Согласно классификации ВОЗ опухолей гемопоэтической и лимфоидной тканей, химерный ген BCR- ABLl является молекулярным маркером хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), а мутации генов JAK2, CALR и MPL — молекулярными маркерами, характер­ными для истинной полицитемии (ИП), эссенциальной тромбоцитемии (ЭТ) и первичного миелофиброза (ПМФ) [1]. В большинстве случаев у больных миелопролиферативными новообразованиями (МПН) лейкемический клон несет в себе одну из драйверных мутаций. Тем не менее, по данным литературы, сочетание двух драйверных мутаций при МПН не является ред­ким событием. Химерный ген BCR-ABLl может вторич­но выявляться у части больных с JAK2V617F+ ИП [2][3][4][5][6][7], ЭТ [8][9][10][11][12][13] и ПМФ [14][15] или, наоборот, после успеш­ной элиминации BCR-ABLl+ клона у больных ХМЛ может вторично выявляться JAK2V617F+ и CALR+ ИП, ЭТ [16] и ПМФ. Частота сочетания химерного гена BCR- ABLl и мутации JAK2V617F в различных популяциях больных ХМЛ сильно варьирует. Если J. Jelinek и соавт. [17] из США при исследовании 99 больных ХМЛ не нашли ни одного случая сочетания транскрипта BCR-ABLl и JAK2V617F, то другие авторы из США, увеличив объем выборки до 1570 больных ХМЛ, выя­вили сочетание клонов у 0,4 % (6/1570) больных [18]. Частота сочетания транскрипта BCR-ABLl и JAK2V617F у больных ХМЛ в исследованиях немецких авторов составила 0,2 % (23/1487) [19], а у польских — 0,7 % [20]. По данным мексиканского исследования, прове­денного на небольшой выборке из 142 больных различ­ными видами МПН, частота сочетания двух клонов составила 12,7 % [21]. Наибольшая частота сочетаний транскрипта BCR-ABLl и JAK2V617F отмечена авторами из Пакистана — 26,7 % [22]. Открытые в 2013 г. мута­ции 9-го экзона гена CALR выявляются в 70—84 % слу­чаев Jak2 и MPL-негативных ЭТ и ПМФ, в 8 % случа­ев миелодиспластического синдрома и не выявляются при ХМЛ [23][24][25]. Тем не менее за 2014—2019 гг. опи­саны 12 клинических наблюдений сочетания химер­ного гена BCR-ABLl и мутации 9-го экзона гена CALR [26][27][28][29][30][31][32][33][34][35][36][37]. Частота такого сочетания описана в польской популяции больных ХМЛ и составляет 0,17 % [17].Целью данного исследования явилось определение частоты сочетаний и кинетики уровня транскрипта BCR-ABLl и аллельной нагрузки мутаций генов JAK2, MPL и CALR у больных ХМЛ при терапии ингибитора­ми тирозинкиназ (ИТК).Материалы и методыВ исследование было включено 567 больных ХМЛ, получавших терапию препаратами ИТК, которым проводили мониторинг уровня химерного транс­крипта BCR-ABLl в ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России с 2012 по 2019 гг. Выделение мРНК и ДНК осуществлялось набором реаген­тов компании «Интерлабсервис» (Россия) соглас­ но инструкции производителя. Количественная оценка уровня транскриптов (Mbcr b3a2 и b2a2) BCR-ABLl была проведена с использованием амплификатора Rotor-Gene О (OIAGEN, Германия) и набо­ра реагентов «АмплиСенс® Лейкоз Квант M-bcr-FRT» («Интерлабсервис», Россия). Результаты анализов рассчитаны по международной шкале с учетом фактора конверсии. Поиск мутаций JAK2V617F и MPLw515lik был осуществлен с использованием количественной аллель-специфической (АС) полимеразной цепной реакции в реальном времени. Мутации гена CALR ис­следованы фрагментным анализом с последующим секвенированием по Сэнгеру. В исследованиях были использованы наборы реагентов компании «Синтол» (Россия).РезультатыВ результате исследования образцов мРНК и ДНК клеток крови 567 больных с BCR-ABLl+ ХМЛ мутация JAK2V617F была выявлена у 5 больных, а мутации 9-го экзона гена CALR — у 2 больных. Сочетание BCR-ABLl с мутацией MPLW515L/K не было выявлено ни у одного больного ХМЛ (табл. 1). Таблица 1. Общие сведения о больных XMJI с мутациями JAK2v:i1 F и CALR тип-1, -2Table 1. General information about CML patients with JAK2yo] F and CALR type-1, 2 mutationsПримечание. ХМЛ — хронический миелолейкоз, ПМФ — первичный миелофиброз, ЭТ — эссенциальная тромбоцитемия, IS — международная шкала, ПЦО — полный цитогенетический ответ, БМО — большой молекулярный ответ; * — временной интервал (мес) между выявлением двух мутаций.Note. CML — chronic myeloid leukemia, PMF — primary myelofibrosis, PV — Polycythemia Vera, TKI - tyrosine kinase inhibitor; ET — essential thrombocythemia, IS — international scale, CCyR — complete cytogenetic response, MMR — major molecular response; * — time interval (months) between detection of two mutations. Клиническое наблюдение 1. Больной Ш. Д.А., 59 лет. У больного в октябре 2012 г. в клиническом анализе крови были выявлены лейкоцитоз (144 х 109/л) и тромбоцитоз (904 х 109/л), в миелограмме — бластные клетки 4 %, расширение гранулоцитарного ростка, базофилы 10,5 %, эозинофилы 8 %. Отмечены гепа- томегалия и спленомегалия (+3 и +15 см из-под края реберной дуги, соответственно). При гистологиче­ском исследовании трепанобиоптата костного мозга обнаружена морфологическая картина ХМЛ и ПМФ (рис. 1 А и В). Молекулярно-генетическое исследова­ние выявило уровень транскрипта BCR-ABLl — 80 % и аллельную нагрузку мутации JAK2V617F — 73 %. Установлен клинический диагноз «ХМЛ, хроническая фаза, промежуточная группа риска по Sokal», и начата терапия иматинибом в дозе 400 мг/сут. Через 8 меся­цев после начала терапии иматинибом уровень транс­крипта BCR-ABLl снизился в 1000 раз (с 80 до 0,08 %), а аллельная нагрузка мутации JAK2V617F снизилась в 3,5 раза (с 73 до 21 %). При повторном исследовании в ноябре 2013 г. уровень транскрипта BCR-ABLl со­ставил 0,014 %, а мутация JAK2V617F снизилась до 5 %. Учитывая сохраняющиеся тромбоцитоз и спленоме- галию на фоне глубокого молекулярного ответа (МО) по уровню транскрипта BCR-ABLl, а также биклональный характер миелопролиферативного заболевания, с марта 2015 г. к терапии добавлен интерферон альфа в дозе 3 млн МЕ через день. С июня 2018 г. больно­му прекращена терапия иматинибом и продолжена монотерапия интерфероном альфа в дозе 3 млн МЕ через день. К августу 2019 г. уровень транскрипта BCR- ABLl достиг 0,061 %, т.е. глубокой молекулярной ре­миссии, а аллельная нагрузка JAK2V611F стабилизирова­лась в пределах 28—34 % (рис. 1 С). Рисунок 1. А — гиперклеточный костный мозг с трехростковой гиперплазией: эритроидный росток с выраженными признаками омоложения, в виде «рассыпающихся» кластеров эритрокариоцитов, присутствовали мегалобластоидные формы; гранулоцитарный росток — на всех этапах дифференцировки. Мегакариоциты полиморфны по размерам и морфологии, располагались разрозненно и в виде единичных рыхлых кластеров. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. *200. В —степень ретикулинового фибро­за стромы MF-0 с участками MF-1 менее 30 %. Окраска по Гомори. Ув. *200. С — кинетика уровня транскрипта BCR-ABLl и аллельной нагрузки JAK2V617FFigure 1. A — hypercellular bone marrow with panmyelosis. Loose clusters of eryfhrokaryocyfes with an increased count of erythroid precursors with the presence of megaloblastoid forms. For granulocytic linage, every stage of differentiation is detectable. Megakaryocytes with notable pleomorphism in size and nuclear morphology tending to form occasional loose clusters. Stain: H&E. Magnification: *200. B — stromal reticulin fibrosis grade MF-0, with less than 30 %. Gomori stain. Magnification: *200. C — kinetics of the transcript level BCR-ABLl and allelic load JAK2V617F Клиническое наблюдение 2. Больная Б. Е.Н., 61 год. В 2007 г. ей был установлен диагноз ИП на основании эритроцитоза (7,42 х 1012/л), лейкоцитоза (14,9 х 109/л), спленомегалии и морфологического исследования тре- панобиоптата костного мозга (рис. 2 А и В). При моле­кулярно-генетическом анализе обнаружена мутация JAK2V611F. Больной была начата терапия гидроксикар- бамидом в дозе 1 г 2 раза в день. Тем не менее через 5 лет от начала цитостатической терапии, в марте 2012 г., в крови отмечено нарастание лейкоцитоза до 30,5 х 109/л. В трепанобиоптате костного мозга отмечалось расшире­ние гранулоцитарного ростка за счет промежуточных форм, клеток с незрелой морфологией, более харак­терной для ХМЛ (рис. 2 А и В). При молекулярно-ге­нетическом исследовании обнаружены транскрипт BCR-ABLl в количестве 49,53 % и мутация JAK2V611F с аллельной нагрузкой 95 %. Клинический диагноз ИП был дополнен ХМЛ, и начата терапия иматинибом в дозе 400 мг/сут. Спустя два с половиной месяца тера­пии из-за токсического э фф екта иматиниб был заменен на нилотиниб в дозе 800 мг/сут. К марту 2014 г. уровень транскрипта BCR-ABL1 снизился до 0,29 %, а аллельная нагрузка JAK2V611F увеличилась до 100 % (рис. 2 С). Рисунок 2. А — гиперклеточный костный мозг с трехростковой гиперплазией: эритроидный росток расширен, с выраженными признаками омоложения. Гранулоцитарный росток умеренно расширен, на всех этапах дифференцировки. Мегакариоциты полиморфны по размерам и морфологии, располагаются разрозненно и виде единичных рыхлых кластеров межтрабекулярно. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. *200. В — степень ретикулинового фиброза стромы MF-1. Окраска по Гомори. Ув. *200. С — кинетика уровней транскрипта BCR-ABL1 и аллельной нагрузки JAK2V617F у больной Б. Е.Н.Figure 2. A — hypercellular bone marrow with panmyelosis. Erythropoiesis is normoblastic with multiple erythroid precursors. Granulopoiesis is moderately expanded, with cells being at various differentiation stages. Numerous megakaryocytes with a significant difference in size and morphology tending to form occasional intertrabecular loose clusters. Stain: H&E. Magnification: *200. B — stromal reticulin fibrosis grade MF-1. Stain: Gomori silver. Magnification: *200. C — kinetics of the BCR-ABLl transcript level and allele burden of JAK2V617F Клиническое наблюдение 3. Больная Х. Е.С., 51 год. Диагноз ХМЛ у нее был установлен в июне 2001 г. на основании лейкоцитоза (44 х 109/л) и обнаружения при стандартном цитогенетическом исследовании (СЦИ) транслокации t(9;22) (q34;q11) в 100 % метафазных ядер клеток крови. Больной была начата терапия интерфероном альфа в дозе 10 млн МЕ/сут в сочетании с малыми дозами цитарабина. С июня 2003 г. назна­чен иматиниб в дозе 400 мг/сут, затем в связи с отсут­ствием цитогенетического ответа — 600 мг/сут. В связи с цитогенетической резистентностью через 4 года лече­ния иматинибом больная была переведена на терапию ИТК 2-го поколения дазатинибом. Однако за 3 года терапии дазатинибом в максимальной дозе 140 мг/сут удалось получить лишь кратковременный цитогене­тический ответ (Ph+ в 66 % метафазных ядер), в связи с чем вновь произведена смена ИТК, и с марта 2010 г. начата терапия нилотинибом в дозе 800 мг/сут. Однако за 4 года терапии нилотинибом не удалось получить полный гематологический ответ, в крови сохранялся умеренный тромбоцитоз (600 х 109/л) и эритроцитоз (5,4 х 1012/л). Удалось получить только частичный ци­тогенетический ответ (Ph+ в 23 % метафаз) и снижение уровня транскрипта BCR-ABL до 3,36 %. Эти обстоя­тельства послужили причиной поиска других драй- верных мутаций МПН, и в октябре 2014 г. в клетках крови больной была обнаружена мутация JAK2V611F с аллельной нагрузкой 9,1 %. Ретроспективное иссле­дование аллельной нагрузки мутации JAK2V611F показа­ло, что впервые мутация JAK2V611F с уровнем 1 % появи­лась в январе 2012 г. и имела тенденцию к неуклонному росту аллельной нагрузки. Гистологическое исследо­вание трепанобиоптата костного мозга выявило карти­ну, характерную для ЭТ (рис. 3 А и В). Таким обра­зом, у больной с BCR-ABL1+ ХМЛ было констатировано наличие второго МПН — ЭТ с мутацией JAK2V611F. Учитывая плохую переносимость терапии интерферо­ном в прошлом, было рекомендовано продолжить тера­пию нилотинибом (800 мг/сут) в сочетании с гидрокси- карбамидом (0,5—1 г/сут). В результате проводимого лечения достигнута гематологическая ремиссия, одна­ко за 16 лет терапии препаратами ИТК ни разу не уда­лось достичь большого МО (БМО). К сентябрю 2019 г. уровень транскрипта BCR-ABL1 составил 3,02 %, а ал­лельная нагрузка мутации JAK2V617F осталась без изме­нений и составила 20 % (рис. 3 С). Рисунок 3. А — нормоклеточный костный мозг: гранулоцитарный росток в умеренном количестве, с преобладанием зрелых форм. Эритроидный росток в достаточном количестве, в виде мелких скоплений эритрокариоцитов нормобластического ряда. Мегакариоциты — в увеличенном количестве, обычных и крупных размеров, с атипичной морфологией, гиперлобулярными нормохромными ядрами, располагаются разрозненно. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. *200. В — степень ретикулинового фиброза MF-0 на большем протяжении. Окраска по Гомори. Ув *200. С — кинетика уровней транскрипта BCR-ABLl и аллельной нагрузки JAK2V617F у больного Х. Е.С.Figure 3. A — normocellular bone marrow. The granulocytes count lies within the normal range with the predominance of mature forms. Erythroid lineage is sufficient, erythrokaryocytes form small clusters. The megakaryocytes count is elevated; there are normal to large forms, with atypical morphology, hyperlobular normochromic nuclei. No clusters of megacaryocytes. Stain: H&E. Magnification: *200. B — stromal reticulin fibrosis grade MF-0. Stain: Gomori silver. Magnification: *200. C — kinetics of the BCR-ABLl transcript level and allele burden of JAK2V6l7F Клиническое наблюдение 4. Больная К. Н.Н., 60 лет. В 2002 г. впервые у больной была выявлена спленомегалия (+1 см из-под края реберной дуги), повышенная кровоточивость из мелких ран, чувство тяжести и боль в левом подреберье. Показатели гемограммы были удовлетворительными (гемоглобин — 124 г/л, лейкоци­ты — 2,9 х 109/л, тромбоциты — 170 х 109/л), и поэтому больной было назначено симптоматическое лечение.Однако в июне 2004 г. отмечено нарастание лейкоци­тоза до 70 х 109/л и спленомегалии, а при гистологиче­ском исследовании трепанобиоптата костного мозга обнаружены морфологические признаки, характерные для ПМФ. Последующие 3 года больная с кратковре­менным терапевтическим эффектом получала цитостатическую (гидроксикарбамид 1 г/сут) и иммуномоду­лирующую (интерферон альфа 3 млн МЕ/сут) терапию. Тем не менее в феврале 2007 г. отмечено нарастание лейкоцитоза до 37 х 109/л и спленомегалии (+5 см из- под края реберной дуги), а при цитогенетическом ис­следовании обнаружена транслокация t(9;22) (q34;q11). Больной установлен диагноз ХМЛ, и с апреля 2007 г.начата терапия иматинибом в дозе 600 мг/сут. Спустя 3 месяца из-за аллергической реакции (крапивница) был отменен иматиниб, и с августа 2007 г. начата те­рапия нилотинибом в дозе 800 мг/сут. Через 6 месяцев был достигнут полный цитогенетический ответ (ПЦО), а через год — БМО. Однако, несмотря на достижение ПЦО и БМО, сохранялись выраженная спленомегалия, умеренная анемия и тромбоцитопения, единичные миелоциты и нормобласты в крови, постоянный уме­ренный внутриклеточный гемолиз. По данным повтор­ного гистологического исследования трепанобиоптата костного мозга, выполненного в июне 2012 г., выявлены изменения, характерные для фиброзной стадии ПМФ (рис. 4 А и В), а молекулярно-генетический анализ пока­зал наличие мутации JAK2V617F с аллельной нагрузкой 59 %. С учетом сохраняющегося стабильного глубо­кого МО в течение 4 лет было решено отменить нило- тиниб и продолжить терапию только гидроксикарбамидом в дозе 0,5—1 г/сут. Однако в связи нарастанием спленомегалии, портальной гипертензии и явлений гиперспленизма (тромбоцитопения, анемия) в апреле 2013 г. была выполнена спленэктомия. В августе 2019 г. при молекулярно-генетическом анализе транскрипт BCR-ABL1 не обнаружен, а аллельная нагрузка мута­ции JAK2V617F составила 48 % (рис. 4 С). Рисунок 4. А — гиперклеточный костный мозг за счет расширения гранулоцитарного и мегакариоцитарного ростков; клеточные элементы расположены в виде «цугов». Гранулоцитарный росток представлен преимущественно зрелыми формами с очаговым увеличением эозинофильных гранулоцитов. Мегакариоциты полиморфны по размерам, с атипичной морфологией, расположены разрозненно и в виде рыхлых и плотных кластеров. Эритроидный росток — в умеренном количестве, представлен кластерами эритрокариоцитов нормобластического ряда. Остеосклероз grade 2-3. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. *200. В — степень ретикулинового фиброза стромы MF-3. Окраска по Гомори. Ув. *200. С — кинетика уровней транскрипта BCR-ABLl и аллельной нагрузки JAK2V6l7Fу больного К. Н.Н.Figure 4. A — bone marrow is hypercellular due to the expansion of granulo- and megakaryopoesis. Hematopoetic cells are arranged in cords due to dense stomal fibrosis. Granulocytes are predominantly represented by mature forms with a focal increase in eosinophilic granulocytes count. Megakaryocytes vary in size with atypical morphology, noticeably tending to form loose and dense clusters. Erythroid cell count lies within the normal range and the lineage is represented by normoblastic erythrokaryocytes clusters. Osteosclerosis grade 2-3. Stain: H&E. Magnification: *200. B — stromal reticulin fibrosis grade MF-3. Stain: Gomori silver. Magnification: *200. C — kinetics of the BCR-ABLl transcript level and allele burden of JAK2V6l7F Клиническое наблюдение 5. Больной Д. Л.А., 55 лет. Диагноз ИП установлен в феврале 2011 г. на осно­вание гепатоспленомегалии (печень и селезенка вы­ступали на 1 см из-под края реберной дуги), плето­рического синдрома и изменений в анализе крови (гемоглобин — 201 г/л, эритроциты — 9,53 х 1012/л, лейкоциты — 11,65 х 109/л и тромбоциты — 476 х 109/л, СОЭ — 0,5 мм/ч). Больному были рекомендованы эритроцитаферез и циторедуктивная терапия гидроксикарбамидом в дозе 1 г/сут. Однако, несмотря на проводимую терапию, через 3 месяца отмечено нарастание лейкоцитоза с 11,65 х 109 до 50 х 109/л. При СЦИ в 22 % метафазных ядер обнаружена му­тация t(9;22) (q34;q11), а молекулярно-генетический анализ выявил транскрипт BCR-ABL1. На основании результатов вышеуказанных исследований уста­новлен клинический диагноз — ХМЛ, хроническая фаза, и начата терапия иматинибом в дозе 400 мг/сут. Спустя 6 месяцев после начала терапии иматинибом был достигнут ПЦО, но сохранялись выражен­ный плеторический синдром: в крови эритроцитоз (7,2 х 1012/л), тромбоцитоз (701 х 109/л) и лейкоцитоз (11,47 х 109/л) без сдвига лейкоцитарной формулы. В сентябре 2012 г. при гистологическом исследовании трепанобиоптата костного мозга обнаружена выра­женная картина ИП (рис. 5 А и В), а молекулярно-ге­нетический анализ показал наличие мутации JAK2V617F с аллельной нагрузкой 70,6 %. Было принято реше­ние увеличить дозу иматиниба с 400 до 600 мг/сут. К сентябрю 2013 г. был достигнут БМО, а аллельная нагрузка на мутацию JAK2V617F снизилась до 56 %. Однако через 4 года после достижения стабильного БМО в мае 2017 г. из-за развития негематологической токсичности (задержка жидкости, нестабильное АД) иматиниб был заменен на интерферон альфа в дозе 3 млн МЕ через день. Рисунок 5. А — гиперклеточный костный мозг за счет трехростковой гиперплазии: эритроидный росток был представлен в виде «рассыпающихся» скоплений эритрока- риоцитов нормобластического ряда, с признаками омоложения; гранулоцитарный росток на всех этапах дифференцировки. Мегакариоциты — полиморфны по размерам и морфологии, располагались преимущественно разрозненно. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. *200. В — степень ретикулинового фиброза стромы MF-0 с участками MF-1 менее 30 %. Окраска по Гомори. Ув. *200. С — кинетика уровня транскрипта BCR-ABLl и аллельной нагрузки мутации JAK2V6l7Fу больного Д. Л.А.Figure 5. A — hypercellular bone marrow with panmyelosis. Erythropoiesis is normoblastic, represented by large loose groups of erythroid cells with the "left shift". Granulocytes at every differentiation stage are detectable. Numerous megakaryocytes vary in size and morphology; they are predominantly loosely scattered. Stain: H&E. Magnification: x.B — stromal reticulin fibrosis grade MF-0, with less than 30 % of MF-l areas. Stain: Gomori silver. Magnification: x200. C — kinetics of the BCR-ABLl transcript level and allele burden of JAKCv6m Клиническое наблюдение 6. Больной К. Ю.А., 66 лет. Клинический диагноз ХМЛ, хроническая фаза был установлен ему в августе 2015 г. на осно­вании лейкоцитоза (17,2 х 109/л), гепатоспленомега­лии (печень и селезенка на 2 см выступали из-под реберной дуги) и наличия мутации t(9;22) (q34;q11) в 55 % метафазных ядрах клеток крови. При молекулярно-генетическом анализе уровень химерного транскрипта BCR-ABL1 составил 78,15 %. Больному была начата терапия иматинибом в дозе 400 мг/сут. За 4 месяца терапии иматинибом отмечено снижение количества лейкоцитов до 6,8 х 109/л и уровня транс­крипта BCR-ABL1 до 2,79 %, что сопровождалось на­растанием тромбоцитоза с 334 х 109 до 1279 х 109/л. При гистологическом исследовании трепанобиоптата костного мозга были выявлены морфологические признаки ПМФ (рис. 6 А и В), а молекулярно-гене­тическое исследование обнаружило мутацию CALR c.1099_1150del. p. L367fs*46. К терапии с иматинибом в дозе 400 мг/сут добавлен гидроксикарбамид 1 г/сут. По данным молекулярно-генетических исследова­ний, с января 2017 г. сохраняется БМО, а уровень аллельной нагрузки мутации CALRpl5677j46 остается в пределах 40—50 % (рис. 6 С). Рисунок 6. А — гиперклеточный костный мозг с гиперплазией гранулоцитарного и мегакариоцитарного ростков. Среди клеток гранулоцитарного ряда преобладают зре­лые формы, много клеток эозинофильного ряда. Эритроидный росток в достаточном количестве, часть клеток с омоложением. Отмечается пролиферация мегакариоцитов. Мегакариоциты полиморфны (от крупных клеток со зрелой морфологией, гиперсегментированными ядрами до небольшого размера клеток с гиполобулярными ядрами, нарушенным ядерно-цитоплазматическим соотношением), формируют отдельные рыхлые кластеры. В — при окраске по Гомори степень ретикулинового фиброза MF-2. С — кинетика уровней транскрипта BCR-ABLl и аллельной нагрузки мутации CALRp. L367fs*46Figure 6. A — hypercellular bone marrow with the expansion of predominantly two cell lineages of myelopoesis. Granulocytic expansion with predominantly mature forms, focal increase of eosinophilic granulocytes count. Erythroid cell count lies within the normal range and the lineage is represented by normoblastic erythrokaryocytes clusters with the admixture of erythroid precursors. Megakaryocytes are polymorphic (from large mature cells with hypersegmented nuclei to small ones with hypolobulated nuclei and disturbance of the nuclear to cytoplasmic ratio), form distinct loose clusters. Stain: H&E. Magnification: x20G.B — stromal reticulin fibrosis grade MF-2. Stain: Gomori silver. Magnification: *200. C — kinetics of the BCR-ABLl transcript level and allele burden of CALRp. L367fs*46 Клиническое наблюдение 7. Больной В. В.С., 66 лет. Диагноз ХМЛ установлен в октябре 2000 г., и до июня 2004 г. больной получал терапию препаратами ин­терферона альфа. С июля 2004 г. начато лечение иматинибом (400 мг/сут), и через год достигнут БМО. Несмотря на стабильно сохраняющийся БМО, в мар­те 2017 г. отмечен тромбоцитоз (более 1000 х 109/л). Последующий молекулярно-генетический анализ обнаружил мутацию CALR c.1154_1155insTTGTC (p.K385fs*47) с аллельной нагрузкой 48 %, а гистоло­гическое исследование трепанобиоптата костного моз­га выявило морфологическую картину ЭТ. С учетом стабильно сохраняющегося глубокого МО иматиниб был заменен на интерферон альфа в дозе 3 млн МЕ х 3 раза в неделю, после чего количество тромбоцитов снизилось до нормальных значений. С 2006 г. уровень транскрипта BCR-ABL1 не детектируется, а аллель­ная нагрузка мутации CALR c.1154_1155insTTGTC (p.K385fs*47) с момента обнаружения находится в диа­пазоне 41—48 % (рис. 7). Рисунок 7. Кинетика уровней транскрипта BCR-ABLl и аллельной нагрузки CALR c.1154_1155insTTGTC p.K385fs*47 у больного В. В.СFigure 7. Kinetics of the BCR-ABLl transcript level and allele burden of CALR c.1154_1155insTTGTC p.K385fs*47 ОбсуждениеПо данным литературы, частота сочетания химерно­го гена BCR-ABL1 и мутации JAK2V617F у больных ХМЛ в различных популяциях широко варьирует: в США — 0,4 % [17][18], Германии — 0,2 % [19], Польше — 0,7 % [20], Мексике — 12,7 % [21], Пакистане — 26,7 % [22]. Сочетания химерного гена BCR-ABL1 и мутаций 9-го экзона CALR — относительно редкие явления, частота этих событий описана только для польской популяции больных ХМЛ и составляет 0,17 % [17]. В обследованной нами когорте больных ХМЛ часто­та сочетания химерного гена BCR-ABL1 с JAK2V617F со­ставила 0,88 % (5/567), а с мутациями 9-го экзона гена CALR — 0,32 % (2/567). Медиана возраста на момент обнаружения сочетаний химерного гена BCR-ABL1 и мутации JAK2V617F в США составила 66 лет (диапа­зон 48—81 год) [18], в Германии — 72 года (диапазон 46—80 лет) [19]. Медиана возраста обследованных нами больных на момент обнаружения двух мутаций составила 60 лет (диапазон 51—66 лет). Анализ гендер­ных различий в случаях сочетания транскрипта BCR- ABL1 и JAK2V611F показал незначительное преоблада­ние больных женского пола: от 52 % [19] до 64 % [18], тогда как в нашем исследовании большинство (4/7) составляли мужчины. При анализе литературных данных не удалось найти сведений о биологических закономерностях и хронологической последователь­ности приобретения химерного гена BCR-ABL1 и му­таций генов JAK2 и CALR. В представленном иссле­довании химерный ген BCR-ABL1 был выявлен ранее других мутаций в случаях 3, 6, 7; являлся вторым ге­нетическим событием в случаях 2, 4, 5 и одновремен­но — в случае 1. Частота одномоментного выявления двух генетических аномалий среди больных в США составила 45 % (5/11), а в 55 % (6/11) случаев времен­ной интервал был 87 месяцев (45—129 месяцев) [18]. В каждом случае ПМФ и ЭТ с мутацией JAK2V611F, а также в 3 случаях ИП с мутацией JAK2V611F в даль­нейшем были выявлены химерный транскрипт BCR- ABL1 и развитие ХМЛ [18]. Подобный клинический феномен трансформации JAK2V611F+ ИП в BCR-ABL1+ ХМЛ через 12—18 лет наблюдения описан и другими исследователями [6][38].Имеются данные о развитии JAK2V617F+ и CALR+ МПН у больных ХМЛ с цитогенетической и глубокой мо­лекулярной ремиссией [3][16]. В описанном нами на­блюдении № 7 CALR+ ЭТ был выявлен через 17 лет после установления клинического диагноза ХМЛ и при глубоком МО. Нерешенным остается вопрос, является ли химерный ген BCR-ABL1 и мутации генов JAK2V617F и CALR молекулярными событиями одной па­тогенетической цепи или нет. Результаты некоторых исследований показывают сложность молекулярного патогенеза МПН, зачастую не ограничивающегося тремя общепризнанными «драйверами». Известно, что в 47 % случаев «драйверным» мутациям предше­ствуют мутации генов DNMT5A, TET2, ASXL1, IDH2, SRSF2 и EZH2, вероятно, являющиеся предрасполага­ющими факторами геномной нестабильности гемопоэтической стволовой клетки (ГСК) [34][39][40]. Методом секвенирования следующего поколения (NGS — next generation sequencing) в образцах 23 больных с соче­танными мутациями BCR-ABL1 и JAK2V617F были обнаружены мутации в генах TET2, ASXL1, RUNX1, CBL, DNMT5A, PHF6, SF5B1 и TP55 с высокой частотой, что также может указывать на их роль в качестве пред­располагающих факторов в молекулярном патогенезе МПН [19].Анализ литературы показал, что кинетика отдель­ных клонов, определяемая по изменению уровня транскрипта BCR-ABL1 и аллельной нагрузки JAK2V617F и CALRmun 1,2, имеет свои особенности. В немецком ис­следовании у 88 % (16/18) больных ХМЛ определялась разновекторная кинетика транскрипта BCR-ABL1 и ал­лельной нагрузки JAK2V617F, что, по мнению авторов, является результатом сосуществования двух разных клонов [19]. Синхронная кинетика уровня транскрип­та BCR-ABL1 и аллельной нагрузки JAK2V617F под дейст­вием таргетной терапии препаратами ИТК наблюда­ется редко. Только у 18 % (2/11) больных ХМЛ в США отмечалось синхронное снижение уровня транскрип­та BCR-ABL1 и аллельной нагрузки JAK2V617F до неде­тектируемого уровня [18].В клиническом наблюдении 5 терапия иматинибом в дозе 400 мг/сут в течение 24 месяцев привела к син­хронному снижению уровня транскрипта BCR-ABL1 с 1,77 до 0 %, а аллельной нагрузки мутации JAK2V617F — с 76 до 1 %. Учитывая, что препараты ИТК являются селективными ингибиторами только рецепторных тирозинкиназ ABL1, KIT и PDGF, но не активны в отно­шении JAK2, мы предполагаем, что в этом случае обе мутации возникли в одной ГСК, давшей начало всему патогенному клону МПН.Какова прогностическая важность обнаружения сочетаний транслокации BCR-ABL1 с другими драйверными мутациями при МПН? Существует мнение, что мутация JAK2V617F может быть плохим прогностиче­ским маркером ранней прогрессии ХМЛ [22]. Анализ собственных результатов показал, что лишь в 28 % (2/7) случаев ХМЛ с мутацией JAK2V617F не был достиг­нут БМО при терапии препаратами ИТК. При этом в 72 % (5/7) случаев больные достигли глубокого МО, а у 4 больных с глубоким МО терапия ИТК была пре­кращена, и больные сохраняют молекулярную ремис­сию без таргетного лечения.По каким признакам можно подозревать наличие второго МПН? Наши данные подтверждают описан­ные в литературе наблюдения, свидетельствующие о несоответствии выявляемой гепатомегалии и спленомегалии, нарастающих тромбоцитоза, лейкоцитоза или эритроцитоза с уровнем цитогенетического отве­та или МО у больных ХМЛ, что является показани­ем к поиску других драйверных мутаций МПН [16]. В обследованной популяции больных ХМЛ наиболее частым признаком сопутствующего МПН были нара­стающие лейкоцитоз (в случаях 2, 4, 5) и тромбоцитоз (в случаях 6 и 7), часто не соответствующие уровню транскрипта BCR-ABL1.Не существует единой позиции и в вопросах фор­мирования клинического диагноза и выбора терапии. Например, по мнению американских ученых, совмест­ное появление транскрипта BCR-ABL1 и JAK2V617F чаще всего отражает два различных миелопролиферативных новообразования [18]. Клинико-фенотипическое доминировании одной из нозологий объясняется фе­номеном «пролиферативной конкуренции», согласно которой BCR-ABL1 является источником более силь­ной сигнализации, ведущей к более высокой пролифе­рации, чем мутация JAK2V611F или CALRmun 1,2 [14][22].Терапевтический эффект ингибиторов BCR-ABL1- тирозинкиназ проявляется изолированным сниже­нием уровня транскрипта BCR-ABL1, но не аллельной нагрузки мутаций генов JAK2 и CALR. В исследован­ной группе больных мы выделили три типа кинетики изменения уровни транскрипта BCR-ABL1 и аллельной нагрузки мутации JAK2V611F (рис. 8). Рисунок 8. Клональная архитектура МПН и кинетика уровней транскрипта BCR- ABLl и аллельной нагрузки мутации JAK2V617F под воздействием терапии препара­тами ИТКFigure 8. Clonal architecture of MPN and kinetics of the BCR-ABLl transcript level and allele burden ofJAK2V6l7F under TKI therapyПервый тип кинетики (параллельное снижению уров­ней транскрипта BCR-ABL1 и аллельной нагрузки му­тации JAK2V611F), наблюдаемый при таргетной терапии препаратами ИТК, характерен когда один клон несет две мутации (патогенез МПН является бимутационно-моноклональной) (рис. 8 А). Подобное наблюдение также описано GR. Soderquist и соавт. [18]. Второй тип кинетики (вектор кинетики уровня транскрипта BCR- ABL1 и мутации JAK2V611F имеет разнонаправленный характер — снижение уровня BCR-ABL1 сопровожда­ется ростом аллельной нагрузки JAK2V617F) характерен для МПН с двумя клонами, несущими в себе по одной мутации, как в описанном клиническом наблюдении 2 (рис. 8 В). В данном случае элиминация BCR-ABL1 клона под воздействием ИТК приводит к расширению JAK2V611F+ клона и фенотипической манифестации со­путствующего МПН [16]. Третий тип кинетики (ал­лельная нагрузка JAK2V611F сначала синхронно снижает­ся с уровнем BCR-ABL1, а затем их кинетика становится разнонаправленной) характерен для патогенеза МПН со сложной клональной архитектурой. Вероятно, сни­жение аллельной нагрузки JAK2V611F при терапии препа­ратом ИТК происходит за счет элиминации JAK2V611F+/ BCR-ABL1+ клона, как в случаях 1 и 5 (рис. 8 С). К ана­логичному выводу приходят также J. Grisouard и соавт. [12], описывающие случай, когда из трех (BCR-ABL1+, JAK2V611F+ и BCR-ABL1+/JAK2V6nFF) клонов наиболее чув­ствительным к терапии препаратами ИТК оказался BCR-ABL1+/JAK2V611F+ субклон. Вопрос о необходимости описания и классификации миелопролиферативных новообразований с более чем одной генетической ано­малией уже поднимался в литературе [16]. Мы уверены, что дальнейшее накопление сведений о патогенети­ческих механизмах сочетаний разных нозологий МПН необходимо для выработки адекватных клинических диагнозов и разработки эффективных методов комби­нированной таргетной терапии с включением препара­тов, направленных на сопутствующие драйверные му­тации.