций в генах семейства RAS на патогенез ММ исследуется давно и достаточно ак­тивно, однако результаты опубликованных работ при­водят к противоречивым выводам об их значимости. В исследовании, посвященном изучению дифференци­альной экспрессии мутантного и нормального аллелей [11], было показано, что мутантный аллель экспресси­руется слабее аллеля «дикого типа». У наблюдавшего­ся больного нормальная и мутантная копии гена N-RAS в дебюте и рецидиве ММ экспрессировались с оди­наковой эффективностью. Оба варианта белка могли играть существенную роль в активации сигнального МАРК-пути при прогрессии заболевания: мутантный белок — за счет потери контроля над ним со стороны цитокинов, нормальный белок — вследствие стимуля­ции гиперэкспрессией IL-6.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что при ММ целесообразно выполнять комплексную молекулярную диагностику, включающую развернутое цитогенетиче­ское исследование, анализ экспрессии и мутационный анализ широкого спектра генов регуляторных белков, так как единичная хромосомная или генная аномалия вряд ли может сама по себе служить определяющим фактором прогноза развития заболевания и его рези­стентности к применяемой терапии.