В настоящее время учреждения службы крови на ос­новании существующих нормативных документов проводят определение антигенов эритроцитов, в том числе и антигенов системы Rh, у всех доноров РФ [1]. При использовании обозначения фенотип -D- имеют­ся в виду следующие типированные специфичности: D+, C-, c-, E-, е. Обычно фенотип -D- обнаруживают при выявлении причин посттрансфузионных ослож­нений или гемолитической болезни новорожденных, так как у таких больных выявляется высокий титр ан­тител к отсутствующим антигенам [2]. В настоящем исследовании фенотип -D- был выявлен в клиниче­ской лаборатории ГУЗ «Ульяновская областная стан­ция переливания крови» у первичного донора крови, а в последующем у его родного брата.

Впервые фенотип -D- обнаружили R. Race, R. Sanger и J.G. Selwyn в 1951 г. [3]. В России фенотип -D- был впервые обнаружен В. А. Мороковым в 1985 г. и иссле­дован Т. М. Пискуновой и соавт. [4] при разборе клини­ческого случая привычного невынашивания беремен­ности женщины, также проживавшей на территории Ульяновской области. Для уточнения фенотипа было проведено молекулярное типирование ДНК исследу­емого донора крови и его ближайших родственников. Кроме иммуногематологического выявления феноти­па и его генетического подтверждения были изучены некоторые показатели крови исследуемых лиц. Был проведен общий анализ крови с помощью автоматиче­ского гематологического анализатора для уточнения состояния эритроидного ростка. Для оценки формы эритроцитов в настоящей работе был применен атом­но-силовой микроскоп, который ранее уже использо­вался для исследования качества эритроцитов донор­ской крови, заготовленной на базе ГУЗ «Ульяновская областная станция переливания крови» [5].

Цель — изучить особенности иммуногематологических и гематологических показателей крови донора с редким фенотипом -D-.

Исследование выполнено в ГУЗ «Ульяновская област­ная станция переливания крови» в соответствии с тре­бованиями этических норм и принципов Декларации Хельсинки (1964 г.) со всеми последующими измене­ниями и дополнениями, а также действующего зако­нодательства РФ. Все первичные документальные дан­ные исследованных образцов крови были обезличены в соответствии с требованиями п. 3 ст. 6 действующего Федерального закона РФ 152-ФЗ «О персональных данных».

Для иммуногематологического исследования доно­ра крови и его ближайших родственников (мать, отец, брат) был проведен сбор четырех образцов крови в ва­куумные пробирки Vacuette с КДДТА фирмы Greiner-Bio-One (Австрия). Исследования на наличие антигенов AB0 и антигенов системы Rh (D, С, с, Е, е) проводились двумя методами. Первый метод — агглютинация эри­троцитов в геле на иммуногематологическом анали­заторе HEMOS SP компании Bio Rad (США). Выбор метода был обусловлен тем, что принцип гелевого ме­тода позволяет с высокой степенью достоверности трак­товать полученный результат при визуальной оценке. Второй метод — магнитизация эритроцитов на автома­тизированном иммуногематологическом анализаторе QWALYS компании Diagast (Франция). Принцип ме­тода магнитизации эритроцитов основан на использо­вании магнитных частиц в процессе подготовки образ­цов крови для исследований, которые абсорбируются на эритроцитах. Под действием магнитного поля эри­троциты с абсорбированными магнитными частицами перемещаются в дно лунки и вступают в реакцию с су­хим реагентом (агглютинация) [6].

Для подтверждения фенотипа было проведено моле­кулярное типирование ДНК [7]. Исследование прово­дилось в лаборатории изосерологии ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России. Для анализа использовали лейкоцитар­ную ДНК, которую выделяли с помощью набора ДНК- сорб-В («Амплипрайм») из образцов крови, отобран­ных в вакуумные пробирки Vacuette с КДДТА фирмы Greiner-Bio-One (Австрия). Типирование проводили с помощью анализатора FluoVista. Молекулярная си­стема детекции FluoVista основана на методе полиме­разной цепной реакции (ПЦР) с аллель-специфическими праймерами SSP и флуоресцентной детекцией «по конечной точке» производства компании Inno-train Diagnostik GmbH (Германия). Детекцию флуоресцен­ции до и после проведения ПЦР осуществляли с по­мощью термоциклера С1000 Touch компании Bio Rad (США).

Для оценки состояния эритроидного ростка иссле­дуемых лиц с фенотипом -D- был проведен общий анализ крови с помощью автоматического гематологи­ческого анализатора Sysmex 1000i (Япония). Образцы капиллярной крови, полученные путем прокола ска­рификатором кожи дистальной фаланги пальца, от­бирали в микропробирки фирмы Sarstedt-Microvttte® 200 К3 Е (Германия). Далее микропробирки устанав­ливали в специальные разъемы анализатора.

Исследование формы поверхности эритроци­тов и их размера проводили с помощью атомно-си­лового микроскопа на базе лаборатории Научно­исследовательского технологического института ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный универ­ситет» Минобрнауки РФ. Атомно-силововая мик­роскопия — метод, основанный на измерении положения микрозонда, движущегося по поверхности образца, и обработке этой информации с помощью специальной компьютерной программы с построени­ем изображения [8]. Для исследования образцов крови с помощью атомно-силового микроскопа готовили ци­тологические препараты: каплю капиллярной крови, полученную путем прокола скарификатором кожи ди­стальной фаланги пальца, наносили на чистое обезжи­ренное предметное стекло и равномерно распределяли краем пластикового шпателя. Препарат фиксировали методом высушивания на воздухе в течение 20 минут при комнатной температуре. Возможность сканиро­вания с помощью атомно-силового микроскопа цитологических препаратов эритроцитов с фиксацией методом высушивания на открытом воздухе и полу­чением корректных результатов приводится в работе M. Takeuchi и соавт. [9], при этом авторами отмечали, что высушивание эритроцитов практически не изме­няло их форму. В данной работе использовали атомно­силовой микроскоп фирмы NT-MDT (Россия), модель Solver P47-Pro. Для создания изображений образцов применяли резонансный метод с генерируемой часто­той 300 kHz. Сканируемая площадь образцов состав­ляла 120 х 120 мкм. С помощью программы NOVA строили изображения поверхности препаратов. Далее на компьютерных моделях сканированных препаратов оценивали форму эритроцитов и их размер [10].

Первоначальная диагностика антигенной структуры эритроцитов проводилась с помощью иммуногематологических методов. На рисунке 1 представлен прото­кол исследования, полученный с помощью автомати­зированного иммуногематологического анализатора QWALYS, на котором можно увидеть, что в образцах крови пробанда и его брата (образцы C и D) отсут­ствуют антигены С, с, Е, е и К. При этом анализа­тор при валидации проведенного фенотипирования крови донора с отсутствующими антигенами систе­мы Rh в графе «Результат» выводит ******* (рис. 1). Аппарат корректно интерпретировал фенотипы мате­ри и отца, содержащие антигены системы Rh (образцы А и В). Предположительно это произошло из-за того, что вследствие исключительной редкости фенотипа -D- в программное обеспечение не был заложен алго­ритм интерпретации подобного результата. При про­ведении исследования с использованием иммуногематологического анализатора Hemos SP обнаружили похожую проблему валидации результатов. Фенотипы пробанда и его брата были расценены программой как ошибочные, и протокол зафиксировать не удалось. Для демонстрации фенотипа образца крови пробанда приводилось изображение гелевой ID-карты компа­нии Bio Rad (рис. 2). Результаты, полученные при ис­следовании образцов крови с помощью иммуногематологических методов, представлены в таблице 1.

Результаты, полученные с помощью молекулярного типирования ДНК, подтвердили отсутствие специ­фичностей C, c, E, e, Cw гена RHCE у пробанда и его брата. Ген RHD при этом в обоих случаях присутство­вал. Типирование родителей полностью подтвердило фенотипы, выявленные иммуногематологическими методами. К сожалению, техническая возможность поиска всего разнообразия вероятных аллелей гена RHCE в рамках этого исследования отсутствовала. На рисунке 3 приведена фотография протокола молекулярного типирования ДНК пробанда с помощью на­боров фирмы Inno-train Diagnostik GmbH (Германия). Исходя из теории сцепленного двухгенного наследова­ния и учитывая то, что дети, вероятно, имеют гаплотип -D- в гомозиготном состоянии, можно предположить, что родители имеют гаплотип -D- в гетерозиготном состоянии [11]. Генотип исследованных в настоящей работе лиц можно представить следующим образом: отец: CDe/-D- или Cdef-D-; мать: cde/-D- или cDe/-D-; про­банд и его брат: -D-/-D-.

Для оценки состояния эритроидного ростка было проведено исследование образцов крови с помощью автоматического гематологического анализатора. Результаты стандартных гематологических показате­лей приведены в таблице 2. У исследуемых лиц с фе­нотипом -D- не выявлено отклонений показателей, характеризующих состояние эритроцитов: количество эритроцитов, концентрация гемоглобина, гематокрит, средний объем эритроцитов, среднее содержание ге­моглобина в эритроците и его концентрация, стандарт­ное отклонение и коэффициент вариации распределе­ния популяции эритроцитов по величине находились в пределах возрастной нормы. Изображения цитологи­ческих препаратов крови пробанда и его брата, полу­ченные с помощью атомно-силового микроскопа, под­твердили отсутствие изменений формы эритроцитов и их размера (рис. 4 и 5). Большинство эритроцитов имели двояковогнутую форму и типичный для этого типа клеток размер 7—9 мкм. Для сравнения приведено контрольное изображение цитологического препарата донора крови с фенотипом D+ С+ с— Е+ е- (рис. 6).

В настоящей работе продемонстрированы особенно­сти выявления фенотипа -D- с помощью современного оборудования и интерпретации полученных результа­тов специализированным программным обеспечением. Несмотря на укомплектованность современных центров крови и лечебных учреждений соответствующими ана­лизаторами, квалификация и опыт персонала могут сыг­рать решающую роль в принятии решений в нетипичных ситуациях. В случаях ошибок, выявляемых в работе ав­томатической аппаратуры иммуногематологических ла­бораторий, необходимо производить визуальную оценку гелевых ID-карт и анализ полученных результатов.

Учитывая редкость выявления фенотипа -D-, пред­ставлялось интересным проанализировать этиологию его возникновения. По данным R. Race и R. Sanger [12ф у большинства выявленных лиц с фенотипом -D- родители состояли в родстве. При подробном сборе анамнеза у родителей пробанда выявлено, что их близ­кие родственники проживают на территории неболь­шого населенного пункта Ульяновской области, в ко­тором они познакомились и создали семью. Принимая во внимание тот факт, что традиционно представители национальности, к которой принадлежат оба родите­ля, вступают в брак предпочтительно с представите­лями той же национальности, предположение о даль­нем родстве родителей исследуемых лиц полностью исключить невозможно. Это может объяснять наличие у обоих родителей редкого гаплотипа -D-.

Антигены системы Rh являются структурными ча­стями мембраны эритроцитов и принимают участие в обменных процессах, а их полное отсутствие, так называемый фенотип Rhni , сопровождается измене­нием формы эритроцитов и склонностью к гемолизу [13]. Проведенные исследования образцов крови с по­мощью автоматического гематологического анализа­тора и атомно-силового микроскопа не выявили из­менений эритроидного ростка и формы эритроцитов. Отсутствие патологии мембраны эритроцитов в рас­сматриваемом случае, вероятно, связано с наличием других специфичностей системы Rh.

Наличие редкого фенотипа -D- сопровождается опасностью выработки высокого титра антиэритроцитарных аллоантител к отсутствующим антигенам C, с, E, e, Cw при трансфузии донорских эритроцитов [14].

В связи с этим для исключения потенциальной им­мунизации исследуемым лицам было рекомендовано проведение процедуры аутодонорства с последующим замораживанием эритроцитов. Этот метод позволяет хранить эритроциты в течение нескольких лет и осу­ществлять аутотрансфузию в случае возникновения показаний.

Таким образом, первичное определение фенотипа -D- с помощью автоматических иммуногематологических анализаторов может осложняться невоз­можностью валидации результатов, некорректной работой их программного обеспечения и необходи­мостью экспертной оценки проб крови персоналом. Рассматриваемый случай фенотипа -D- не сопряжен с изменениями формы эритроцитов и гематологиче­ских показателей крови.