В марте 2020 года Всемирная организация здра­воохранения объявила пандемию новой инфекции, вызванной вирусом из семейства Coronaviridae: SARS- CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus —2). Новая коронавирусная инфекция получила на­звание COVID-19. Наиболее тяжелым осложнением COVID-19 явилась пневмония, характеризующаяся атипичным течением и частым развитием острой ды­хательной недостаточности. К настоящему моменту в мире инфицировано более 13 млн человек, из ко­торых свыше 570 тысяч умерли [1]. COVID-19 — это не первая коронавирусная инфекция, эпидемия ко­торой возникает в мире. Ранее, в 2003 году, состо­ялась эпидемия атипичной пневмонии, вызванная вирусом SARS-CoV, а в 2012 г. — MERS [2]. В пе­риод прошедших эпидемий при отсутствии специ­фических методов лечения одним из эффективных подходов явились трансфузии плазмы крови вы­здоровевших пациентов (плазмы реконвалесцентов). Лечение с помощью трансфузий плазмы, по­лученной от реконвалесцентов, представляет собой пассивную иммунизацию за счет введения антител к инфекционному агенту. Такой метод лечения име­ет богатую историю, начиная с пандемии «испанки» более 100 лет назад [2][3][4][5][6][7]. Эффективность перелива­ния плазмы реконвалесцентов была показана также при эпидемии гриппа H1N1 в 2009 году [4].

На сегодняшний день нет средств этиотропной терапии COVID-19 с доказанной эффективностью. Высокая летальность, ассоциированная с COVID-19, потребовала неотложных решений, и по аналогии с предыдущими инфекциями, вызванными корона-вирусом, группы экспертов из разных стран пришли к выводу о целесообразности применения плазмы реконвалесцентов (convalescent plasma, или реконвалесцентная плазма, или, согласно «Временным рекомендациям МЗ РФ» (версия 6), применяется плазма антиковидная патогенредуцированная — ПАП) с лечебной целью у больных с COVID-19 [8][9]. В ряде стран запущены программы по заго­товке и клиническому использованию ПАП [8][9]. Основным параметром, обеспечивающим терапев­тическую эффективности плазмы реконвалесцентов, является наличие и титр вируснейтрализующих ан­тител (ВНА). В то же время в ряде работ показано, что выраженность иммунного ответа на COVID-19 различна, и антитела, нейтрализующие вирус, опре­деляются не у всех переболевших [10]. В этой связи при получении плазмы с высокой терапевтической эффективностью актуальным является тщательный отбор доноров-реконвалесцентов.

Цель настоящей работы — анализ опыта форми­рования донорского резерва из реконвалесцентов COVID-19 для заготовки ПАП.

В рамках пилотного проекта Департамента здраво­охранения города Москвы в ретроспективное исследо­вание включено 493 реконвалесцента COVID-19, про­шедших обследование в ГБУЗ «НИИ скорой помощи им. Н. В. Склифосовского ДЗМ» в качестве потенци­альных доноров ПАП. Средний возраст доноров со­ставил 36 лет (от 25 до 55 лет). Среди доноров были 271 (55 %) мужчина и 22 (45 %) женщины.

Заготовку ПАП осуществляли методом плазмафереза. Критериями отбора доноров были перенесен­ная инфекция COVID-19, подтвержденная выявле­нием методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) РНК SARS-CoV-2 в мазках из глотки, наличие меди­цинской документации (с указанием на два отрица­тельных результата на ПЦР РНК SARS-CoV-2), срок с момента выписки из стационара не менее 14 суток. В качестве характеристики ПАП был выбран титр ВНА. Анализировали связь между характеристиками доноров (пол, возраст, давность с момента начала забо­левания и регресса клинической симптоматики, осо­бенности течения COVID-19) и титром ВНА.

Одной из наиболее важных характеристик ПАП является наличие ВНА к COVID-19. В связи с отсут­ствием при разработке программы заготовки ПАП зарегистрированных тест-систем для скрининга ан­тител к SARS-CoV-2 в качестве критерия иммуно­логической состоятельности ПАП был выбран титр ВНА. Выполнение тестов осуществлялось в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» МЗ РФ. Данный ви­русологический метод основан на определении на­личия или отсутствия цитопатического действия в культуре клеток в зависимости от титра ВНА ана­лизируемой плазмы. Механизм нейтрализации осно­ван на высокоспецифичном взаимодействии антител с поверхностным гликопротеином S вируса, который отвечает за интернализацию вируса: поверхностный гликопротеин S областью рецептор-связывающего домена взаимодействует с рецептором ангиотензин- превращающего фермента-2 (АПФ-2) на поверхности клеток, что запускает каскад реакций, приводящих к проникновению вирусных частиц в клетку. Реакцию нейтрализации ставили в варианте постоянной дозы вируса — разведения плазмы. Готовили разведения плазмы в культуральной среде ДМЕМ с 2 % инак­тивированной фетальной бычьей сывороткой, далее смешивали со 100 TCID50 (tissue culture infectious dose 50) вируса SARS-CoV-2, инкубировали 1 час при 37 °C, после чего добавляли к клеткам Vero E6 (посевная плотность 2 х 104 /клеток на лунку), затем клетки культивировали при температуре 37 °C и кон­центрации СО 5 % в течение 96 часов и производи­ли учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток. За титр ВНА исследуемой плаз­мы принимали высшее ее разведение, при котором происходило подавление цитопатического действия в 2 лунках из 3. В соответствии с рекомендациями Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration — FDA) [10] титр ВНА 1:160 и более отнесли к высоким значениям, титр ВНА 1:80 — к промежуточным значениям. При опре­делении в плазме ВНА в меньших титрах (1:40 и 1:20) их относили к низким значениям. Отсутствие ВНА в плазме соответствовало значениям от 1:20 и менее. ПАП с низкими титрами ВНА или без них для кли­нического использования не выдавалась.

Взятие крови на исследование титра ВНА осуществ­ляли непосредственно перед проведением донорского плазмафереза. В рамках настоящего анализа оцени­вали зависимость ВНА от возраста, пола, особенно­стей течения заболевания (наличие или отсутствие проявлений легочного поражения, выраженность температурной реакции, результаты ПЦР диагности­ки SARS-CoV-2), времени от появления и регресса клинической симптоматики. Источником получения информации служила медицинская документация (выписной эпикриз) и результаты анкетирования до­норов.

Статистическая обработка выполнена в среде Python. Данные описательной статистики представле­ны в виде среднее ± стандартное отклонение или ме­диана (межквартильный интервал). Проводился од­нофакторный и многофакторный дисперсионный анализ, ранговая регрессия и корреляция по методу Спирмена. Были использованы критерии Манна — Уитни и хи-квадрат.

Высокий титр ВНА (1:160 и более) выявлен у 21,1 % доноров, промежуточный (1:80) — у 24,75 %.

Распределение доноров плазмы в зависимости от титра ВНА представлено на рисунке 1. У 78 доно­ров ВНА в плазме не выявлены, в 189 случаях титр ВНА был низкий (1:20—1:40), у 104 — промежуточный (1:80), у остальных 122 доноров титр ВНА высокий (1:160 и выше). Среди переболевших только у 24,7 % доноров в плазме определялись высокие титры ВНА, то есть только четверть потенциальных доноров ПАП может рассматриваться как эффективные доноры.

Проведен анализ влияния демографических дан­ных и клинического течения COVID-19 на титр ВНА. Полученные при анализе медицинской доку­ментации и дополнительного анкетирования данные представлены в таблице 1.

Назвать точную дату начала и окончания заболева­ния смогли 476 доноров, 18 — затруднились ответить на данный вопрос в анкете. Наличие температуры во время болезни смогли уточнить 394 донора, в 99 ан­кетах данные графы не были заполнены. Данные о на­личии либо отсутствии пневмонии предоставили толь­ко 447 доноров, у 46 реконвалесцентов, перенесших COVID-19 в амбулаторных условиях, рентгенологиче­ское исследование не проводилось.

Плазмаферез проводился в среднем через 14 дней с момента исчезновения симптоматики, что соответст­вовало завершению обсервационного периода. Период от начала заболевания до заготовки плазмы составил 35 дней (от 31 до 92 дней). Это связано с тем, что многие доноры с высоким титром ВНА приглашались повтор­но для проведения плазмафереза. У 15 доноров найти уточненные данные о дате первичного исследования на РНК вируса SARS-CoV-2 не удалось, у 475 доноров имелись данные о положительных мазках на РНК ви­руса SARS-CoV-2, у 3 — отрицательные. В связи с тем что в 475 (99 %) наблюдениях данной выборки имелся положительный результат теста на РНК вируса SARS- CoV-2, исследование корреляционной зависимости между титром ВНА и отсутствием-наличием у донора данного параметра не проводилось.

Период от начала заболевания и время, прошедшее с момента выздоровления, были одними из основных критериев отбора потенциального донора-реконва- лесцента для проведения плазмафереза. При одно­факторном анализе взаимосвязи интервала от нача­ла и окончания заболевания с величиной титра ВНА были обнаружены: отсутствие зависимости от периода после выздоровления до плазмафереза (коэффициент корреляции r = 0,058675, p = 0,2) и слабая, но досто­верная зависимость титра ВНА в пробе крови донора перед донацией от продолжительности периода, кото­рый прошел с момента появления первых симптомов до плазмафереза (r = 0,13, p = 0,0042, 95 % доверитель­ный интервал (ДИ) 0,041597—0,218293).

Для анализа зависимости содержания ВНА у до­нора от периода, прошедшего с дебюта новой коронавирусной инфекции до донации плазмы, все реконвалесценты были разделены на 5 групп в соот­ветствии с количеством дней, прошедших от дебюта за­болевания до плазмафереза: 1-я группа — до 20 дней, 2-я группа — 21—30 дней, 3-я группа — 31—40 дней, 4-я группа — 41—50 дней и 5-я группа — 51 и более дней. Выявлена меньшая вероятность заготовки плазмы с высоким титром ВНА, если плазмаферез проводился в интервале 21—40 дней с дебюта заболевания (табл. 2). Наибольшая доля плазмодач с высоким титром ВНА регистрировалась у доноров, которые были рекру­тированы по истечении 41 дня с начала заболевания. В группе 1 было недостаточно наблюдений для прове­дения статистического анализа.

При однофакторном анализе зависимости заготовки плазмы с высоким титром ВНА от возраста была вы­явлена слабая, но достоверная корреляция: коэффици­ент корреляции r = 0,13, p = 0,0032, 95 % ДИ 0,044—0,217 (табл. 3). Выявлено, что в средней возрастной группе (36—55 лет) вероятность заготовки плазмы с высоким ВНА выше, чем у более молодых доноров.

Результаты, полученные при изучении зависимости титра ВНА заготовленной плазмы от пола, наличия в анамнезе вирусной пневмонии и выраженности тем­пературной реакции, представлены в таблице 4.

Вероятность заготовки ПАП с высоким титром ВНА (1:160 и выше) от доноров-мужчин оказалась значи­тельно выше, чем от доноров-женщин. При выявле­нии в анамнезе у донора верифицированной вирусной пневмонии вероятность заготовки плазмы с высоким титром повышалась в отличие от доноров без доказан­ной пневмонии в анамнезе. Однако данный критерий не имел достаточной прогностической ценности ввиду невысокой чувствительности. Наличие высокой тем­пературной реакции во время болезни также оказа­лось специфичным, но недостаточно чувствительным критерием отбора доноров. При многофакторном ана­лизе зависимости заготовки плазмы с высоким титром ВНА от отдельных донорских параметров (табл. 5) наибольшая связь выявлена с мужским полом донора, с возрастом донора и наличием верифицированной вирусной пневмонии, а также с наличием-отсутствием лихорадки. Интервал от начала заболевания до донации оказался менее значимым, чем в однофакторном анализе.

Как показало данное исследование, не у всех лиц, перенесших COVID-19, может быть выполнена эффективная донация ПАП. Чуть меньше половины заготов­ленной плазмы содержит промежуточные или высокие титры ВНА и, соответственно, может быть использо­вано для клинического применения в соответствии с рекомендациями FDA [10]. Таким образом, заго­товка ПАП от всех реконвалесцентов COVID-19, вы­сказавших желание быть донором иммунной плазмы, экономически нерентабельна из-за большого объе­ма брака по показателю иммунной эффективности. Предварительное тестирование на ВНА с ожидани­ем результатов в течение нескольких дней тоже чре­вато ресурсными потерями. В этой связи необходимы простые и доступные критерии, позволяющие макси­мально отобрать потенциально эффективных доноров на ранних этапах.

Данные литературы по обсуждаемой проблеме ог­раничены. S. L. Klein и соавт. [11] сообщили о резуль­татах донаций у 126 реконвалесцентов COVID-19. В исследованной группе было больше мужчин (56 %), чем женщин, средний возраст реконвалесцентов соста­вил 42 года, плазму собирали в среднем через 43 дня (межквартильный интервал 38—48 дней) после первона­чального теста ПЦР на SARS-CoV-2. Авторы не уточни­ли критерии отбора доноров, но привели информацию о том, что большинство из них перенесли заболевание в среднетяжелой форме, госпитализированных было менее 10 %. У всех реконвалесцентов исследование титра ВНА было произведено с использованием клеток Vero-E6-TMPRSS2. Была обнаружена зависимость содержания ВНА от демографических параметров. Таким образом, авторы выделили два наиболее значи­мых параметра — это мужской пол и старшая возраст­ная группа [11].

Результаты, полученные в настоящем исследова­нии, выявили схожие закономерности. Среди до­норов, у которых была выполнена эффективная донация ПАП, больше мужчин — 55 %, интервал от начала заболевания до донации был несколь­ко короче — 35 дней (31—92 дня). Также показано, что вероятность заготовки плазмы с высоким титром ВНА значимо больше у доноров мужчин в возрасте 36—55 лет по сравнению с более молодыми донора­ми. В отличие от исследования S. Klein и соавт. [11], настоящее исследование было проведено на группе из 493 доноров; кроме того, выявлен еще один неза­висимый параметр, ассоциированный с высоким ти­тром ВНА, — это наличие вирусной пневмонии в пе­риод заболевания.

Таким образом, наиболее значимыми критериями отбора доноров-реконвалесцентов для заготовки ПАП COVID-19 являются: мужской пол донора-реконвалес- цента и наличие верифицированной вирусной пневмо­нии, температурная реакция выше 39 °C во время за­болевания.