Современная концепция безопасности предполагает, что лицам со слабыми вариантами антигена А (А2, А3 и др.), нуждающимся в частых трансфузиях эритро­цитсодержащих компонентов, следует переливать донорские эритроциты, не содержащие антиген А1. Подобный подход обусловлен тем, что при трансфу­зии эритроцитов А больным с антигеном А или дру­гими слабыми вариантами возможно образование аллоиммунных анти-А -антител, а если такие анти­тела уже присутствуют, то существует риск развития посттрансфузионных реакций и осложнений [1-3]. У лиц с ослабленной экспрессией антигена А в крови могут присутствовать природные анти-А -антитела (экстраагглютинины). Анти-А-экстраагглютинины имеют 1-2 % лиц с подгруппой А2 и 25 % лиц с под­группой А2В [4]. Иногда анти-А1 можно обнаружить в сыворотке лиц с другими слабыми подгруппами ан­тигена А. Экстраагглютинины анти-А могут вызывать расхождения в результатах АВ0 тестирования и про­бы на индивидуальную совместимость. Реципиентам с иррегулярными анти-А1-аантителами рекоменду­ется переливать эритроциты, не несущие антиген А1 [5]. На практике это правило часто распространя­ют на всех реципиентов с подгруппой А2 , особенно нуждающихся в частых трансфузиях эритроцитсо­держащих компонентов. Экстраагглютинины анти-А имеют, как правило, низкие титр и авидность, поэто­му их не всегда можно обнаружить при исследовании сыворотки со стандартными эритроцитами в процессе перекрестного АВ0-тестирования. В связи с этим про­блема своевременного выявления больных со слабыми вариантами антигена А остается актуальной.

Антиген А характеризуется высоким полиморфиз­мом, т.е. представлен различными вариантами (под­группами), которые кодируются разными аллелями гена АВ0*А. Генетические основы системы АВ0, а так­же молекулярно-генетические события, приводящие к формированию разнообразных аллельных вариантов гена АВ0':А, подробно освещены в обзорах [6-10]. Две основные подгруппы антигена А — это А и А . Частота встречаемости подгрупп А1 и А2 различна в разных по­пуляциях. У лиц европеоидной расы среди групп А и АВ около 80-88 % принадлежат к А или А В, а остальные 12-20 % — к А2 или А2В [11, 12]. Частота встречаемости антигена Асреди лиц группы А составляет 14,7-17,8 %; частота фенотипа А В среди лиц группы АВ составляет 23,5-26,2 % [13]. Выраженный дисбаланс существует и в других популяциях [14]. Одной из причин такого дисбаланса может быть разное фенотипическое прояв­ление аллеля А(К101) в группах А и АВ: гетерозиготный генотип A(R101)/0 экспрессируется как А:-фенотип, а ге­терозиготный генотип A(R101)/В — как А2В-фенотип, что приводит к возрастанию частоты А2В по сравнению с А2 [15].

Важнейшим различием между А и А фенотипами яв­ляется существенная разница в количестве экспрессиру­емых на эритроците эпитопов антигена А. На эритроци­тах А их около 106, что примерно в четыре раза больше, чем на эритроцитах А2 [16]. Подгруппы слабее А2 (A3, Ax, Am, Ael) встречаются редко и характеризуются дальней­шим уменьшением числа сайтов антигена А на эритро­цитах. Подгруппы часто обнаруживают либо по очень слабой агглютинации, либо по расхождению между ре­зультатами прямого и обратного тестирования эритро­цитов при перекрестном определении группы АВ0.

Помимо количественных, у эритроцитов А и А есть качественные различия. У лиц с группами кро­ви А или А В могут вырабатываться анти-А -антите­ла, однако никогда не бывает наоборот. Это означает, что эритроциты А отличаются от А отсутствием ка­кой-то структуры. Серологическое разделение было подтверждено генетически, когда было показано суще­ствование двух различных ферментов [17]. Фермент А2-гликозилтрансфераза обладает более низкой актив­ностью и имеет болееузкую субстратную специфичность по сравнению с ферментом А1-гликозилтрансферазой.

Эритроциты А1 и А2 одинаково сильно реагируют с современными реагентами анти-А в методе прямой агглютинации. Различие между А - и А2-эритроцитами может быть установлено путем тестирования с анти-А1 лектином и моноклональными антителами анти-А . Эти реагенты вызывают агглютинацию эритро­цитов А1 и А1В, не реагируют с эритроцитами А2В, но могут вызывать слабую агглютинацию эритроци­тов А2. Установленного стандарта для реагентов и ме­тода не существует, поэтому нередки несоответствия в результатах, полученных с применением различных реагентов и в разных лабораториях [20].

Целью настоящей работы было создать стратегию определения вариантов антигена А с применением до­ступных реагентов в реакции агглютинации.

В исследовании использовали образцы крови доно­ров, полученные в отделении заготовки крови ФГБУ «НМИЦ гематологии» МЗ РФ после получения ин­формированного согласия; все тесты проводили после завершения иммуносерологического тестирования и исследования на патогены. Материалом исследова­ний были образцы крови 23 человек со слабым вари­антом антигена А, из которых у 16 человек была груп­па крови А2, у 5 — группа A2B, у 2 — серологически была определена группа A3, а также 12 образцов крови с антигеном А в качестве контроля (из них у 6 человек была группа крови А и у 6 — группа AB).

Применяли следующие методы.

Перекрестное определение группы крови систе­мы АВ0 в реакции агглютинации на плоскости с ис­пользованием Эритротест Цоликлонов анти-А (сер. 423R и 433F) и анти-В (сер 424R) (ООО «Гематолог», Москва) и стандартных эритроцитов групп А1, В, 0 (BioRad, США). Активными компонентами Цоликлонов являются моноклональные антитела класса IgM мыши: клоны А-90/16 и Birma (Цоликлон анти-А вариант R), клоны А-90/16, А-86/3 и 9113D10 (Цоликлон анти-А вариант F), клон В-85/2-В8 (Цоликлон анти-В вариант R).

Определение подгруппы антигена А в реакции аг­глютинации на плоскости с использованием монокло­нального реагента Цоликлона анти-А1 (сер. 261) (кло­ны 1Е3 и 5Е6), Эритротест анти-А: лектина (сер. 259), Цоликлона анти-Нкра (сер. 735) (клон Н-89/8) (ООО «Гематолог», Москва); анти-А1 лектина (сер. 020317В), анти-Н (А2) (сер. 080517С) (клон 10934C11) (ImuMed Antitoxin, Германия); анти-А1-лектина (сер. 118100201) (Bio-Rad, США). Силу реакции оценивали по 4-крестовой системе через 5 мин после смешивания эритро­цитов с реагентом в соответствии с таблицей 1.

ДНК-анализ генаАВ0*А выполняли двумя методами: полимеразной цепной реакцией (ПЦР) и прямым сек- венированием. Геномную ДНК выделяли с помощью реактивов фирмы BAG (Германия) по методике произ­водителя и по стандартной методике депротеинизации фенолом после лизиса с протеиназой К. Концентрацию и чистоту ДНК определяли на спектрофотометре. Одна оптическая единица (OD) соответствовала кон­центрации ДНК 50 нг/мкл. Чистота ДНК, определяе­мая по отношению показателей при 260 и 280 нм (OD 260/280), составляла 1,6-1,8, концентрация конечной ДНК - 50-100 нг/мкл.

ПЦР проводили с помощью праймеров для выяв­ления вариантов генов системы АВ0 (AB0-variant kit) фирмы BAG (Германия). Детекцию полученных ре­зультатов осуществляли посредством электрофореза продуктов амплификации в 2%-ном агарозном геле, со­держащем бромистый этидий (1мкг/мл) в TBE-буфере. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом све­те (λ = 310 нм) при помощи транс-иллюминатора в виде полос ярко-оранжевого цвета. Наличие полос ампли­фикации внутреннего положительного контроля сви­детельствовало о корректности проведенной ПЦР Прямое секвенирование проводили по методу Сэнгера с помощью набора реактивов ABIPRISM®BigDyeTMT erminatorv.3.1. У всех образцов секвенировали экзоны 6 и 7 гена АВ0*А.

В работе представлены результаты исследования образцов эритроцитов со слабыми вариантами антиге­на А с помощью различных реагентов — анти-А -лектина, анти-А1-моноклональных антител и дополни­тельного реагента — анти-Н-моноклональных антител для демонстрации возможности дифференцирования подгрупп антигена А серологическими методами. Принадлежность эритроцитов к той или иной под­группе была подтверждена генетическим тестирова­нием.

Детальные результаты исследований показаны в та­блице 2. Результаты реакции с Цоликлонами анти-А и анти-В приведены для демонстрации групповой при­надлежности (столбцы 1-3). Группу АВ0 подтвержда­ли перекрестным тестированием, то есть реакцией сыворотки со стандартными эритроцитами А, В, 0 (данные не приведены). Цоликлоны анти-А с индекса­ми R и F отличались по составу и содержали продукты различных клонов. Оба реагента одинаково активно реагировали с подгруппами А1, А2 и А3 (столбцы 1-2), что соответствовало требованиям к реагентам для ру­тинного тестирования.

В таблице 2 приведено сравнение четырех различ­ных анти-А -реагентов, три из которых представляли собой раствор лектина DoLichos biflorus (столбцы 5-7) и один реагент, Цоликлон анти-А , был смесью двух моноклональных антител (столбец 4). Результаты эксперимента и лабораторная практика показа­ли, что все анти-А -реагенты не взаимодействовали с эритроцитами A2B, но часто реагировали с эри­троцитами A2. Лектины анти-А1 производства фирм BioRad и ImuMed (Antitoxin) вызывали крупную аг­глютинацию А - и АВ-эритроцитов, но также явно реагировали (на 1+ — 2+) с большинством образцов эритроцитов А2. Эта реакция была существенно сла­бее, чем с A -эритроцитами, однако могла ввести в за­блуждение, особенно при отсутствии положительных (A) и отрицательных (А) контрольных образцов (эритроцитов A нет в доступных панелях стандарт­ных эритроцитов). Моноклональный реагент анти-А1 реагировал с А2-эритроцитами более избирательно: сила реакции с эритроцитами A2 было слабой (на 1+), но он менее активно реагировал и с эритроцитами А1 и A1B — агглютинация начинала формироваться позд­нее, и сила реакции была не выше 3+.

Реакция с двумя анти-Н-моноклональными реаген­тами разных производителей была идентичной (столб­цы 8—9): отрицательной или слабой с эритроцитами А1 и ярко выраженной со всеми образцами А2.

На рисунке 3 показано на примере четырех образ­цов эритроцитов А, А, АВ и АВ, как выглядит реак­ция на плоскости с набором реагентов, необходимых для установления подгруппы антигена А.

В серологическое исследование были включены образцы крови доноров, которым был проведен АВ0 (столбец 10) ДНК-анализ с использованием праймеров фирмы BAG для выявления вариантных антигенов А, который подтвердил наличие аллеля АВ0*А2 у 21 доно­ра эритроцитов. В двух случаях серологически была определена подгруппа А3 (на плоскости наблюдалась замедленная агглютинация на 2+ на фоне свободных эритроцитов, в гелевом методе отмечали расслоение эритроцитов в пробирке), однако генотипирование вы­явило аллель АВ0*Аг Прямым секвенированием ДНК доноров этих образцов эритроцитов были идентифи­цированы аллели АВ0*А2.05 и АВ0*А2.06.

Антигены групп крови систем АВ0 являются угле­водами (карбогидратами), то есть структурами, ко­торые формируются в результате биохимических процессов с участием гликозилтрансфераз. Гены всех углеводных антигенов, в том числе А и В, кодируют гликозилтрансферазы — ферменты, которые перено­сят конкретные сахара на углеводную цепь-предшест­венник и формируют соответствующий антиген [21]. Предшественником для синтеза антигенов А и В яв­ляется антиген Н, к которому А-гликозилтрансфераза присоединяет N-ацетилгалактозамин (GalNAc), а В-гликозилтрансфераза присоединяет галактозу (Gal) (рис. 1). На эритроцитах группы 0 присутствует большое количество антигена Н, неконвертированного в А- и/или B-антигены. Синтез А- и/или В-антигенов приводит к снижению количество антигена Н на по­верхности эритроцита. Таким образом, экспрессия ан­тигенов A и/или B и экспрессия антигена H обратно пропорциональны.

Углеводные Н-цепи имеют различное биохимиче­ское строение. На эритроцитах могут присутство­вать четыре типа Н-цепей, на которых формируются соответственно 4 типа антигена А [22—24] (рис. 1). Нумерация подгрупп антигена А (А1, А2, А3) и цифро­вые обозначения типов углеводной цепи (типы 1, 2, 3, 4) не связаны между собой. Тип 1 Н-цепей синтезируется эпителиальными клетками и является предшествен­ником растворимых антигенов, которые обнаружива­ются в слюне или плазме у лиц-«секреторов». На эри­троциты такие антигены адсорбируются из плазмы. Эндогенные эритроцитарные типы Н-цепей — это типы 2, 3 и 4. На эритроцитах А экспрессируются все типы антигена А. На А - и А2В-эритроцитах присут­ствует антиген А, представленный на Н-цепях типа 2. Показано, что ключевым отличием фенотипов А1 и А2 является различная экспрессия антигена А типов 3 и 4: тип 3 отсутствует на эритроцитах А2В и слабо выра­жен на эритроцитах А , тип 4 полностью отсутствует на эритроцитах А и А В [25] (рис 2). Эти отличия связаны с тем, что активная А -гликозилтрансфераза эффективно конвертирует H вещество в А антиген и переносит GalNAc на Н-цепь любого типа, в то время как А2-гликозилтрансфераза имеет субстратные огра­ничения и не способна прикреплять иммунодоминант- ные сахара на Н-цепи типа 3 и 4.

Основным реагентом, используемым для дифферен­циации подгрупп, является анти-А1-лектин. Он пред­ставляет собой экстракт из семян бобового растения DoLichos biflorus. Экстракт реагирует с обеими под­группами А эритроцитов, но при нужном разведе­нии проявляет преимущественно анти-А1-активность. Другой анти-А1 диагностикум, Цоликлон анти-А1, представляет собой комбинацию двух моноклональ­ных анти-А1-антител. Как показывают данные, пред­ставленные в таблице 2, и лектины, и моноклональные антитела могут вызывать агглютинацию некоторых образцов эритроцитов А2, причем сила агглютинации варьирует. Было установлено, что анти-А1 моноклональные антитела, входящие в состав Цоликлона, реа­гируют с антигеном А, экспрессированном на Н-цепях типа 3 и 4 [25]. Эти структуры присутствуют на эри­троцитах А1, а на эритроцитах А2 их либо очень мало, либо они не обнаруживаются вообще (рис. 2). Зная эпитопную специфичность анти-А1-моноклональных антител, можно предполагать, что Цоликлон анти-А1 выявляет на эритроцитах А2 слабо экспрессирован­ные детерминанты антигена А типа 3, создавая ви­димость неспецифической реакции. Такая проблема не возникает при тестировании эритроцитов группы А2В, поскольку сильная В-трансфераза конкуриру­ет со слабой А2-трансферазой и утилизирует общие Н-предшественники.

Полезным реагентом для подтверждения подгруп­пы является анти-Н-реагент. Активная А -глико- зилтрансфераза превращает в антиген А существенно больше молекул Н, чем А2-гликозилтрансфераза. Таким образом, содержание антигена Н на эритроцитах А ниже, чем на эритроцитах А , и поэтому анти-Н-реа- генты практически не агглютинируют А -эритроциты, но дают сильную реакцию с А2-эритроцитами. В та­блице 2 и на рисунке 3 видно, как четко различают подгруппы антигена А все анти-Н-реагенты. Реагент компании ImuMed называется анти-Н (А2), однако ми­шенью антител является антиген Н, а дополнительная подпись в скобках (А2) — это скорее указание к при­менению. В настоящей работе были использованы только моноклональные анти-Н-реагенты. Экстракт из ULex europaeus также выявляет антиген Н и может применяться с той же целью.

Таким образом, в рутинной практике для диф­ференциации подгрупп А1 и А2 в большинстве слу­чаев достаточно двух реагентов: анти-А и анти-А1. Моноклональные реагенты анти-А одинаково надежно выявляют А и А и четко реагируют с эритроцитами А , а реагенты анти-А при необходимости позволят дифференцировать А1 от А2 и более слабых подгрупп. Моноклональный реагент Цоликлон анти-А: явля­ется адекватной заменой лектину анти-А . В случае сомнительного результата реакции эритроцитов с анти-А -реагентом следует провести тестирование с реа­гентом анти-Н: сильная реакция укажет на А , отрица­тельная или слабая — на А1.

У двух доноров в настоящем исследовании было отмечено расхождение результатов серологических и молекулярных методов: серологически была опре­делена подгруппа А3, генотипирование методом ПЦР выявило аллель АВ0*А. Прямое секвенирование ДНК показало сочетание мутантных аллелей, которое про­являет себя как фенотип А [26]. Праймеры наборов А-variant Type (фирмы BAG) подобраны к наиболее ча­сто встречающимся вариантам и не могут выявить все мутации гена АВ0. За очевидными результатами генотипирования могут маскироваться мутантные аллели, что и наблюдалось в двух образцах.

Очевидно, что поиск генетических разновидностей антигена А представляет интерес для исследования эволюции гена, описания новых или редких вариан­тов [27], но в практической трансфузиологии гене­тическое типирование каждого реципиента со сла­бым антигеном А затруднительно и нерационально. Кроме того, результаты генетического анализа по­зволяют лишь предсказать наличие антигена; окон­чательное решение принимается на основе данных серологического исследования, как в приведенном выше случае. Тем не менее в литературе предлагает­ся использовать ДНК-анализ как подтверждающий тест в тех случаях, когда у здоровых доноров со сла­бой подгруппой антигена А не совпадают результа­ты перекрестного AB0-типирования, и компонент крови при этом бракуют. Авторы считают, что уточ­нение группы с помощью ДНК-анализа позволит избежать нерациональной отбраковки таких компо­нентов [28].