Инвазивный кандидоз у больных опухолями си­стемы крови характеризуется тяжелым течением, длительным пребыванием в стационаре, высокой ле­тальностью, достигающей 40—50 %, и немалыми финан­совыми затратами на лечение [1][2]. В этиологической структуре сепсиса на долю Candida spp. приходится 2,8-7,4 % [3][4][5]. Негативное влияние на процесс лече­ния инвазивного кандидоза может оказывать способ­ность Candida spp. к формированию биопленок на сосу­дистых катетерах и других инвазивных медицинских устройствах, причем в последние годы частота детек­ции их в составе биопленок увеличилась. В исследова­нии Ж. Tumbarello и соавт. [6], включавшем 294 боль­ных кандидемией в многопрофильном стационаре, было выявлено увеличение доли Candida spp. в соста­ве биопленок с 36 до 67 % в период с 2000 по 2004 гг. В последующих работах этой группы исследователей (2005—2007 гг.) было доказано, что летальность при ин­фекциях, вызванных Candida spp. в составе биопленок, была статистически значимо выше в сравнении с воз­будителями, не способными формировать биопленку, и составила 51,2 % против 31,7 % (р = 0,004) [2]. Не все противогрибковые препараты проявляют активность в отношении биопленок Candida spp. В исследовании C. Tascini и соавт. [7] была отмечена крайне высокая частота летальных исходов, которая достигала 77%, при кандидемии, вызванной продуцентами биопле­нок, если для лечения были использованы противо­грибковые препараты группы азолов.

Количество публикаций, в которых были освещены результаты изучения способности формирования био­пленок среди возбудителей инвазивного кандидоза, невелико, и в них, как правило, представлены неодно­родные данные по продукции биопленок среди разных видов Candida. Эти исследования важны для выбора тактики ведения больных с инвазивным кандидозом. До недавнего времени полагали, что инвазивный кандидоз, а следовательно, и факт продукции биопленок среди Candida spp., наблюдается в основном у больных опухолями системы крови.

Целью исследования было оценить способность к образованию биопленок среди разных видов Candida, выделенных из клинически значимых образцов от больных опухолями системы крови и без опухолей системы крови с симптомами инвазивного кандидоза.

Источники и видовая идентификация изолятов. В проспективное многоцентровое исследование с 2005 по 2017 г. было включено 428 последовательно выделенных неповторяющихся изолятов Candida spp. из стерильных в норме образцов от больных опухолями системы крови (n = 172) и больных без опухолей систе­мы крови (n = 256) с инвазивным кандидозом из 11 ме­дицинских учреждений 10 городов России. Выделение и первичная идентификация грибов проводились в локальных микробиологических лабораториях уч­реждений, участвовавших в исследовании. Изоляты Candida spp. с заполненными индивидуальными реги­страционными картами передавали в транспортных средах в лабораторию клинической бактериологии, микологии и антибиотической терапии ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России. Окончательная ви­довая идентификация всех Candida spp. была прове­дена методом матрично-активированной лазерной десорбционной ионизационной времяпролетной массспектрометрии (MALDI-TOF MS) с использованием системы Microflex LT и программного обеспечения MALDI Biotyper Real Time Classification, версия 3.1 (Bruker Daltonics, Германия). В качестве критерия надежной видовой идентификации микроорганизмов использовали рекомендуемые значения коэффициента соответствия (Score) от 2,0 и выше. До проведения ис­следования изоляты хранили в холодильнике при тем­пературе —70 °С в триптиказо-соевом бульоне с добав­лением 20 % глицерина.

Определение способности к формированию биопленок. Определение способности Candida spp. продуцировать биопленки проводили спектрофотометрическим ме­тодом с использованием соли тетразолия — 2,3-бис- (2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-[(фениламино) карбонил]-2 Н-тетразолия (XTT, Sigma-Aldrich, США) согласно схеме, предложенной Pierce С. G. и модифи­цированной Tumbarello M. [2][8]. Вначале для прове­дения исследования готовили рабочие растворы. Соль тетразолия в количестве 0,25 г растворяли в 250 мл 0,01-М фосфатного буфера (Sigma-Aldrich, США), пропускали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм (Corning, США), разливали в стерильные сухие про­бирки по 10 мл. Порошок менадиона (Sigma-Aldrich, США) растворяли в ацетоне (ЭКОС-1, Россия) до кон­центрации 1 мкМ и распределяли в стерильные сухие пробирки по 50 мкл. Приготовленные растворы в про­бирках хранили при —70 °С в холодильнике.

При каждой детекции продукции биопленок ис­пользовали референтные штаммы C. parapsilosis ATCC 22019 в качестве положительного контроля, в качестве отрицательного контроля — штамм C. albicans без про­дукции биопленок, имеющийся в лаборатории клини­ческой бактериологии, микологии и антибиотической терапии ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России.

Для исследования культуру Candida spp. наноси­ли на твердую питательную среду Yeast Peptone Dextrose Agar (YPD Agar, Sigma-Aldrich, США) и инкубировали в термостате при 37 °C в течение 18—24 ч. Параллельно готовили бульон YPD (Sigma- Aldrich, США). Для этого 12,5 г среды YPD растворяли в 250 мл дистиллированной воды, автоклавировали 15 мин при 121 °С и после охлаждения до комнатной температуры разливали по 20 мл в колбы Эрленмейера объемом 150 мл (Duran, Германия). Затем суточную культуру Candida spp. вносили микробиологической петлей в колбы Эрленмейера, помещали их в шейкер- инкубатор (BioSan, Латвия) и инкубировали при 30 °С и 160 об./мин в течение 12—16 ч. После инкубации всю взвесь Candida spp. (20 мл) переносили в стерильные сухие пробирки, центрифугировали при 3000 g в те­чение 5 мин, трижды отмывали холодным стерильным 0,1-М фосфатным буфером, удаляли надосадочную жидкость, добавляли к осадку дрожжевых грибов бульон Сабуро (Oxoid, Англия), содержащий 8 % глю­козы (Merck, Германия), и доводили дрожжевые клет­ки до количества 3×10 7 КОЕ/мл, постоянно осуществ­ляя подсчет в камере Горяева. Далее по 100 мкл взвеси дрожжевых клеток последовательно переносили в ячейки от 1-го до 9-го рядов стерильного 96-луночного плоскодонного планшета в двух повторностях. Положительный и отрицательный контроли в объеме 100 мкл в двух повторностях добавляли в ячейки 10-го и 11-го рядов соответственно 96-луночного планшета. В ячейки 12-го ряда 96-луночного планшета суспензию не вносили и использовали как контроль фона. После инкубации 96-луночного планшета при 37 °С в тече­ние 24 ч аккуратно пипеткой удаляли надосадочную жидкость из ячеек и трижды отмывали стерильным 0,15-М фосфатным буфером. Затем к 10 мл рабочего раствора соли тетразолия добавляли 1 мкл рабочего раствора менадиона, переносили полученную смесь по 100 мкл во все ячейки 96-луночного планшета, включая контрольные, и инкубировали при 37 °С в те­чении 5 ч в темноте.

Учет результатов выполняли спектрофотометри­чески с помощью микропланшетного ридера IMark (Bio-Rad, США) при длине волны 490 нм. Изоляты Candida spp., имевшие оптическую плотность (ОП) от 0,1 и более, оценивали как формирующие биоплен­ки; менее 0,1 — не способные к формированию био­пленок.

Статистический анализ. Для анализа резуль­татов исследования была создана база данных. Статистическую обработку результатов проводили в программе IBM SPSS Statistics, версия 21. Различия между характеристиками оценивали с помощью точ­ного критерия Фишера и считали статистически зна­чимыми при степени вероятности безошибочного про­гноза 95 % (р < 0,05).

Способность к формированию биопленок была исследована у 428 Candida spp., включая C. albicans (n = 192), C. parapsilosis complex (n = 121), C. krusei (n = 40), C. tropicalis (n = 38) и C. glabrata (n = 37). Изоляты были выделены от больных опухолями системы кро­ви (n = 172) и больных без опухолей системы крови (n = 256). Большинство больных без опухолей системы крови и инвазивным кандидозом (85 %) находились на лечении в отделениях реанимации и интенсив­ной терапии. Из гемокультуры было получено 86,3 % (n = 361) Candida spp., из других клинически значимых образцов — 15,7 % (n = 67), среди которых преоблада­ли асцитическая жидкость (n = 36; 8,4 %), далее следо­вали биоптаты органов и тканей (n = 14; 3,3 %), спин­номозговая жидкость (n = 9; 2,1 %), желчь (n = 5; 1,2 %) и суставная жидкость (n = 3; 0,7 %).

Значения ОП варьировали среди изолятов (рис. 1). Наиболее высокие значения медианы ОП были обна­ружены у С. krusei (0,771), далее следовали C. tropicalis (0,206), C. parapsilosis complex (0,075), C. albicans (0,065) и C. glabrata (0,057). Значения ОП от 0,5 и более чаще определялись у С. krusei (40 %) в сравнении с C. glabrata (5,4 %), C. tropicalis (5 %), C. parapsilosis complex (1,7 %) и полностью отсутствовали у C. albicans (р < 0,05). Основная доля изолятов имела значения ОП в диапазоне от 0,1 до 0,499, и этот показатель чаще выявляли у C. tropicalis (84,2 %) в сравнении с C. parapsilosis complex (39,7 %), С. krusei (35 %), C. albicans (23,4 %) и C. glabrata (l8,9 %, р < 0,05).

Продукция биопленок была выявлена у 179 (41,8 %) из 428 Candida spp. с одинаковой частотой среди изо- лятов, выделенных от больных опухолями системы крови (41,9 %, 72 из 172) и больных без опухолей си­стемы крови (41,8 %, 107 из 256). Способность к фор­мированию биопленок была несколько выше среди Candida spp., выделенных из гемокультуры (42,9 %, 155 из 361), в сравнении с изолятами из других клини­чески значимых образцов (35,8 %, 24 из 67), но отли­чия были недостоверными (р > 0,05).

На рисунке 2 представлена частота образования биопленок среди C. albicans и Candida non-albicans, вы­деленных от больных исследуемых групп и из раз­ных клинически значимых образцов. При анализе Candida spp., полученных от всех больных, чаще био­пленки продуцировали Candida non-albicans в сравне­нии с C. albicans (52,5 % против 28,6 % соответственно, р < 0,001) в основном за счет Candida non-albicans, вы­деленных из гемокультуры (52,8 % против 28,3 % со­ответственно, р < 0,001), рисунок 2 А. Более выражен­ные отличия в способности образования биопленок среди Candida non-albicans и C. albicans были выявлены при выделении их от больных опухолями системы крови и составили 56,6 % против 18,2 %, а при иссле­довании изолятов из гемокультуры — 55,3 % про­тив 17,2 %, р < 0,001 соответственно (рисунок 2 Б). Среди изолятов, выделенных из других клинически значимых образцов, отличий не было получено, ве­роятно, по причине небольшого числа исследуемых Candida spp. В группе больных без опухолей системы крови различия в частоте образования биопленок между Candida non-albicans и C. albicans были определе­ны лишь среди изолятов, полученных из гемокульту­ры, и эти отличия были не столь выражены как в груп­пе сравнения (50,4 % против 35,6 % соответственно, р = 0,04), рисунок 2 В.

Во все анализируемые временные периоды образова­ние биопленок преобладало у Candida non-albicans в срав­нении с C. albicans (рис. 3). Значимое увеличение про­дукции биопленок с 45 до 60 % среди Candida non-albicans было отмечено в период с 2005 по 2017 г. (р = 0,001). Доля C. albicans в составе биопленок за этот период также возросла, но в меньше степени: с 19 % (2005—2007 гг.) до 29 % (2016-2017 гг., р > 0,05). В 2010-2011 гг. часто­та образования биопленок среди Candida non-albicans и C. albicans также была высокой, как в последний пери­од исследования (2016-2017 гг.), и составила 60 и 37 % соответственно. При анализе видового распределения Candida spp. и частоты детекции продукции биопленок в исследуемые временные промежутки не было вы­явлено отличий. Возможно, регистрируемый всплеск продукции биопленок в 2010-2011 гг. был обусловлен использованием у больных в эти годы инвазивных устройств, к которым Candida spp. проявляют большую тропность, или более тяжелой когортой больных с ин­вазивным кандидозом.

Исследуемые виды Candida имели разную способность к формированию биопленок (рис. 4). Образование био­пленок определялось значимо чаще среди C. tropicalis (89,5 %, 34 из 38) и C. krusei (75 %, 30 из 40) в сравне­нии с C. parapsilosis complex (41,3 %, 50 из 121), C. albicans (28,6 %, 55 из 192) и C. glabrata (27 %, 10 из 37), р < 0,05. Продукция биопленок была минимальной у C. albicans (28,6 %) и C. glabrata (27 %).

Продукция биопленок была сопоставимо высокой в анализируемых группах для C. tropicalis и C. krusei, ниже для C. parapsilosis complex и C. glabrata (рис. 5). Отличия в группах больных с инвазивным кандидозом по способности формирования биопленок были выяв­лены для C. albicans. Образование биопленок достовер­но чаще было определено для C. albicans, выделенных от больных без опухолей системы крови и составило 34 % против 18,2 % в группе сравнения (р = 0,03).

Для возбудителей инвазивного кандидоза харак­терным является наличие факторов патогенности. Наиболее значимыми из них являются адгезины, бла­годаря которым происходит прикрепление Candida spp. к инвазивным устройствам и клеткам макроорганиз­ма, наличие ферментов агрессии, таких как протеазы, липазы, присутствие морфологической гетерогенно­сти, которая выражается в формировании дрожжевых клеток и псевдомицелия, а также способность к обра­зованию биопленок на поверхностях инородных устройств и слизистых оболочек.

В настоящей работе частота детекции биопленок сре­ди изолятов Candida spp., выделенных из клинически значимых образцов, составила 41,8 %. По результатам разных исследователей этот показатель был вариа­бельным. В исследовании ученых из Швеции продук­ция биопленок среди Candida spp., выделенных из ге­мокультуры, была определена у 58,8 % (231 из 393) изолятов; в исследовании из Турции — только у 20,2 % (20 из 99) [9][10].

Одинаковая частота выделения Candida spp. в составе биопленок была получена от больных опухолями си­стемы крови и больных без опухолей системы крови и составила 41,9 и 41,8 % соответственно. Основная доля больных без опухолей системы крови (85 %) нахо­дилась в отделениях реанимации и интенсивной тера­пии. Сопоставимо высокая частота образования био­пленок среди Candida spp. может быть связана с частым использованием инвазивных медицинских устройств в обеих группах больных. Полученные в настоящем исследовании данные подтверждены результатами других исследователей, в которых доля Candida spp. в составе биопленок, выделенных от больных опухо­лями системы крови, составила 46 % (n = 43), этот по­казатель был несколько выше от больных из отделений реанимации и достигал 58 % [11][12].

Продукция биопленок среди Candida spp., выделен­ных из гемокультуры, была выше и составила 42,9 % против 35,8 % среди изолятов, полученных из дру­гих клинически значимых образцов, но отличия были недостоверными (p > 0,05). Опубликованные результаты исследований по изучению способности к формированию биопленок среди Candida spp., как вы­зывающих инвазивный кандидоз, так и колонизирую­щих слизистые оболочки макроорганизма, оказались неоднородными. Продукция биопленок была изуче­на среди Candida spp., выделенных из гемокультуры (n = 101), мочи (n = 97), респираторного тракта (n = 89), ран (n = 41), асцитической жидкости (n = 12) и других образцов (n = 20) [13]. Было показано, что Candida spp., выделенные из гемокультуры, чаще образовывали биопленки в сравнении с изолятами из других образ­цов (57 % против 32 % соответственно, p < 0,0001). Другими исследователями была отмечена высокая частота формирования биопленок среди Candida spp., выделенных из гемокультуры (83,3 %) и со слизистой оболочки ротоглотки (81,8 %) [14].

Изоляты Candida non-albicans статистически значимо чаще образовывали биопленки в сравнении с C. albicans (52,5 % против 28,6 %, р < 0,001). Согласно данным других авторов, частота формирования биопленок среди Candida non-albicans, выделенных из гемокуль­туры, была также выше и варьировала от 54 до 77 %, в то время как этот показатель среди C. albicans состав­лял от 26,7 до 30,6 % (p < 0,05) [6][11][15].

Основными продуцентами биопленок были изоляты C. tropicalis (89,5 %) и C. krusei (75 %), реже — C. albicans (28,6 %) и C. glabrata (27 %). Сопоставимые результаты были получены в других работах, согласно которым частота детекции биопленок среди C. tropicalis и C. krusei также была высокой, и в некоторых исследованиях этот показатель достигал 100 % [9][16]. Вариабельные данные о способности к формированию биопленок были выявлены среди С. glabrata и C. albicans и варьиро­вали у каждого из этих видов от 8 до 95 % [9][13].

Учитывая неоднородные данные о продукции био­пленок среди разных видов Candida, можно полагать, что на этот процесс оказывают влияние не только на­личие инвазивного устройства в макроорганизме, но и другие факторы, например материал, из которого они изготовлены, и длительность их использования [17]. В экспериментальных исследованиях было доказано, что образование биопленок среди C. albicans чаще было на латексе и реже — на полиуретане и силиконе [18][19]. В другой работе было показано, что C. parapsilosis, C. albicans и C. krusei обладали большей способностью к формированию биопленок на тефлоне, в то время как C. glabrata — на поливинилхлориде, а C. tropicalis — на полиуретане [20]. Авторы полагают, что на частоту образования биопленок среди Candida spp. может влиять и структура поверхности инвазивного устройства [18].

Различия в способности к формированию биопленок среди разных видов Candida могут быть обусловлены неоднородностью используемых методик ввиду при­сутствия отличий в используемой питательной сре­де для инкубации, а также в качестве применяемых планшет [17][20][21][22].

Таким образом, формирование биопленок было выяв­лено у 41,8 % возбудителей инвазивного кандидоза с оди­наковой частотой у больных опухолями и без опухолей системы крови. Образование биопленок значимо чаще преобладало среди C. tropicalis (89,5 %) и C. krusei (75 %) в сравнении с C. parapsilosis complex (41,3 %), C. albicans (28,6 %) и C. glabrata (27 %, р < 0,05). Отличия в группах больных с инвазивным кандидозом по способности фор­мирования биопленок были выявлены для C. albicans. Образование биопленок достоверно чаще было опреде­лено для C. albicans, выделенных от больных без опухолей системы крови, и составило 34 % против 18,2 % в группе сравнения (р = 0,03). Полученные результаты подтвер­ждают необходимость удаления центрального венозного катетера у больных инвазивным кандидозом, особенно при повторном выделении Candida spp. из гемокультуры.