Множественная миелома (ММ) представляет собой B-клеточную опухоль с дифференцировкой малигнизированных клеток-предшественников до плазматических клеток. Заболеваемость ММ составляет 1 % от всех случаев опухолевых заболеваний [1]. Благодаря широкому использованию ингибиторов протеасом и иммуномодулирующих препаратов, а также высокодозной химиотерапии (ВХТ) с трансплантацией аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ауто-ТГСК), медиана общей выживаемости больных увеличилась до 5–7 лет, однако прогрессия болезни считается неизбежной [1],[2]. Развитие ММ ассоциировано с генетическими изменениями на уровне клеток, приводящими к нарушениям взаимодействий между опухолью, микроокружением и иммунной системой. Одним из проявлений такого взаимодействия является развитие Т-клеточного истощения (T-cell exhaustion), которое фенотипически характеризуется стабильной экспрессией ингибиторных сигнальных «чек-поинт» молекул (ИСМ), таких как PD-1, LAG-3, TIM-3, а функционально приводит к уменьшению секреции провоспалительных цитокинов (интерлейкина-2, интерферона-γ (ИФН-γ) фактора некроза опухоли альфа), выраженному снижению цитотоксической функции и пролиферативного потенциала [3], что препятствует развитию полноценного противоопухолевого иммунного ответа. В то же время экспрессия одной или нескольких ИСМ не является показателем Т-клеточного истощения. ИСМ экспрессируются активированными Т-клетками с сохранной пролиферативной и цитотоксической функциями в норме и при патологии [4],[5].

Увеличение количества Т-клеток, экспрессирующих ИСМ — PD-1, TIM-3, LAG-3 и др., выявлено при классической лимфоме Ходжкина (ЛХ), некоторых неходжкинских лимфомах (НХЛ) и ММ [6],[7],[8]. Использование препаратов моноклональных антител, блокирующих ИСМ, приводит к увеличению выживаемости при резистентном течении ЛХ [9],[10]. Результаты таргетной анти-PD-1 терапии при рецидивирующих/резистентных НХЛ и ММ в настоящее время очень скромны [11],[12].

ВХТ с ауто-ТГСК остается стандартом лечения больных ММ, не имеющих противопоказаний. Проведение ВХТ приводит к деплеции опухолевого клона и к длительной лимфопении; последняя индуцирует периферическую экспансию зрелых лимфоцитов, реинфузированных в составе аутологичного продукта афереза совместно с гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК). Таргетная терапия, направленная против ИСМ, представляется перспективным методом усиления противоопухолевого иммунного ответа в посттрансплантационном периоде [13]. Динамика восстановления Т-клеток, экспрессирующих ИСМ, после ауто-ТГСК, в том числе при ММ, недостаточно изучена, а имеющиеся данные противоречивы. Увеличение экспрессии PD-1 описано в последние два года в моделях трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, выполненных на мышах [14],[15], у больных после ауто-ТГСК [14], у больных гемобластозами после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток [16] и больных системной склеродермией после ауто-ТГСК [17]. У больных ММ не было ранее выявлено различий в содержании ИСМ до и после ВХТ с ауто-ТГСК [18].

Цель настоящей работы — изучить динамику восстановления Т-клеток, экспрессирующих PD-1 и TIM-3, у больных ММ в условиях длительной лимфопении после ВХТ с ауто-ТГСК, а также оценить их функциональные свойства.

В исследование включены 40 больных ММ, которым в период с марта 2018 г. по январь 2020 г. были проведены ВХТ и ауто-ТГСК на базе ФГБНУ «Научноисследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии» (табл. 1).

Проведена сравнительная оценка содержания CD4+ и CD8+ Т-клеток, экспрессировавших PD-1 и TIM-3, в циркуляции и КМ до ауто-ТГСК, на момент выхода из лейкопении (только ПК) и через 6 мес. после ауто-ТГСК. Относительное количество большинства субпопуляций циркулировавших Т-клеток, экспрессировавших PD-1 и TIM-3, было значимо меньше соответствующих значений в КМ как до ВХТ, так и через 6 мес. после ауто-ТГСК. Не выявлено различий между содержанием в ПК и КМ только для TIM-3+ субпопуляции CD8+ Т-клеток (на обеих точках) и для PD-1+ CD4+ Т-клеток через 6 мес. после ауто-ТГСК (табл. 2). Выявлено транзиторное увеличение содержания PD-1 и TIM-3-позитивных субпопуляций в циркулирующих Т-клетках в раннем посттрансплантационном периоде. Процентное содержание большинства исследуемых субпопуляций Т- клеток (кроме PD-1+ CD8+ Т-клеток) на день выхода из лейкопении (в среднем, 14-е сутки после ауто-ТГСК) было значимо больше как исходных показателей, так и их значений через 6 мес. наблюдения. Содержание TIM-3+ CD4+ Т-клеток и PD-1+ и TIM-3+ субпопуляций CD8+ Т-клеток через 6 мес. после ауто-ТГСК не отличалось от соответствующих показателей перед ВХТ, а содержание PD-1+ и PD-1+ TIM-3+ субпопуляций CD4+ Т-клеток оставалось более высоким (табл. 2).

Теоретическим обоснованием использования моноклональных антител против ИСМ или их лигандов является увеличение экспрессии этих молекул на эффекторных Т-клетках при онкологических заболеваниях. Передача сигнала через ИСМ — PD-1, TIM-3, LAG-3 и др. — в норме играет регулирующую роль, ограничивая интенсивность иммунного ответа. Также экспрессия ИСМ ассоциирована с Т-клеточным истощением, состоянием дисфункции Т-клеток памяти, возникающим в условиях постоянной антигенной стимуляции. Повышенная экспрессия соответствующих лигандов ИСМ, например, PD-L1 и PD-L2 для PD-1, малигнизированными клетками и/или их микроокружением является одним из путей «ухода» опухоли из-под иммунного надзора [3]. Моноклональные антитела (анти-PD-1, анти-PDL1, анти-CTLA-4) конкурентно блокируют взаимодействия между лигандом и рецептором, предотвращая ослабление противоопухолевого иммунного ответа. Попытки использования терапевтических моноклональных анти-PD-1 антител при различных вариантах течения и этапах терапии ММ не привели к значимым клиническим результатам, хотя отмечено большое количество иммуноопосредованных нежелательных реакций. Однако исследования в этом направлении продолжаются [20]. Настоящая работа посвящена количественной характеристике и изучению функциональных свойств циркулирующих Т-клеток, экспрессирующих PD-1 и TIM-3, у больных ММ после ВХТ с ауто-ТГСК.

Относительное количество большинства субпопуляций Т-клеток, экспрессирующих PD-1 и TIM-3 ИСМ, было больше в образцах КМ по сравнению с ПК (не выявлено различий для CD8+ TIM-3+ Т-клеток) как перед ВХТ, так и через 6 мес. после ауто-ТГСК. С учетом преимущественного поражения опухолевым процессом КМ, описанное распределение дисфункциональных Т-клеток представляется закономерным, однако ранее опубликованные данные противоречивы. С. Zelle-Rieser и соавт. [6] на небольшой выборке (n = 7–12) не обнаружили различий между содержанием PD-1+ клеток в КМ и ПК. J. Tan и соавт. [21] показали большее содержание CD8+ PD-1+ субпопуляции в КМ по сравнению с ПК, в то время как содержание CD4+ PD-1+ Т-клеток и TIM-3+ T-клеток (включая PD-1+ TIM-3+ субпопуляции) в КМ значимо не отличалось от таковых в ПК 10 больных ММ при проведении лечения.

В настоящей работе показано выраженное увеличение содержания большинства PD-1-и TIM-3-экспрессирующих субпопуляций Т-клеток (не выявлено различий для CD8+ PD-1+ Т-клеток) в раннем посттрансплантационном периоде — на день выхода из лейкопении после ауто-ТГСК, — которое не зависело от относительного содержания CD4+ и CD8+ Т-клеток. Через 6 мес. доля PD-1-и TIM-3-положительных Т-клеток была значимо меньше, чем при восстановлении, либо достигала предтрансплантационных значений, либо несколько превышала их. В работах N. Marshall и соавт. [14] и F. Simonetta и соавт. [16], исследовавших уровень экспрессии PD-1 после ауто-ТГСК и трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток, соответственно, также было показано неожиданное увеличение экспрессии PD-1 и относительного содержания PD-1+ Т-клеток после выхода из лейкопении. Ранее D. J. Chung и соавт. [18] описали сохранение экспрессии ИСМ, в том числе PD-1 и TIM-3, Т-клетками ПК больных ММ через 3 мес. после ауто-ТГСК на предтрансплантационном уровне, что также согласуется с нашими данными о восстановлении на 6 мес. после ауто-ТГСК.

Учитывая высокое относительное содержание циркулирующих Т-клеток, экспрессирующих PD-1 и TIM-3 в раннем посттрансплантационном периоде, была проведена оценка внутриклеточной экспрессии маркера пролиферации Ki-67 в исследуемых субпопуляциях до и после ауто-ТГСК. Выявлено значительное увеличение доли активно пролиферирующих PD-1- и TIM-3-положительных Т-клеток на день выхода из лейкопении по сравнению с показателями до ВХТ, при этом процент Ki-67-позитивных клеток среди PD-1+ T-лимфоцитов был значимо больше по сравнению с PD-1- Т-лимфоцитами как перед кондиционированием, так и на день выхода из лейкопении. Через 6 мес. после ауто-ТГСК интенсивность пролиферации уменьшалась до исходных значений.

Т-клетки в состоянии истощения помимо сниженного пролиферативного потенциала характеризуются уменьшением цитотоксической и цитокин-продуцирующей активности. Для оценки этих свойств PD-1-и TIM-3-экспрессирующих Т-клеток исследована продукция гранзима В и ИФН-γ до и после ауто-ТГСК. Показано, что значительная часть CD8+ PD-1+ и CD4+ PD-1+ Т-клеток больных ММ перед кондиционированием обладала выраженным цитотоксическим и цитокин-продуцирующим потенциалом, не отличаясь от PD-1-негативного компартмента, либо превосходя его. В данном случае экспрессию PD-1, вероятно, нужно рассматривать в качестве маркера активированных, либо «ранних дисфункциональных», но не терминально истощенных Т-клеток. F. M. Schnorfeil и соавт. [5] ранее описали сохранную функциональную активность PD-1+ CD4+ и CD8+ Т-клеток при остром миелоидном лейкозе, сделав заключение об отсутствии значимой клинической роли Т-клеточного истощения в развитии болезни. Сохранение либо даже усиление цитотоксических, ИФН-γ-продуцирующих и пролиферативных свойств PD-1-экспрессирующими Т-клетками на ранних этапах Т-клеточной дисфункции/истощения было недавно описано при меланоме [22],[23], немелкоклеточном раке легкого [24] и гепатоцеллюлярной карциноме [25].

Функциональная активность CD8+ TIM-3+ и CD4+ TIM-3+ Т-клеток, напротив, была значимо снижена по сравнению с TIM-3-негативными Т-клетками. Можно предположить, что, несмотря на описанную в экспериментах in vitro возможность экспрессии на активированных Т-клетках [4],[26], молекула TIM-3 более ассоциирована с состоянием Т-клеточного истощения, чем PD-1. Ранее Z. Li и соавт. [27] описали более выраженные нарушения продукции CD8+ TIM-3+ PD-1– Т-клетками цитокинов, гранзима В и перфорина по сравнению с CD8+ PD-1+ TIM-3– клетками у больных злокачественной шванномой. Подобных данных для гематологических заболеваний ранее опубликовано не было, и регулирующая роль этого рецептора при ММ требует дальнейшего изучения.

Низкие уровни Ki-67-экспрессирующих гранзим В- и ИФН-γ-продуцирующих клеток в субпопуляциях TIM-3+ PD-1+ Т-клеток согласуются с данными литературы о совместной экспрессии двух и более ИСМ как маркера Т-клеточного истощения [3], [22],[23],[24],[25],[28].

Относительное количество гранзим В-продуцирующих клеток среди CD8+ PD-1+ , CD8+ TIM-3+ и CD8+ PD-1+ TIM-3+ Т-клеток было значимо увеличено после ауто-ТГСК на день выхода из лейкопении по сравнению с показателями до ВХТ, при этом цитотоксический потенциал CD8+ TIM-3+ клеток достигал значений TIM-3-негативного пула. Доля ИФН-γпродуцирующих клеток среди всех исследованных PD-1+ и TIM-3+ субпопуляций Т-клеток после аутоТГСК соответствовала уровню до ВХТ.

Интерес представляет описанное в настоящей работе значительное увеличение активно делящихся PD-1-и TIM-3-экспрессирующих Т-клеток в условиях лимфопении после ВХТ с ауто-ТГСК, которое могло быть инициировано гомеостатической пролиферацией зрелых лимфоцитов. В настоящее время отсутствуют данные о влиянии гомеостатических цитокинов интерлейкинов -2, -7 и -15 на экспрессию ИСМ и/или экспансию и свойства дисфункциональных/истощенных Т-клеток. Состояние Т-клеточного истощения возникает вследствие длительной антигенной стимуляции через Т-клеточный рецептор (ТКР), в то время как гомеостатическая пролиферация — цитокинопосредованный ТКР-независимый процесс [29]. Учитывая растущий интерес к таргетной терапии, направленной на блокаду ингибиторных чек-поинт рецепторов и их лигандов, при ММ, необходимы дальнейшие исследования экспансии Т-клеток в условиях лимфопении, как фактора, способного изменять количественные и функциональные характеристики клеток-мишеней.

Исходя из полученных данных, можно заключить, что выявленное более высокое содержание циркулирующих PD-1-позитивных Т-клеток у больных ММ ассоциировано с субпопуляциями, не находящимися в состоянии терминального Т-клеточного истощения и сохранившими свои функциональные свойства. Относительное количество функционально активных клеток было более низким среди CD8+ TIM-3+ и CD4+ TIM-3+ Т-клеток, а также в субпопуляциях, ко-экспрессирующих PD-1 и TIM-3. Для идентификации состояния Т-клеточного истощения необходима оценка субпопуляций Т-клеток, ко-экспрессирующих PD-1, TIM-3 и другие ИСМ, и/или исследование их функциональных свойств. Относительное количество Т-клеток, экспрессирующих PD-1 и TIM-3, значимо увеличивается после ВХТ с ауто-ТГСК. В раннем посттрансплантационном периоде также значительно увеличиваются пролиферативная активность PD-1+ и TIM-3+ CD4+ и CD8+ Т-клеток и цитотоксический потенциал PD-1+ и TIM-3+ CD8+ Т-клеток по сравнению с показателями до ауто-ТГСК.