Апластическая анемия (АА) — это редко встречающееся заболевание системы крови, характеризующееся тяжелой костномозговой недостаточностью с истощением пула гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Исследования, посвященные изучению АА, свидетельствуют об аутоиммунном механизме развития заболевания [1][2][3]. Главную роль в развитии аутоиммунных реакций при АА играют активированные цитотоксические T-клетки, распознающие аутоантигены, представленные на гемопоэтических стволовых клетках с помощью молекул HLA (Human Leukocyte Antigens) класса I [4][5]. Результаты исследований указывают на наличие антигенного стимула, который приводит к патологической активации и дисрегуляции CD4+ Т-клеток в костном мозге (КМ) и повышенной секреции провоспалительных цитокинов, основными из которых являются интерферон-γ (ИФН-γ) и фактор некроза опухоли-α [3][6][7]. Пусковой фактор активации иммунной системы неизвестен. Поэтому более детальное понимание иммунных механизмов развития болезни необходимо при разработке долгосрочного эффективного лечения.

ИФН-γ регулирует взаимодействие клеток, участвующих в иммунном ответе. Являясь продуктом Т-хелперов 1-го типа, он вместе с другими провоспалительными цитокинами активирует цитотоксические Т-лимфоциты (CD8+) и усиливает фагоцитарные и цитотоксические реакции в очаге воспаления, которым в данном случае является КМ [8]. В КМ больных AA выявляется выраженная качественная и количественная недостаточность регуляторных T-клеток (T-рег), которые в нормальных условиях подавляют аутореактивность других популяций T-клеток, в частности в отношении к ГСК [9][10]. Особую роль в иммунном ответе при АА играют T-хелперы, которые при активации начинают секретировать интерлейкин-2, что обеспечивает пролиферацию цитотоксических Т-лимфоцитов, которые, в свою очередь, являются источником продукции провоспалительных цитокинов [11].

Иммунный ответ и регуляцию активности Т-клеточного звена контролируют костимуляторные молекулы, которые в условиях активации Т-клеток способствуют ингибированию пролиферации, эффекторной функции (секреция цитокинов) и индукции апоптоза Т-клеток [12]. В нормальных условиях этот механизм ингибирования предотвращает чрезмерную активацию популяций Т-клеток, например нежелательные аутоиммунные реакции, поддерживая периферическую иммунную толерантность. Одной из таких костимуляторных молекул является PD-1 (Programmed cell death-1) — костимуляторный рецептор семейства CD28, который, взаимодействуя со своим лигандом PD-L1/PD-L2, ингибирует сигнальный путь, вовлеченный в активацию Т-клеток и тем самым способствует подавлению активности Т-клеток и индукции апоптоза [13]. Блокировка либо PD-1, либо его лигандов способствует развитию системных и органоспецифических аутоиммунных заболеваний, что подтверждено в экспериментах на животных [14]. Результаты немногочисленных исследований показали повышенную экспрессию PD-1-рецептора на поверхности Т-клеток больных АА, что, вероятно, связано с аберрантной регуляцией активации Т-клеток при данном заболевании [15][16]. Однако связь между высокой экспрессией PD-1 и AA не изучена.

Имеются данные о том, что у больных АА в КМ происходит пролиферация аутореактивных клонов цитотоксических Т-лимфоцитов. Этот процесс называют также олигоклональным обогащением (расширением) или экспансией Т-клеток [5][10].

Аутоантиген потенциально может быть распознан Т-клеткой с определенным вариантом Т-клеточного рецептора (ТКР). Взаимодействие ТКР с антигеном ведет к активации Т-лимфоцита и является ключевым событием в запуске иммунного ответа [17]. ТКР состоит из двух субъединиц — α и β либо γ и δ. В каждой субъединице расположены два домена — константный (С), который закрепляет рецептор в плазматической мембране Т-лимфоцита, и вариабельный (V), который непосредственно отвечает за распознавание антигена. Узнавание Т-клеточным рецептором обширного спектра разнообразных антигенов достигается путем перегруппировки и рекомбинации V(D)J (V — variable, D — diversity и J — joining) участков генов вариабельных частей α- и β-цепей ТКР. Наибольшая изменчивость ТКР сосредоточена в участке CDR3 (complementarity determining region, CDR), который и определяет связывание рецептора с антигеном [18]. Именно этот участок представляет основной интерес при исследовании репертуара ТКР. Анализ перестройки ТКР обычно используется в диагностике лимфоидных злокачественных новообразований и может быть важным инструментом в изучении Т-клеточных реакций на патогены, и в том числе при аутоиммунных заболеваниях [19][20].

При АА происходит нарушение иммунной регуляции и срыв толерантности к собственным антигенам, что приводит к пролиферации аутореактивных клонов Т-клеток [21][22][23]. Учитывая разнообразие спектра распознавания ТКР, идентификация иммунодоминантных клонов остается сложной задачей. Изучение Т-клеток и их клонального состава представляется актуальным в исследовании иммуноопосредованных гематологических заболеваний, так как может помочь в отслеживании активности заболевания, прогнозировании ответа на иммуносупрессивную терапию (ИСТ) и рецидива.

Известно несколько методических подходов к изучению клонального состава Т-клеток: определение клональности по реаранжировкам генов ТКР с помощью фрагментного анализа, секвенирование нового поколения или количественное определение Т-клеток с конкретным типом вариабельного домена β-цепи ТКР (репертуар ТКР-Vβ) методом проточной цитофлуориметрии. Существует 65 Vβ-сегментов в β-локусе ТКР, которые можно сгруппировать в 25 семейств (22 функциональных семейства), причем каждый член данного семейства имеет более 75 % гомологии на уровне нуклео­тидов по меньшей мере с одним из других членов того же семейства [24]. Созданы моноклональные антитела, специфично связывающиеся с ТКР, принадлежащим к определенному Vβ-семейству. Частота встречаемости различных ТКР-Vβ-семейств отличается между собой, изучена и известна у здоровых людей в периферической крови. Увеличение доли какого-либо из Vβ-семейств выше верхней границы нормы может свидетельствовать о наличии Т-клеточного клона в пределах данного семейства [25]. Многоцветная проточная цитометрия позволяет также изучать функциональные подгруппы Т-клеток и маркеры активации [26]. Данные подходы дают детальное представление о характере Т-клеточного ответа и могут быть использованы для изучения иммунного механизма развития АА.

Целью исследования было изучение субпопуляционного состава Т-клеток и репертуара Т-клеточного рецептора у больных АА.

В исследование были включены больные АА (n = 40), обследовавшиеся в ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России до начала ИСТ с 2018 по 2020 г. и подписавшие информированное согласие на включение в исследование. Соотношение мужчин и женщин составило 1 : 1,2, медиана возраста — 25 (17–60) лет. Диагноз АА устанавливался на основании следующих критериев: трехростковая цитопения, малоклеточный КМ, отсутствие мегакариоцитов по данным миелограммы, аплазия при гистологическом исследовании КМ, отсутствие цитогенетических аномалий. Больные были разделены на три группы в зависимости от степени тяжести: нетяжелая АА (НАА) (n = 23), тяжелая АА (ТАА) (n = 11) и сверхтяжелая АА (СТАА) (n = 6). Основным критерием тяжести АА являлось количество гранулоцитов в периферической крови в дебюте заболевания (нейтрофилы более 0,5 × 109/л — для НАА, 0,2–0,5 × 109/л — для ТАА и менее 0,2 × 109/л — для СТАА). Материал для исследования — первая порция аспирата КМ, полученная во время диагностических стернальных пункций. В качестве контрольной группы для определения субпопуляций T-клеток и экспансии клонов Vβ Т-клеток использовали КМ 23 здоровых доноров КМ, подписавших информированное согласие на включение в исследование. Медиана возраста доноров составила 31 (19–52) год.

Определение субпопуляционного состава T-лим­фо­цитов проводили с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Для этого была разработана панель моноклональных антител к антигенам дифференцировки человека, меченых различными флуорохромными красителями, представленная в таблице 1. Использование данной панели моноклональных антител позволяет определить относительное количество Т-клеточных субпопуляций, представленных в таблице 2.

Таблица 1. Моноклональные антитела к антигенам дифференцировки человека, использованные в исследованииTable 1. Monoclonal antibodies to human differentiation antigens used in the study

№Антигенная специфичностьAntigenic specificityФлуорохромFluorochromeКлонClone1CD3FITC — флуоресцеин изотиоцианатfluorescein isothiocyanateSK72CD4APC-Cy7 — аллофикоцианин-цианин 7allophycocyanin-cyanine 7SK33CD8PerCP-Cy5.5 —перидинин-хлорофил протеин-цианин 5.5peridinin-chlorophyll protein-cyanine 5.5SK14CD127PE — фикоэритринphycoerythrinA019D55CD56PE — фикоэритринphycoerythrinMY316CD25FITC — флуоресцеин изотиоцианатfluorescein isothiocyanate2A37CD95PE-Cy7 — фикоэритрин-цианин 7phycoerythrin-cyanine 7DX28CD274 (PD-L1)PE-Cy7 — фикоэритрин-цианин 7phycoerythrin-cyanine 7MIH19CD28APC — аллофикоцианинallophycocyaninCD28.210CD279 (PD-1)APC — аллофикоцианинallophycocyaninMIH4

Таблица 2. Основные Т-клеточные субпопуляции и фенотип клеток, определяемые в исследованииTable 2. Main T-cell subpopulations and phenotypes defined in the study

Т-клеткиT-cellsФенотип клетокCell phenotypeПопуляция Т-клеток, относительно которой определяли долюReference T-cellsДвойные негативные Т-клеткиDouble-negative T-cellsCD3+CD4-CD8-CD3+ клеткиCD3+ cellsДвойные позитивные Т-клеткиDouble-positive T-cellsCD3+CD4+CD8+CD3+ клеткиCD3+ cellsТ-хелперыT-helper cellsCD3+CD4+CD3+ клеткиCD3+ cellsЦитотоксические Т-клеткиCytotoxic T-cellsCD3+CD8+CD3+ клеткиCD3+ cellsTNK-клеткиTNK cellsCD3+CD56+CD3+ клеткиCD3+ cellsВ популяциях CD4+ и CD8+ клетокCD4+ and CD8+ populationsЭффекторные Т-клеткиEffector T-cellsCD28-CD95+CD28-CD95+Активированные Т-клеткиActivated T-cellsCD25+CD25+Т-клетки «памяти»Memory T-cellsCD28+CD95+CD28+CD95+Регуляторные Т-клеткиRegulatory T-cellsCD25+CD127-–PD-1-позитивные клеткиPD-1 positive cellsCD279+CD279+PD-L1-позитивные клеткиPD-L1 positive cellsCD274+CD274+Наивные Т-клеткиNaive T-cellsCD28+CD95-CD28+CD95-

Для анализа ТКР-Vβ-репертуара Т-лимфоцитов КМ больных (n = 39) (данные одного пациента были удалены из исследования вследствие ошибки подготовки пробы) был использован коммерческий набор IOTest Beta Mark ТКР-Vβ Repertoire (Beckman Coulter, Майами, Флорида, США), позволяющий оценить следующие семейства ТКР-Vβ: Vβ 1, Vβ 2, Vβ 3, Vβ 4, Vβ 5.1, Vβ 5.2, Vβ 5.3 , Vβ 7.1, Vβ 7.2, Vβ 8, Vβ 9, Vβ 11, Vβ 12, Vβ 13.1, Vβ 13.2, Vβ 13.6, Vβ 14, Vβ 16, Vβ 17, Vβ 18, Vβ 20, Vβ 21.3, Vβ 22 и Vβ 23. Данный набор включает 8 смесей моноклональных антител — каждая содержит антитела против 3 различных областей TКР-Vβ-семейств, охватывающих 24 антигена TКР-Vβ, что соответствует приблизительно 70 % нормального репертуара TКР-Vβ человека [27].

Изучали репертуар ТКР-Vβ для Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток отдельно. Система IOTest Beta Mark была адаптирована для исследования образцов КМ здоровых доноров и больных АА. Поскольку в литературе указаны референсные значения для ТКР-Vβ только в периферической крови, необходимо было уточнить референсные границы для ТКР-Vβ в КМ. Обогащенным считали семейство Vβ, если оно выходило за верхнюю границу уточненного референсного интервала. Если все значения ТКР-Vβ находились в пределах референсных интервалов доноров, то такие значения считали поликлональными. Олигоклональный результат определяли при наличии преобладания одного и более обогащенных Vβ-семейств, без поликлонального фона.

Статистическая обработка. Статистическая обработка выполнена с помощью R 3.6.3, GraphPad PRISM 8.0. Границы референсных интервалов для каждого из 24 клонов были рассчитаны на основании анализа КМ доноров и включали значения от 2,5 до 97,5 процентиля после исключения выбросов. Если у больного доля клеток с определенным семейством Vβ превышала референсное значение, то делали вывод о том, что у больного выявляется клон c данным ТКР-Vβ-семейством. Для определения соответствия распределения нормальному использовали критерий Шапиро — Уилка. Для определения отличий в долях различных субпопуляций T-клеток у больных и доноров использовали T-критерий Стьюдента, если данные были распределены нормально, и критерий Манна — Уитни — в случае ненормальных распределений. Сравнение субпопуляций T-клеток у больных АА с различной степенью тяжести и доноров осуществлялось с помощью критерия Краскела — Уоллиса с поправкой на множественные сравнения Данна. Для всех использованных критериев значимым был выбран уровень p < 0,05. Данные в таблицах представлены в виде среднего ± стандартной ошибки среднего.

Субпопуляционный состав T-клеток костного мозга больных АА и доноров. При анализе субпопуляционного состава Т-клеток у больных АА выявлена достоверно (p < 0,05) большая доля CD4+ и CD8+ эффекторных клеток, СD4+ клеток «памяти», CD4+PD-1+ и CD8+PD-1+, а количество субпопуляций CD4+ и СD8+ наивных клеток, CD4+PD-L1+ было достоверно (p < 0,05) меньше по сравнению с аналогичными субпопуляциями доноров (рис. 1). Субпопуляции CD4+, CD8+, CD3+CD4+CD8+ (двойные позитивные Т-клетки), CD3+CD4-CD8- (двойные негативные Т-клетки), CD8+ клеток «памяти», регуляторных Т-клеток, активированных CD4+ и CD8+, CD8+PD-L1+ клеток больных достоверно не отличались от аналогичных субпопуляций доноров (табл. 3).

Настоящее исследование посвящено изучению субпопуляционного состава Т-клеток и исследованию репертуара Т-клеточного рецептора у больных АА с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Количества CD4+ и CD8+ Т-клеток достоверно не отличались у больных и доноров. При детальном исследовании субпопуляционного состава Т-клеток выявлено, что у больных АА наблюдался сдвиг в сторону терминальных эффекторных клеток. Субпопуляции Т-клеток памяти, обладающие эффекторной способностью, наряду с цитотоксическими клетками, могут быть источником продукции ИФН-γ при AA, который является негативным регулятором гемопоэза. Меньшая доля «наивных» СD4+ и CD8+ Т-клеток может свидетельствовать об истощении этих субпопуляций вследствие длительной антигенной стимуляции. Кроме того, у больных АА выявлена большая доля PD-1+ Т-клеток, а, как известно, PD-1-путь вовлечен в процесс активации Т-лимфоцитов, которые оказывают регуляторное воздействие на все этапы кроветворения [28].

Наиболее значительные различия были получены при анализе результатов в зависимости от степени тяжести АА. У больных ТАА и НАА все исследуемые субпопуляции Т-лимфоцитов были сопоставимы. У больных СТАА изменения субпопуляционного состава были наиболее выраженными. У этих больных была выявлена наименьшая доля двойных негативных Т-клеток (СD3+CD4-СD8-). Известно, что двойные негативные Т-клетки могут выступать в роли регуляторных клеток, предотвращая развитие аутоиммунных заболеваний [29]. Кроме того, у больных СТАА определялась наименьшая доля регуляторных Т-клеток, хотя эти отличия были недостоверными, что может быть связано с недостаточным числом больных. Считают, что T-рег играют ключевую роль в механизмах иммунной толерантности [30]. Основными функциями T-рег является их выраженная способность подавлять активацию Т-эффекторов или клеток «памяти», а также регулировать аутореактивность Т-клеток [31]. Уменьшенное количество T-рег не в состоянии подавить функцию активированных T-клеток, которые повреждают кроветворные клетки в КМ. Также можно предположить, что даже при «нормальном» количестве T-рег их функциональные свойства могут быть нарушены у больных АА. В работе S. Kordasti и соавт. [7] показано, что T-рег, выделенные у больных АА, крайне слабо подавляют секрецию ИФН-γ и фактора некроза опухоли-β, что является их функциональным дефектом.

Также обнаружено, что наибольшая доля PD-1-позитивных Т-клеток выявлялась у больных СТАА. В норме связывание PD-1 его лигандами PD-L1 и PD-L2 подавляет пролиферацию Т-клеток и продукцию цитокинов [14]. Аберрантная высокая экспрессия костимуляторных молекул, включая PD-1, возможно связана с постоянной активацией аутореактивных Т-клеток при АА. Повышенная экспрессия PD-1 на Т-клетках, обнаруженная в настоящем исследовании, по-видимому, не способствует подавлению функции Т-клеток. Однако механизм, лежащий в основе дисфункции PD-1, остается до сих пор неясным. Доля PD-1-позитивных Т-клеток может ассоциироваться со степенью тяжести АА. Таким образом, у больных СТАА определялся дефицит общего числа Т-хелперов и преобладание цитотоксических Т-клеток, значительное уменьшение количества регуляторных клеток, что согласуется с ранее опубликованными исследованиями [32][33][34].

Олигоклональная экспансия Т-клеток является ключевым событием в патогенезе АА. В многочисленных исследованиях показано обогащение Vβ-семейств в популяциях CD4+ и CD8+ Т-клеток. При этом изменения клонов Vβ в популяции Т-хелперов были значительно меньше, чем в популяции цитотоксических клеток [35][36][37]. Аналогичный результат получен в настоящем исследовании. При анализе репертуара ТКР-Vβ методом проточной цитофлуориметрии было обнаружено, что характер распределения семейств Vβ в T-хелперах поликлонален (рис. 2А). Несмотря на поликлональную картину, у 92,3 % больных АА среди CD4+ клеток выявлялось, как минимум, одно семейство Vβ, размер которого не превышал референсный интервал более чем на 10 % (рис. 2В), что не является значительным отклонением от референсных значений доноров.

В отличие от Т-хелперов в популяции цитотоксических Т-клеток размер выявляемых клонов ТКР-Vβ был более выраженным с максимальным значением обогащенного семейства у одного больного до 35 % (рис. 2Б). У 2 больных (5 %) не было выявлено увеличения Vβ-семейств в популяции цитотоксических клеток. Количество клонов у каждого больного варьировало от 1 до 6, но с большей частотой определялось 1, 2 или 3 клона. Наиболее часто встречалось обогащение семейств Vβ 11, Vβ 17, Vβ 20, причем количество Vβ 17 было увеличено как среди Т-хелперов, так и среди цитотоксических клеток.

Определение репертуара ТКР-Vβ с помощью метода проточной цитофлуориметрии доступнее, быстрее и имеет меньшую стоимость по сравнению с секвенированием нового поколения и может быть выполнено с использованием коммерческого набора. Однако, используя данную методику, можно выявить только расширение определенного Vβ-семейства, что не эквивалентно понятию «клон», принятому в молекулярной биологии. Выявленные с помощью проточной цитофлуориметрии обогащенные Vβ-семейства у больных с АА могут быть использованы для оценки ответа на ИСТ и активности заболевания.

Таким образом, в настоящем исследовании проведен анализ значительного количества характеристик Т-лимфоцитов у большой группы больных АА. Были выявлены наиболее характерные особенности Т-клеточных субпопуляций у всех больных АА: увеличение количества цитотоксических Т-клеток, эффекторных CD4+ и CD8+ клеток, CD4+ клеток «памяти», что может подтверждать наличие длительной антигенной стимуляции с последующей активацией этих субпопуляций клеток, в результате которой происходит гиперэкспрессия провоспалительных цитокинов. Уменьшение «наивных» CD4+ и CD8+ клеток, регуляторных Т-клеток, двойных негативных Т-клеток (СD3+CD4-СD8-) доказывает снижение контроля за цитокинпродуцирующими Т-клетками.

Была установлена связь между степенью тяжести АА и количеством эффекторных Т-клеток, Т-регуляторных клеток, двойных негативных Т-клеток и PD-1-позитивных Т-клеток: самое большое количество потенциально цитокинпродуцирующих Т-клеток и минимальное количество клеток, участвующих в регуляции Т-клеточной активности, было выявлено у больных СТАА.

Сравнительный анализ проведен с использованием образцов КМ. В большинстве исследований анализ клеточных популяций у больных АА проводится на образцах периферической крови, однако в данной работе исследование КМ позволило получить более детальную информацию об изменениях Т-клеточных субпопуляций [7][38][39]. При анализе репертуара ТКР-Vβ была обнаружена олигоклональная экспансия преимущественно в субпопуляции цитотоксических Т-клеток. Можно предположить, что обогащение семейств Vβ свидетельствует о наличии аутореактивного Т-клеточного клона и подтверждает иммунный патогенез АА.

Требуется дальнейшее изучение многочисленных клеточных субпопуляций, участвующих в аномальном иммунном ответе при АА, так как ни аутоантигены, ни причины развития аутореактивности при АА не установлены. Подробное исследование субпопуляционного состава Т-клеток при этом заболевании необходимо для лучшего понимания патофизиологии АА, а также для поиска оптимальных программ лечения. Динамическое исследование ТКР-Vβ-репертуара может быть предложено в качестве мониторинга течения заболевания, учитывая, что доминантные клоны, выявляемые в дебюте болезни, могут вновь определяться перед рецидивом, являясь предвестником возврата болезни [23, 35]. Метод проточной цитофлуориметрии помогает выявлять значимые биомаркеры для мониторинга клонов Т-клеток при АА с целью наиболее точной оценки активности патологического процесса при АА, но для этого необходимы большая когорта больных и исследования на разных этапах терапии АА.