В последние годы в клинической практике у больных острыми миелоидными лейкозами (ОМЛ) выполняются молекулярно-генетические исследования. В определении групп риска у больных ОМЛ основополагающими методами являются стандартное цитогенетическое исследование и метод флуоресцентной гибридизации in situ (Fluorescence In Situ Hybridization, FISH). Изучено влияние на прогноз заболевания таких устойчивых хромосомных аномалий, как t(15;17)(q22;q12); PML-RARA, t(8;21)(q22;q22)/RUNX1-RUNX1T1 и inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22)/CBFB-MYH11, выделенных в группу благоприятного прогноза, а также -5/(del)5q, -7, -17/abn(17p), inv(3)(q21.3q26.2)/t(3;3)(q21.3;q26.2) и комплексного кариотипа, являющихся, напротив, факторами неблагоприятного прогноза [1][2][3][4]. Однако у 50 % больных при цитогенетическом исследовании определяется нормальный кариотип, и в этом случае они стратифицируются в группу промежуточного риска [1]. Отсутствие у таких больных каких-либо цитогенетических аномалий затрудняет прогнозирование течения заболевания и не позволяет выбрать оптимальную тактику лечения. С появлением новых методов молекулярно-генетического анализа стало возможным рассматривать ОМЛ не только как цитогенетически гетерогенную группу заболеваний, но и как сложную, динамическую систему, характеризующуюся множественными соматическими драйверными мутациями и постоянной эволюцией сосуществующих опухолевых клонов [5]. За последние 20 лет было идентифицировано множество мутаций, ассоциированных с миелоидными новообразованиями, в частности с ОМЛ, и предпринято немало попыток создания классификации ОМЛ, учитывающей как биологическую природу опухоли, так и влияние выявляемых генетических поломок на дальнейший прогноз заболевания. В классификацию ВОЗ 2016 г. была добавлена категория «ОМЛ с генетическими мутациями» (AML with gene mutations), включающая такие варианты заболевания, как ОМЛ с мутацией NPM1, ОМЛ с биаллельной мутацией CEBPA и ОМЛ с мутацией RUNX1 (предварительная категория) [6]. Включение данных мутаций в классификацию ВОЗ обусловлено их частым выявлением у больных ОМЛ (20–45 % для NPM1, 5–10 % для CEBPA, 5–15 % для RUNX1), доказанной прогностической значимостью (мутации NPM1 и биаллельная мутация CEBPA являются факторами благоприятного прогноза, в то время как мутации RUNX1 — неблагоприятного), а также их специфической ролью в патогенезе опухоли [7][8][9][10][11][12][13][14][15][16]. Таким образом, классификация ВОЗ учитывает как биологические, так и клинические особенности ОМЛ с вышеуказанными мутациями.

В клинической практике наибольшим значением обладает молекулярно-генетическая стратификация ОМЛ по группам риска, предложенная в клинических рекомендациях European Leukemia Net (ELN) в 2017 г. В данной классификации учитываются мутации в генах NPM1, CEBPA (биаллельная мутация), а также в генах FLT3-ITD, RUNX1, ASXL1 и TP53 [5]. Мутации в генах RUNX1, ASXL1 и TP53, согласно данным многочисленных исследований, являются факторами неблагоприятного прогноза [17–25], мутации в генах NPM1 и CEBPA-biallelic ассоциированы с благоприятным прогнозом. Что касается мутаций в гене FLT3-ITD, значение имеет не только их наличие, но и уровень аллельного соотношения мутантного типа к «дикому» типу, а также отсутствие или наличие при этом мутации в гене NPM1. Мутации гена FLT3-ITD являются одними из наиболее часто выявляемых мутаций при ОМЛ, обнаруживаются у 25–30 % больных и ассоциированы с высоким риском развития рецидива [26][27][28][29][30][31][32]. Выявление мутаций FLT3-ITD в настоящее время является одним из важных прогностических маркеров при ОМЛ, так как позволяет не только прогнозировать течение заболевания, но и выбирать терапевтическую тактику с учетом появления нескольких таргетных препаратов.

Однако принятые классификации разработаны с учетом весьма ограниченного количества мутаций. Эти генетические аномалии являются наиболее изу­ченными при ОМЛ и обладают вполне однозначной прогностической значимостью. Тем не менее существуют исследования, свидетельствующие о важности и других мутаций. Поиск новых терапевтических возможностей и прогностических критериев делает актуальным в настоящее время применение полногеномного секвенирования у больных ОМЛ.

В программе TCGA (The Cancer Genome Atlas) исследовательской группой ОМЛ были проведены полногеномное (n = 50) и полноэкзомное (n = 150) cеквенирования 200 случаев de novo ОМЛ и выявлены мутации суммарно в 260 генах; из них 23 гена были мутированы повсеместно, и в 237 генах мутации выявлялись лишь в двух или более случаях. Обнаруженные мутации были разбиты на 9 функциональных классов: мутации в генах, кодирующих нуклеофосмин (NPM1), мутации в генах опухолевой супрессии (TP53), мутации в генах эпигенетической регуляции, или генах, связанных с метилированием ДНК (DNMT3A, TET2, IDH1, IDH2), в генах сигнальных путей (FLT3, SETBP1), в генах, кодирующих факторы транскрипции (RUNX1, CEBPA), в генах-модификаторах хроматина (ASXL1, BCOR), в генах-факторах сплайсинга (SRSF2, SF3B1, U2AF1, U2AF2) и в генах двух других классов (гены, кодирующие белки когезина, и химерные гены) [7]. Роль перечисленных мутаций в лейкемогенезе и их влияние на прогноз заболевания в настоящий момент изучаются. Несмотря на неоднозначность и противоречивость имеющихся данных, некоторые исследователи предлагают выделить дополнительные категории ОМЛ, помимо описанных в классификации ВОЗ 2016 г. E. Papaemmanuil и соавт. [33], проанализировав клинические, цитогенетические и молекулярно-генетические данные 1540 больных ОМЛ, разделили ОМЛ на 11 непересекающихся классов, каждый со своими клиническими характеристиками и прогнозом. Среди новых предложенных категорий — ОМЛ с мутациями в генах-модификаторах хроматина и генах-факторах сплайсинга, ОМЛ с мутациями гена TP53 и/или анеуплоидией, ОМЛ с мутациями гена IDH2 в кодоне R172. Таким образом, несмотря на прогресс в изучении молекулярной биологии ОМЛ, неясны все патогенетические механизмы и закономерности течения данного заболевания.

Цель настоящего исследования — оценить частоту мутаций различных генов и их влияние на прогноз заболевания у взрослых больных ОМЛ.

В биобанке лаборатории молекулярной гематологии ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России накоплен первичный материал (аспират костного мозга, взятый в дебюте заболевания) от взрослых больных с впервые установленным диагнозом ОМЛ, поступивших в Центр в период с 2012 г. по 2019 г. Для решения поставленной задачи были отобраны образцы ДНК от 100 больных, выделенные в период с 2016 г. по 2018 г. Впоследствии 10 больных были исключены из дальнейшего анализа в связи с недостаточным количеством материала для проведения исследования. Таким образом, в исследование были включены 90 больных ОМЛ.

Все больные были разделены на две возрастные группы: моложе 60 лет и от 60 лет и старше. Группу больных моложе 60 лет составили 76 человек (соотношение мужчин и женщин — 23 : 53), группу больных от 60 лет и старше — 14 человек (соотношение мужчин и женщин — 8 : 6). Медиана наблюдения составила 20,9 месяца (0,07–78,3 месяца).

Диагноз ОМЛ у всех больных был установлен на основании исследования общего анализа крови, а также цитологического, цитохимического, иммунофенотипического, цитогенетического и молекулярно-генетического исследований аспиратов костного мозга. Клинико-лабораторная характеристика больных ОМЛ в зависимости от возраста представлена в таблице 1.

Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика больных в зависимости от возрастаTable 1. Clinical and laboratory profile of age cohorts

Возраст, летAge, years< 60(n = 76)≥ 60(n = 14)ПолGender, n (%)• Мужчины / Male• Женщины / Female23 (30,3)53 (69,7)8 (57,1)6 (42,9)Группы риска по ELN 2017, n (%)ELN-2017 risk cohorts, n (%)  • Благоприятный• Favourable18 (23,7)1 (7,1)• Промежуточный• Intermediate37 (48,7)6 (42,9)• Неблагоприятный• Unfavourable21 (27,6)7 (50)Цитогенетические аберрации и данные молекулярного исследования, n (%)Cytogenetic aberrations and molecular evidence, n (%)   Группа благоприятного риска: Favourable risk cohort  • t(8;21)(q22;q22.1); RUNX1-RUNX1T16 (7,9)–• inv(16)(p13.1q22); CBFB-MYH113 (4)–• Нормальный кариотип + мутация в гене NPM1• Normal karyotype + NPM1 mutation9 (11,8)1 (7,1) Группа промежуточного риска: Intermediate risk cohort  • (9;11)(p21.3;q23.3); MLLT3-KMT2A1 (1,3)–• Неклассифицируемые численные аномалии• Unclassified numerical abnormalities6 (7,9)2 (14,3)• Неклассифицируемые структурные аномалии• Unclassified structural abnormalities2 (2,6)1 (7,1)• Нормальный кариотип + мутации в генах NMP1 и FLT3-ITD• Normal karyotype + NPM1 or FLT3-ITD mutations5 (6,6)1 (7,1)• Нормальный кариотип без мутаций NPM1, FLT3-ITD• Normal karyotype, no NPM1 or FLT3-ITD mutations23 (30,2)2 (14,3) Группа неблагоприятного риска: Unfavourable risk cohort  • –7/del(7q)5 (6,6)–• Комплексный или моносомный кариотип• Complex or monosomal karyotype9 (11,8)5 (35,8)• Нормальный кариотип + мутация в гене FLT3-ITD• Normal karyotype + FLT3-ITD mutation4 (5,3)–• Другое, в т. ч. сочетанные аномалии• Other, including combined abnormalities3 (4)2 (14,3)• Концентрация гемоглобина крови в дебюте, медиана (диапазон), г/л• Haemoglobin concentration at debut, median (range), g/L84 (50–142)85 (49–135)• Количество тромбоцитов крови в дебюте, медиана (диапазон), × 109/л• Platelet count at debut, median (range), × 109/L57 (3–417)56,5 (17–189)• Количество бластных клеток в костном мозге дебюте, медиана (диапазон), %• Blast cell count in bone marrow at debut, median (range), %65,8 (10,8–96,8)65,2 (23,2–92,8)

В качестве индукции ремиссии использовали различные программы химиотерапии (ХТ). В группе больных моложе 60 лет у большинства больных применяли программу ХТ по схеме «7+3», предусматривающую непрерывную инфузию цитарабина в дозе 200 мг/м2/сут. в течение 7 дней и введение в течение 3 дней антрациклинового антибиотика (даунорубицина либо идарубицина). Впоследствии 48,7 % больных (n = 37) из данной возрастной группы была выполнена трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК). В старшей возрастной группе у большинства больных применяли курсы низкодозной химиотерапии с гипометилирующими агентами. Алло-ТГСК этим больным не выполняли. Характеристика применявшихся программ лечения представлена в таблице 2.

Таблица 2. Характеристика программ лечения в зависимости от возрастаTable 2. Therapy structure in age cohorts

Программы индукционной ХТInduction chemotherapyБольные < 60 летPatients < 60 years(n = 76)Больные ≥ 60 летPatients ≥ 60 years(n = 14)Программы стандартной ХТStandard chemotherapy«7+3» — n (%)61 (80,3)4 (28,6)«7+3» с предфазой Aza — n (%)“7+3” + pre-phase with Aza, n (%)8 (10,5)–Курсы низкодозной ХТLow-dose chemotherapyAza-Ida-Ara-C, n (%)6 (7,9)4 (28,6)Dac-Ida-Ara-C, n (%)1 (1,3)1 (7,1)Aza + Венетоклакс, n (%)Aza + Venetoclax, n (%)–3 (21,4)Без лечения, n (%)Intact, n (%)–2 (14,3)Алло-ТГСК — n (%)Allo-HSCT, n (%)37 (48,7)0• в первой ремиссии, n• first complete remission, n31 • во второй ремиссии, n• second complete remission, n2–• вне ремиссии, n• no remission, n4 

Для проведения секвенирования нового поколения использовали технологию таргетного обогащения библиотек фрагментов ДНК HEAT-SEQ (Roche Diagnostics, Швейцария). Эта система основана на амплификации таргетных генов с использованием инвертированных молекулярных зондов для детекции различных вариантов исследуемых мишеней. Авторская панель Myelo_set_HEAT была подобрана на основании литературных данных и содержала гены ASXL1 (экзон 12), BCOR (экзоны 1–14), DNMT3 (экзоны 7–23), FLT3 (экзоны 13–16, 20), IDH1 (экзон 4), IDH2 (экзон 4), NPM1 (экзоны 10–11), PIGA (экзоны 1–5), RUNX1 (экзоны 4–9), SETBP1 (экзон 4), SF3B1 (экзоны 14–16), SRSF2 (экзон 1), TET2 (экзоны 3–11), TP53 (экзоны 4–10), U2AF2 (экзоны 2, 6) [34]. Анализ нуклеотидных последовательностей производили на полногеномном секвенаторе MySeq (Illumina, США) с использованием наборов MiSeq Reagents Kit v2 — 300 cycles (Illumina, США). Фильтрование данных, удаление служебных последовательностей, картирование прочтений, поиск вариантов и удаление повторов осуществляли при помощи утилит FastQC, SAMtools, trimmomatic, hsqutils и bwa. Полученные результаты анализировали с помощью свободного программного обеспечения wANNOVAR [35]. Информация о патогенности мутаций была получена из открытых баз данных COSMIC [36] и DB SNP.

Для определения мутаций генов NPM1, FLT3-ITD и CEBPA были использованы последовательности праймеров, описанные ранее [37][38]. Чтобы избежать аденилирования (присоединения лишнего аденина) при работе Taq-полимеразы и возникновения эффекта «двойных» пиков при капиллярном электрофорезе, на 5’ конце обратных праймеров была помещена нуклеотидная последовательность gtttctt, в соответствии с рекомендациями [39]. Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали реактивы ЗАО Синтол, Москва. 20 мкл реакционной смеси содержало: 100–200 нг ДНК, 5 пмоль прямого и обратного праймеров, dNTP (0,25 мМ), 10 × ПЦР-буфер, MgCl2 (2 мМ), DMSO 1,5 мкл, Taq-полимеразу (1,25 ед.). Условия ПЦР: 95° 7 мин, затем 30 циклов — 95° 45 сек, 60° 45 сек, 72° 60 сек, затем окончательная элонгация 72° 5 мин. ПЦР проводили на амплификаторе T100 (Bio-Rad Laboratories, США). Для капиллярного электрофореза и фрагментного анализа ПЦР-продуктов использовали автоматический анализатор нуклеиновых кислот ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Для этого 2 мкл разведенного в 50–250 раз ПЦР-продукта смешивали с 10 мкл Hi-Di формамида (Applied Biosystems, США) и 0,04 мкл GeneScan 500-LIS Size Standard (Applied Biosystems, США). После денатурации при 95 °C в течение 3 минут и последующего охлаждения 10 мкл смеси наносили в лунку 96-луночной плашки и проводили капиллярный электрофорез высокого разрешения на полимере POP-4 (Applied Biosystems, США). Флуоресценция и распределение амплификатов по длине оценивались при помощи компьютерной программы GeneMapper v. 4.0 (Applied Biosystems, США).

Для исследования точечных соматических мутаций генов IDH1 (p.R132H, p.R132C/G/S) и IDH2 (p.R140Q; p.R172K) использовали аллель-специфичную ПЦР в реальном времени. 200 нг ДНК вносили в 25 мкл реакционной смеси (ЗАО Синтол, Москва), содержащей 10 пмоль прямого и обратного праймеров и 7,5 пмоль пробы. ПЦР проводили в дупликатах на приборе Step One Real-Time PCR (Applied Biosystems, США). Условия ПЦР: 95° 5 мин, затем 50 циклов — 95° 30 сек, 62° 20 сек, 72° 20 сек. В качестве отрицательных контролей использовали смесь ДНК здоровых доноров. В качестве положительных контролей — образцы с подтвержденными секвенированием по Сенгеру мутациями.

Статистический анализ. Для статистической обработки данных использовали стандартные методы описательного, частотного и событийного анализа. Расчеты проводили с помощью процедур пакета SAS 9.4. Анализ общей выживаемости и безрецидивной выживаемости проводили с использованием оценок Каплана — Мейера и логрангового критерия для сравнения групп. При проведении многофакторного анализа и оценки отношения рисков использовали модель пропорциональных рисков (модель Кокса). Для сравнения категориальных переменных использовали критерий χ2. При анализе общей выживаемости временной интервал отсчитывали от даты диагностики заболевания до даты смерти (событие)/даты последнего контакта (цензурирование). При анализе безрецидивной выживаемости временной интервал отсчитывали от даты ремиссии до даты смерти или рецидива (событие)/даты последнего контакта (цензурирование). Поскольку в работе оценивали эффективность всего протокола терапии, в котором алло-ТГСК является его частью, цензурирование на момент трансплантации не выполняли.

Все больные были распределены по группам риска, согласно клиническим рекомендациям ELN 2017 [5]: среди больных моложе 60 лет группа благоприятного риска составила 23,7 % (n = 18), группа промежуточного риска — 48,7 % (n = 37), группа неблагоприятного риска — 27,6 % (n = 21). Среди больных от 60 лет и старше к указанным группам риска было отнесено 7,1 % (n = 1), 42,9 % (n = 6) и 50 % (n = 7) больных соответственно.

В группе моложе 60 лет у 41 (54 %) больного определили нормальный кариотип. Из цитогенетических аберраций в группе благоприятного риска у 6 (7,9 %) больных была выявлена t(8;21)(q22;q22.1); RUNX1-RUNX1T1, у 3 (4 %) — inv(16)(p13.1q22); CBFB-MYH11. В группе промежуточного риска у одного больного была выявлена t(9;11)(p21.3;q23.3); MLLT3-KMT2A. У 8 (10,5 %) больных в этой прогностической группе выявлялись численные, либо структурные цитогенетические перестройки, не классифицируемые как благоприятные или неблагоприятные, среди которых наиболее часто выявлялась трисомия 8-й хромосомы (n = 4). В группе неблагоприятного риска у 9 больных (11,8 %) был выявлен комплексный или моносомный кариотип, у 7 (9,2 %) больных определили моносомию 7-й хромосомы или del(7q), при этом у 2 — в сочетании c del(5q) или перестройкой гена EVI.

В группе больных от 60 лет и старше у 4 (28,6 %) больных был определен нормальный кариотип. Цитогенетических перестроек в группе благоприятного риска выявлено не было. В группе промежуточного прогноза были выявлены трисомия 8-й хромосомы, а также другие численные и структурные перестройки, не классифицируемые как благоприятные или неблагоприятные. В группе неблагоприятного прогноза у 5 (35,8 %) больных был выявлен комплексный кариотип.

Распределение по группам риска проводили согласно данным цитогенетического и молекулярно-генетического исследований на этапе установки диагноза. При проведении молекулярного исследования устанавливали наличие мутаций в генах CEBPA, NPM1 и FLT3-ITD, оценка аллельного соотношения мутантного типа к «дикому» при наличии мутации в гене FLT3-ITD не проводилась. Таким образом, больные с нормальным кариотипом и изолированной мутацией в гене FLT3-ITD были определены в группу неблагоприятного прогноза; в случае наличия у больных с нормальным кариотипом сочетанных мутаций NPM1 и FLT3-ITD их определяли в группу промежуточного прогноза.

В ходе проведенного исследования нуклеотидные замены были обнаружены в генах DNMT3, TET2, TP53, SETBP1, BCOR, RUNX1, IDH2, IDH1, FLT3, U2AF2, SF3B1 у 52 (57,8 %) из 90 больных. При этом у 16 (17,8 %) больных выявлены сочетанные мутации в двух или трех генах. Спектр выявленных мутаций представлен на рисунке 1.

При проведении настоящего исследования у 88 % больных были выявлены молекулярные либо цитогенетические перестройки, что сопоставимо с данными крупных исследований, согласно которым более 90 % больных ОМЛ имеют, как минимум, одну драйверную мутацию [33][34]. Для решения поставленных задач была выбрана молекулярная панель из 14 генов, мутации в которых имеют прогностическую значимость при ОМЛ. В целом частота большей части выявленных мутаций оказалась сопоставима с частотой, описываемой в литературе. Мутации гена DNMT3 были выявлены у 20 % больных, мутации гена TP53 — у 9 % больных, RUNX1 — у 8 %, IDH1/IDH2 — у 21 % [33][40][41]. Некоторые из исследовавшихся мутаций, такие как ASXL1, SRSF2, SF3B1, U2AF2 и BCOR, характерны для вторичного ОМЛ и для ОМЛ, обусловленного предшествовавшей химиотерапией, более чем для de novo ОМЛ [42]. Возможно, этим объясняется отсутствие (ASXL1) либо низкая частота мутаций выбранных генов у больных в нашем исследовании.

Сравнение долгосрочных результатов терапии больных в зависимости от молекулярно-генетического профиля подтвердило неблагоприятное прогностическое значение мутаций таких генов, как TP53 и RUNX1. Показано, что в группе больных без мутаций TP53 ОВ была достоверно выше, чем в группе с мутациями (54 % против 30 %). При оценке эффективности терапии в группе больных без мутаций TP53 частота достижения ПР составила 85,4 %, первично-рефрактерное течение заболевания констатировано у 8,5 % больных, а ранняя летальность составила 4,9 %. Данные об эффективности лечения одной больной отсутствуют. В группе больных с мутацией гена TP53 лишь у 50 % больных была достигнута ПР. Смертность составила так же 50 %: двое больных умерли до начала лечения, двое — на этапах индукции ремиссии. Таким образом, мутации гена TP53 являются независимым прогностическим фактором, оказывающим неблагоприятное влияние как на эффективность терапии, так и на ее долгосрочные результаты. Подавляющее большинство больных (75 %) с выявленными мутациями TP53 были отнесены к группе неблагоприятного риска по ELN 2017 [5]: у 5 больных выявили комплексный кариотип, у 1 — моносомный. Наблюдалась ассоциация между наличием указанных мутаций и возрастом: 62,5 % больных с мутациями принадлежали к старшей возрастной группе (≥ 60 лет). Полученные результаты соответствуют данным литературы, согласно которым мутации гена TP53 ассоциированы с пожилым возрастом, сложными цитогенетическими поломками, в частности, с комплексным либо моносомным кариотипом, и плохим прогнозом [23]. Схожие результаты при оценке долгосрочных результатов терапии были получены для больных с мутациями гена RUNX1 (ОВ для больных с мутациями составила 20 % по сравнению с 54 % у больных без мутаций). Однозначность получаемых результатов в отношении мутаций TP53 и RUNX1 лишний раз доказывает необходимость их исследования еще на этапе установки диагноза ОМЛ. В то же время при оценке БРВ не было выявлено достоверных различий в зависимости от наличия тех или иных мутаций.

Особенность настоящего исследования заключается в расширении диапазона исследуемых мутаций при ОМЛ с использованием новейших молекулярно-генетических технологий, в том числе секвенирования нового поколения. Данный метод позволяет значительно повысить производительность и чувствительность исследования по сравнению с методом секвенирования по Сэнгеру. Проведение высокопроизводительного секвенирования с использованием соответствующих генетических панелей является критически важным для онкогематологических заболеваний, в частности ОМЛ, с учетом высокой частоты мутаций у данных больных и появлением все большего количества таргетных препаратов.

Таким образом, проанализирован материал от 90 больных с впервые установленным диагнозом ОМЛ с помощью секвенирования нового поколения. Данный метод позволяет в короткие сроки проанализировать массивный объем информации и получить развернутую характеристику молекулярно-генетического статуса для каждого больного. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения мутационного профиля ОМЛ с большим объемом выборки и проведением развернутого статистического анализа.