Экстракорпоральный фотоферез (ЭКФ) — это многоступенчатая циклическая процедура, в которой мононуклеары больного подвергаются облучению ультрафиолетом спектра А (УФА) (1–2 Дж/см 2) с использованием фотосенсибилизатора 8-метоксипсоралена (8-МОП) в концентрации 60–400 нг/мл. ЭКФ используют для лечения аутоиммунных заболеваний, кожных Т-клеточных лимфом, при трансплантации солидных органов с целью профилактики отторжения трансплантата и для лечения острой и хронической форм реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) [1–13]. ЭКФ позволяет достичь должного ответа на терапию по сравнению с иммуносупрессивными/химиотерапевтическими агентами, но при этом легче переносится больными, безопаснее, не имеет значимых побочных явлений и длительно текущих осложнений [14–16]. В настоящее время не существует регламента, устанавливающего схему проведения процедур ЭКФ: их проводят от 1–3 раз в неделю до 4–8 в месяц [17]. План проведения устанавливается эмпирически на основании ответа на терапию [17]. Для оценки эффективности лечения РТПХ важно не количество облученных и перелитых клеток, а степень тяжести органного поражения и сроки начала терапии ЭКФ [18, 19]. У больных, у которых получен ответ на терапию ЭКФ, отмечено значимое улучшение качества жизни и выживаемости [14–16]. Учитывая периодически возникающие трудности с сосудистым доступом, длительностью процедуры, невозможностью проведения афереза лейкоцитов на фоне лейкопении у больных с острой РТПХ и высокую стоимость расходных материалов, актуальным становится вопрос о возможности криоконсервирования мононуклеаров, подвергшихся фотооблучению.

Цель настоящей работы — анализ функциональных особенностей криоконсервированных после ЭКФ мононуклеаров.

Больные

В исследование было включено 12 больных с хронической РТПХ (хрРТПХ), из них 5 женщин и 7 мужчин, в возрасте от 19 до 68 лет (медиана — 35 лет), которым в 2017–2019 гг. была выполнена терапия ЭКФ. Основным заболеванием, по поводу которого была выполнена трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК), у 10 больных был острый лейкоз, у 2 — лимфопролиферативные заболевания. У 11 больных алло-ТГСК была выполнена от полностью совместимого донора (у 5 больных — от родственных доноров и у 6 больных — от неродственных доноров) и у 1 больной — от гаплоидентичного донора. Всем больным проводили ЭКФ для лечения хрРТПХ, рефрактерной к терапии глюкокортикостероидными гормонами. Ответ на терапию хрРТПХ оценивали по 3 категориям: полный ответ — полное обратное развитие всех проявлений хрРТПХ; частичный ответ — регресс (полный или частичный) клинических проявлений хотя бы в одном органе-мишени, при отсутствии прогрессии по другим органам-мишеням; отсутствие ответа — включало в себя «отсутствие каких-либо изменений»; смешанный ответ — улучшение по ранее затронутому органу-мишени, при наличии прогрессии в другом органе-мишени и прогрессия хрРТПХ. Сочетание полного и частично ответа рассматривали как общий ответ.

У 5 больных исследование концентрата мононуклеаров проводили от 2 до 4 раз в разные дни с интервалом более 1 недели, а у 7 больных — однократно.

Аферез и процессинг мононуклеаров

Аферез мононуклеаров проводили на клеточном сепараторе «SpectraOptia» («Terumo BCT», Япония/США) в режиме сбора мононуклеаров (МНК) со следующими параметрами процедуры: соотношение кровь/антикоагулянт — 12:1; настройка сбора (collection preferred) — 40. В результате было обработано от 0,8 до 1,7 от объема циркулирующей крови (медиана — 1,19), медиана времени процедуры — 180 мин (120–250 мин), медиана объема полученного концентрата мононуклеаров составила 85 мл (60–120 мл).

Для исследования были сформированы 5 видов проб концентрата мононуклеаров (рис. 1):

1.1. Мононуклеары после афереза без замораживания и без проведения ЭКФ (n = 25 проб);

1.2. Мононуклеары после афереза после замораживания и без проведения ЭКФ (n = 19);

1.3. Мононуклеары после афереза после замораживания и c проведением ЭКФ после размораживания (n = 25);

2.1. Мононуклеары после проведения ЭКФ без замораживания (n = 25);

2.2. Мононуклеары после проведения ЭКФ с последующим замораживаем и размораживанием (n = 19).

Образцы для исследования отбирались непосредственно после афереза (группы 1.1 и 1.2), и после ЭКФ (группы 1.3, 2.1 и 2.2). Образцы групп 1.1, 1.2 и 1.3 отбирали из контейнера системы для сбора мононуклеаров («Spectra Optia Collection Set 10110», «TerumoBCT», Япония/США) во встроенный в систему контейнер для отбора проб. В оставшийся лейкоконцентрат добавляли изотонический раствор хлорида натрия до достижения общего объема продукта 300 мл, после чего в ламинарном шкафу производили отбор пробы для контроля параметров продукта на гематологическом анализаторе («Sysmex KX-21n», Япония) перед облучением: количество лейкоцитов в концентрате мононуклеаров составило 1,9–10 × 10 9 (медиана — 5,85 × 10 9), гематокрит — 0,2–2,1 % (медиана — 0,8 %). Концентрат мононуклеаров переливали в специальный контейнер для облучения с последующим удалением воздуха из него. Затем в затемненном помещении в продукт добавляли 8-МОП (METOXSALENE S. A.L.F SpA, Италия) в дозе 200 нг/мл и инкубировали в течение 5 мин. Облучали на аппарате «Macogenic G2» («Macopharma», Франция) согласно рекомендациям производителя: продолжительность облучения составила от 546 до 682 с (медиана — 606 с) в дозе 2 Дж/см 2. После облучения, также в условиях ламинарного шкафа (Nuaire, NU-481–400E, США), производили отбор образцов 2.1 и 2.2. Часть образцов анализировались сразу (группы 1.1 и 2.1), а часть замораживали при –70 °C и анализировали после размораживания (группы 1.2 и 2.2). После размораживания в пробу 1.3 добавляли 8-МОП (METOXSALENE S. A.L.F SpA, Италия) в дозе 200 нг/мл и облучали на аппарате «Macogenic G2» («Macopharma», Франция) с аналогичными параметрами облучения, а после анализировали аналогично остальным группам. По 5 образцов из каждой группы анализировали до и после 48 ч культивирования, чтобы проверить изменение показателей апоптоза в динамике.

Криоконсервирование клеток. Суспензии мононуклеаров в объеме 100 мкл замораживали в холодном растворе 6 %-ного полиглюкина с добавлением 100 мкл 10 %-ного диметилсульфоксида. Замороженные клетки хранили при температуре –70 °C не менее 2 сут. Размораживание осуществляли при 37 °C и отмывали средой RPMI1640 с 10 %-ной инактивированной человеческой сывороткой IV группы.

Культивирование мононуклеаров. Поскольку в разных популяциях лейкоцитов апоптоз запускается с различной скоростью на протяжении нескольких суток, 5 образцов из каждой группы были культивированы для определения динамики изменения показателей раннего и позднего апоптоза с течением времени. Культивирование проводили в среде RPMI1640 с добавлением 10 %-ной инактивированной человеческой сыворотки IV группы, 2 мМ глютамина, 100 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Клетки рассаживали по 10 6 на мл в 24-ячеечные планшеты. Мононуклеары культивировали в течение 2 сут. при температуре 37 °C и 5 % СО2. Подсчет клеток производили в камере Горяева после окраски генцианвиолетом на 3 %-ной уксусной кислоте или 0,5 %-ным трипановым синим.

Проточная цитометрия. Для оценки апоптоза клеток использовали коммерческий набор FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I («BD Biosciences», США), включающий аннексин V FITC и пропидия йодид (PI). Для отделения лейкоцитов использовали анти-CD45 APC–Cy7 моноклональные антитела (клон 2D1). Для окрашивания брали около 0,2 × 10 6 клеток, отмывали 1 мл среды RPMI1640 с 10 %-ной человеческой инактивированной сывороткой IV группы. Осадок ресуспендировали в 100 мкл аннексин-связывающего буфера и вносили антитела согласно инструкции к набору. Инкубировали 20 мин при комнатной температуре. После этого добавляли к образцу еще 400 мкл аннексин-связывающего буфера и проводили цитометрический анализ с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCanto II («BD Biosciences», США). Цитометрический анализ включал в себя выделение гейта лимфоцитов, основываясь на высоком показателе экспрессии антигена CD45 и низких показателях прямого и бокового светорассеяния этих клеток, последующее определение количества клеток на ранней и поздней стадиях апоптоза. На ранних стадиях апоптоза считались клетки, которые связывались только с аннексином V, а на поздних стадиях — с аннексином V и с пропидия йодидом [20] (рис. 2).

Статистический анализ. Статистический анализ данных проводили с помощью GraphPad Prism 6. Проверку нормальности распределения выполняли с использованием критерия Шапиро — Уилка. Сравнение полученных данных осуществляли с помощью парного критерия Уилкоксона с поправками на множественное сравнение. Значимыми признавались отличия при p < 0,05.

Доля клеток в ранней стадии апоптоза (рис. 3 А) была больше в образцах, подвергшихся замораживанию и размораживанию без ЭКФ (1.2), замораживанию и размораживанию с последующим ЭКФ (1.3) и ЭКФ с последующим замораживанием и размораживанием (2.2) по сравнению с образцами группы после ЭКФ без замораживания и размораживания (группа 2.1). Но при сравнении с группой контроля (1.1 — клетки после афереза) достоверные отличия были выявлены только для групп, в которых клетки только замораживали и размораживали (1.2) и замораживали после ЭКФ (2.2) (p < 0,05).

Доля клеток в поздней стадии апоптоза (рис. 3 Б) увеличивалась во всех группах, в которых проводили замораживание и размораживание (1.2, 1.3 и 2.2) по сравнению с группой контроля после афереза (1.1). При сравнении опытных групп с группой после ЭКФ без замораживания и размораживания (2.1) отмечено увеличение доли клеток в поздней стадии апоптоза как в после замораживания и размораживания (1.2), так и замораживании до ЭКФ (1.3) и после ЭКФ (2.2) (p < 0,05).

Впервые в 2011 г. E. Merlin и соавт. [21] показали, что криоконсервирование мононуклеаров до ЭКФ не влияет на их иммуномодулирующие свойства после ЭКФ. С. Pochon и соавт. [22] установили, что частота достижения общего ответа у больных на терапию хрРТПХ, которым проводили трансфузии предварительно замороженных, а затем подвергнутых фотооблучению мононуклеаров, соответствует частоте достижения общего ответа у больных на терапию хрРТПХ после трансфузии мононуклеаров без предварительного замораживания, а жизнеспособность лейкоцитов была достоверно меньше после криоконсервирования. Показаниями для проведения криоконсервирования мононуклеаров были: плохой венозный доступ, бактериальные инфекции, тяжелое состояние больного, глубокая цитопения и проживание больного вдали от трансплантационного центра [22]. K. Radwanski и соавт. [23] проанализировали апоптотическую и пролиферативную способности лимфоцитов в культуре клеток, полученных от здоровых доноров, и установили, что криоконсервирование не влияло на апоптоз и антипролиферативную активность лимфоцитов, подвергшихся ЭКФ.

Механизм действия ЭКФ до сих пор неясен. Можно выделить два основных механизма действия ЭКФ, не исключающих друг друга: первый механизм — апоптоз лейкоцитов, вызванный перекрестными сшивками ДНК в клетках, обработанных 8-МОП, и элиминация аутореактивных клеток; второй механизм основан на иммуномодулирующем эффекте ЭКФ, инициации созревания дендритных клеток из моноцитов, изменении цитокинового профиля, стимуляции Т-регуляторных клеток [24]. После реинфузии эти клетки фагоцитируются антигенпрезентирующими клетками (АПК), что вызывает активацию АПК. В результате ЭКФ повышается доля Т-регуляторных лимфоцитов и уменьшается продукция интерлейкина (ИЛ)-17 Т-хелперами [19][25–30]. Также после ЭКФ отмечается уменьшение концентрации в крови провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, фактора некроза опухоли-α) [24][25][31][32]. Наряду с этим ЭКФ-индуцированный иммуносупрессивный эффект и уменьшение содержания в крови провоспалительных цитокинов не связаны со стимуляцией апоптоза Т-клеток, поскольку уменьшение концентрации цитокинов в крови происходит в первые часы после ЭКФ, а доля клеток, в которых запущен апоптоз, увеличивается только к концу первых суток после процедуры [33]. В исследовании L. I. Craciun и соавт. было показано, ЭКФ модифицирует аутологичные лимфоциты, индуцируя в них апоптоз, что приводит к активации моноцитов и макрофагов, что приводит к увеличению количества ИЛ-10 и ИЛ-1 [34].

В большинстве лейкоцитов процесс апоптоза запускается только через 48 ч после ЭКФ, причем чувствительность разных популяций лейкоцитов к этой процедуре различается между собой [28][35–37]. CD3+-клетки более чувствительны к ЭКФ, чем CD19+ [38]. Апоптоз в аллореактивных Т-клетках проходит быстрее, чем в покоящихся Т-клетках [39]. Медленнее всего апоптоз происходит в моноцитах. К первому дню in vitro апоптозу подвергается около 20 % популяции моноцитов и только к шестому дню — около 80 %, при этом на протяжении всего этого времени моноциты сохраняют свои основные функции (фагоцитоз, дифференцировка в дендритные клетки). ЭКФ вызывает их активацию и дифференцировку в дендритные клетки [40].

В настоящем исследовании основной задачей было сравнить группы образцов, подвергшиеся только лишь ЭКФ, и образцы, размороженные после ЭКФ, чтобы проверить, возможно ли заготавливать уже обработанные лейкоконцентраты для дальнейшего введения больным. Такой подход, во-первых, позволяет сократить длительность пребывания больного в лечебном учреждении, сократить количество процедур афереза, а во-вторых, облегчить проведение ЭКФ у больных, проживающих вдали от трансплантационного центра, посредством передачи сначала фотооблученных, а далее подверженных криоконсервированию концентратов мононуклеаров в учреждения, находящиеся в непосредственной близости к месту жительства больного. Полученные результаты показали, что на апоптоз лейкоцитов в большей степени влияет криоконсервирование, чем процедура ЭКФ. Однако при этом доля клеток, находившихся в ранней и поздней стадиях апоптоза, после культивирования во всех группах оказалась примерно одинаковой, а значит, несмотря на разные инициальные условия образцов, допустима возможность их заморозки после ЭКФ. Доля лимфоцитов в поздней стадии апоптоза спустя 2 суток культивирования после процедуры ЭКФ сопоставима с долей лимфоцитов в поздней стадии апоптоза при проведении ЭКФ с последующим криоконсервированием лейкоконцентрата, как и с долей лимфоцитов в поздней стадии апоптоза при криоконсервировании лейкоконцентрата без проведения ЭКФ. Из-за небольшого числа образцов, подвергшихся культивированию, нельзя утверждать о достоверном увеличении раннего или позднего апоптоза по сравнению с исходным уровнем (во всех случаях р > 0,06), однако можно предполагать тенденцию к увеличению количества клеток в состоянии позднего апоптоза.

Таким образом, учитывая отсутствие зависимости эффекта ЭКФ от количества облучаемых и переливаемых больному мононуклеаров, обоснованным является проведение сбора мононуклеаров, выполнение их ЭКФ и в дальнейшем разделение фотооблученных мононуклеаров на несколько частей как для криоконсервирования, так и для возврата некриоконсервированного концентрата фотооблученных мононуклеаров больному. Такая тактика позволит уменьшить количество процедур сбора мононуклеаров и обработки клеток, благодаря чему уменьшаться общие затраты на процедуру ЭКФ. Аналогичным образом могут быть использованы криоконсервированные мононуклеары, не подвергавшиеся ЭКФ.