С развитием теории клеточной модели гемокоагуляции [1] и формированием представлений об особенностях пространственной регуляции тромбиногенеза и фибриногенеза в условиях in vitro [2] возникли вопросы, касающиеся механизмов гемостатических реакций in vivo. Исходя из результатов исследований, направленных на изучение гемостатических и гемостазиологических эффектов низких доз фибрин-мономера (структурно — дезААВВ-фибриноген, ФМ) [3], можно констатировать наличие у данного производного фибриногена собственного гемостатического потенциала. Системный гемостатический эффект экзогенного ФМ в дозе 0,25 мг/кг наблюдался после нанесения дозированной травмы печени не только у животных из группы плацебо, но и при гипофибриногенемии, обусловленной применением стрептокиназы [4]. В этом случае интенсивность гемостатического эффекта у ФМ была сопоставима с таковой при введении транексамовой кислоты (ТК). ФМ в проведенных экспериментах применялся в дозе, близкой к его физиологическим значениям в плазме крови здоровых людей (менее 7,8 мкг/мл) [5]. Учитывая данное обстоятельство, можно предположить, что при равномерном разведении в кровотоке использованная доза ФМ вряд ли способна к образованию основы тромба на раневой поверхности. Однако, по данным морфологических исследований, было выявлено, что следствием системного введения ФМ является усиление фибринообразования в области раневой поверхности при формировании дозированной травмы печени [6], что пока не нашло своего объяснения. Для лучшего понимания механизмов этого феномена целесообразно оценить совокупность данных, включая анализ морфологической картины зоны повреждения. В качестве препарата сравнения может быть использована ТК [7],[8].

Цель настоящего исследования заключалась в сопоставлении морфологических, гемостатических и гемостазиологических последствий внутривенного введения ТК и ФМ при гипофибриногенемии, обусловленной применением стрептокиназы, после дозированной травмы печени.

Исследование выполнено на 73 здоровых кроликах самцах породы шиншилла массой 3,0–4,5 кг, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Из животных методом блочной рандомизации были сформированы четыре экспериментальные группы (рис. 1).

Животным 1-й группы (n = 21) в краевую вену уха в/в при помощи иглы-катетера «Cathy» («HMD», Индия) вводили водный раствор плацебо (3,75 М раствор мочевины, соответствующий ее концентрации в растворе ФМ), в объеме 0,5 мл, затем через 1 час проводили лапаротомию и наносили стандартную травму печени в соответствии с имеющимися рекомендациями [9] в условиях общей анестезии препаратом Телазол («Зоэтис», Россия), в/в 10 мг/кг. Животным групп со 2-й по 4-ю для активации фибринолиза в начале эксперимента в/в вводили водный раствор стрептокиназы (РУП «Белмедпрепараты», Республика Беларусь) в дозе 150 000 МЕ/кг. Через 1 час животным указанных выше групп в/в вводили водные растворы следующих препаратов: во 2-й группе (n = 16) — плацебо, в 3-й группе (n = 12) — ТК (Транексам®, ФГУП «Московский эндокринный завод», Россия) в дозе 15 мг/кг, в 4-й группе (n = 24) — ФМ [10] в дозе 0,25 мг/кг. Спустя 1 ч после введения плацебо и ФМ животным 2-й и 4-й групп, а животным 3-й группы — через 30 мин выполняли стандартную травму печени в условиях общей анестезии препаратом Телазол. После нанесения травмы при помощи марлевых салфеток оценивали характер паренхиматозного кровотечения — по объему кровопотери в процентах от расчетного объема циркулирующей крови ( % ОЦК) с учетом массы тела животного, а также по темпу кровопотери в единицу времени (мг/с) [9],[11]. Для определения объема кровопотери использовали среднюю величину ОЦК, равную 7 % от массы тела животного [9]. Темп кровопотери рассчитывали путем произведения объема раневой кровопотери (в мг) на длительность кровопотери (в секундах) после полной остановки кровотечения. Эксперимент заканчивали в момент прекращения кровотечения из раны, либо после остановки сердечно-легочной деятельности у животного (летальный исход) вне зависимости от продолжающегося кровотечения. Животных выводили из эксперимента после полного прекращения кровотечения из раны, путем введения анестетика в летальной дозе (в 3–4 раза превышающей терапевтическую) [12].

Для исследования системы гемостаза кровь получали из краевой вены уха (самотеком) после флеботомии дважды — перед введением препаратов и нанесением травмы печени (рис. 1). Кровь помещали в пробирки с соответствующими стабилизаторами: для подсчета количества тромбоцитов — с калиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты в объеме 0,25 мл, для изучения других параметров — в полистироловые, содержащие 0,11 М (3,8 %) раствор цитрата натрия (соотношение крови и стабилизатора — 9 : 1), в объеме 5,0 мл. Получение обедненной тромбоцитами плазмы крови проводили по общепринятой методике. Исследование гемокоагуляции предусматривало оценку количества тромбоцитов в венозной крови на гематологическом анализаторе «Drew-3» («Drew Scientifi c Inc.», Великобритания/США), концентрации фибриногена на коагулометре Thrombostat 2 («Behnk Electronik», Германия) с применением набора «ТехФибриноген-тест» («Технология-Стандарт», Россия). В качестве интегрального метода исследования системы гемостаза выполняли оценку генерации тромбина методом калиброванной тромбографии с использованием планшетного флуориметра «Fluoroskan Ascent» («ThermoFisher SCIENTIFIC», Финляндия), с программным обеспечением «Thrombinoscopeтм 3.0.0.26» и наборами реагентов фирмы «Thrombinoscope® bv» (Нидерланды) Учитывали следующие показатели теста: Lagtime — время инициации образования тромбина; ETP — эндогенный тромбиновый потенциал; Peak thrombin — пиковая концентрация тромбина; ttPeak — время достижения пиковой концентрации тромбина; V — скорость образования тромбина.

После остановки кровотечения для гистологического исследования у животных забирали ткань печени, включая всю раневую часть и фрагмент неповрежденной поверхности, с последующей фиксацией в 10%-ном растворе нейтрального формалина по Лилли. Проводку материала осуществляли по изопропиловому спирту с помощью автомата проводки карусельного типа «TISSUE-TEK VI PTM6» (фирма «Sakkura», Япония). Парафинизацию проводили при помощи станции парафиновой заливки «TISSUE-TEK TEC 5» («Sakkura», Япония). Гистологические срезы толщиной 4–5 мкм получали с использованием полуавтоматического роторного микротома «Accu-Cut SRM» («Sakkura», Япония), препараты окрашивали гематоксилином и эозином в автомате для автоматической окраски микропрепаратов «TISSUE-TEK Prisma» («Sakkura», Япония) и заключали под пленку в автомате для автоматического заключения микропрепаратов «TISSUE-TEK Film» («Sakkura», Япония). Для определения морфологической структуры фибрина в тканях, окраску подготовленных срезов проводили методом оранжевый-красный-голубой (ОКГ) по Д. Д. Зербино и Л. Л. Лукасевич [13] с применением набора реагентов для определения возраста фибрина (фирма ООО «БВС», Россия). Подсчет количества тромбоцитов при морфологических исследованиях осуществляли в крупных сосудах венозного или артериального типа, в пяти полях зрения при увеличении ×1000, под масляной иммерсией микроскопа с последующим расчетом среднего количества клеток. Микрофотографию проводили при помощи микроскопа «Leica DM 750 E200» с цифровой видеокамерой «Leica EC3» («Leica Microsystems CMS GmbH», Германия). Морфометрические измерения проводили с помощью лицензионного пакета морфометрических программ «ВидиоТест — Морфология 5.2» («ВидиоТест», Россия).

Работы на животных, одобренные локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО АГМУ МЗ РФ (протокол № 12 от 12.11.2015), проводили в соответствии с Директивой 86/609/ЕЕС, Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации и «Правилами проведения работа с использованием экспериментальных животных».

Статистический анализ. Распределение признаков в выборках оценивали по критерию Шапиро — Уилка. В зависимости от распределения признаков применяли t-критерий Стьюдента, U-критерий Манна — Уитни или W-критерий Вилкоксона. Различия считали статистически значимыми при p ≤ 0,05. Обработку результатов проводили с помощью программы MedCalc Version 17.9.7 (лицензия BU556-Р12YT-BBS55-YAH5MUBE51). Данные представлены в виде медианы (Ме), 25-го и 75-го перцентилей (Ме [Q25÷Q75]).

Для оценки морфологической картины после применения средств, обладающих системным гемостатическим действием (ТК и ФМ), были исследованы срезы раневой поверхности печени, полученные сразу после спонтанной остановки раневого кровотечения.

В группе плацебо (1-я группа) в области операционной раны определялись тонкие, гладкие, розоватого цвета, блестящие тромботические массы (рис. 2 А). При морфометрии толщина наложений составляла около 66 мкм (табл. 1).

При микроскопическом исследовании тромботические образования содержали тонкие нити фибрина волокнистой структуры (показаны стрелками на рис. 2 Б), располагающиеся, главным образом, параллельно раневой поверхности, образуя редкие анастомозы, а также неизмененные эритроциты. Наблюдаемая картина позволяет отнести тромботические образования в области раны (по критериям, предложенным Д. Д. Зербино и Л. Л. Лукасевич [13]) морфологически к смешанному виду тромба (фибрино-эритроцитарному).

При подсчете тромбоцитов в просвете крупных сосудов (показаны стрелками на рис. 2 В) их количество составило около 73 клеток в поле зрения (табл. 1).

В группе животных со стимуляцией фибринолиза, получивших плацебо (2-я группа), в области травмы найдены менее заметные тромботические отложения (рис. 3 А), толщина которых составляла около 37 мкм (табл. 1). Основная часть этих отложений была представлена эритроцитами, границы между которыми определялись четко. При микроскопии раневой поверхности фибрин выглядел в виде тонких «нежных» волокон (отражено стрелками на рис. 3 Б), при этом толщина волокон фибрина уменьшилась в 1,4 раза (в сравнении с 1-й группой) (табл. 1). Найденные особенности тромботических отложений во 2-й группе позволили отнести их к тромбам эритроцитарного вида [13].

В синусоидных капиллярах в непосредственной близости от травмы были видны небольшие скопления тонких фибриновых волокон, а также единичные эритроциты с четкими границами между клетками. При подсчете тромбоцитов в просвете крупных сосудов (показаны стрелками на рис. 3 В) их количество составило 80 клеток в поле зрения (табл. 1).

В группе животных, получивших ТК (3-я группа), толщина тромботических отложений была сравнительно больше (рис. 4 А), чем в 1-й и 2-й группах (в 1,5 и 2,6 раза соответственно, табл. 1) и составила 96 мкм. Тромботическая масса была представлена преимущественно неизмененными эритроцитами с четко определяемыми границами между этими клетками (рис. 4 А). Наличие волокнистого фибрина в данных отложениях, в отличие от 1-й группы, было не характерно, определялись лишь единичные «нежные» волоконца розового цвета (показаны стрелками на рис. 4 Б). Это позволило отнести связанные с травмой тромботические массы в 3-й группе также, как и во 2-й группе, к тромбам эритроцитарного вида [13]. Отмечено и увеличение толщины фибриновых нитей — в 1,3 раза в сравнении со 2-й группой (табл. 1).

В синусоидных капиллярах в непосредственной близости от зоны травмы были видны небольшие отложения тонких «нежных» фибриновых волокон (рис. 4 Б), а также эритроцитов в виде «монетных столбиков» с четкими границами между клетками. Там же, в просветах крупных сосудов, отмечалось меньшее количество тромбоцитов (показаны стрелками на рис. 4 В) в сравнении со 2-й группой, при подсчете их количество составило 58 клеток в поле зрения (табл. 1).

У животных, получивших ФМ (4-я группа), в области травмы определялись максимально выраженные тромботические отложения в сравнении с животными в других группах наблюдений (рис. 5 А), их толщина составила 334 мкм (табл. 1). Тромботические массы состояли преимущественно как из неизмененных, так и гемолизированных и агрегированных эритроцитов, а также фибрина. Последний определялся на большинстве участков в виде скопления масс и продольно расположенных волокон розового цвета (показаны стрелками на рис. 5 Б). Отмечено также увеличение толщины фибриновых нитей в сравнении с 1-й, 2-й и 3-й группами в 1,6, 2,2 и 1,7 раза соответственно (табл. 1). Данная морфологическая картина дала возможность отнести тромботические образования в области раны в 4-й группе к тромбам фибрино-эритроцитарного (смешанного) вида [13].

В просвете крупных сосудов поблизости от зоны травмы были видны преимущественно неизмененные эритроциты. В расширенных синусоидных капиллярах отмечались скопления гемолизированных, агрегированных эритроцитов, определялись явления стаза и сладж-феномена эритроцитов, что может служить дополнительным свидетельством вовлечения этих клеток в реакции гемостаза [14],[15]. Количество тромбоцитов в просвете сосудов (показаны стрелками на рис. 5 В) было наименьшим по сравнению с другими группами наблюдений и составило 51 клетку в поле зрения (табл. 1).

Межгрупповые различия наблюдались не только по морфологической картине в области нанесения травмы, но и по показателям кровопотери, а также по особенностям гемостатического потенциала в венозной крови. Соответствующие результаты, полученные в группах наблюдений представлены в табл. 2 и 3.

Стимуляция фибринолиза стрептокиназой на фоне травмы приводила к уменьшению концентрации фибриногена (на 30,0 %) в связи с фибриногенолизом и к увеличению объема кровопотери (в 1,5 раза по сравнению с плацебо), нередко летального для выбранных животных (31,3 %) (табл. 2). Морфологическая картина в области нанесения травмы — формирование малозаметных тромботических масс, состоявших преимущественно из эритроцитов — в данном случае соответствовала значительной кровопотере.

Находилось в русле привычных представлений и то, что сочетанное применение стрептокиназыи ТК, несмотря на уменьшение концентрации фибриногена в плазме крови (на 29,6 %), сверхкомпенсированно (по объему кровопотери — с 15,4 до 1,0 % от ОЦК и по темпу кровопотери — с 20,0 до 5,3 мг/c) уменьшало посттравматическую кровопотерю. Исходя из данных морфологического исследования печени вблизи травмы последнее, по всей видимости, достигается увеличением толщины тромботических отложений по краю раны с низким содержанием фибрина и значительно большим — эритроцитов.

Новым в настоящей работе является то, что, несмотря на вызванное стрептокиназой уменьшение концентрации фибриногена на 23,3 %, использованный препарат ФМ также эффективно уменьшал как объем кровопотери — с 15,4 до 1,4 % от ОЦК, так и ее темп — с 20,0 до 5,9 мг/c. В данной группе наблюдений при микроскопии раневой поверхности определялись наиболее выраженные тромботические отложения с заметным присутствием в их составе не только эритроцитов, но и фибриновых образований.

Отмечено сопровождающее действие ТК усилению генерации тромбина в плазме крови (выявленное при анализе пика тромбина — Peak thrombin и скорости его образования — V), что не было свойственно препарату ФМ (табл. 3). Одним из последствий, связанных с использованием данного производного фибриногена, явилось значимое уменьшение количества тромбоцитов в венозной крови, а также в просветах сосудов по близости от края раны в сравнении с морфологическими данными в 3-й группе (табл. 1).

Следствием усиления/ускорения генерации тромбина в 3-й группе явилась значимо меньшая толщина фибриновых волокон в сравнении с 4-й группой. На это указывают ранее выполненные исследования in vitro, где описана обратная связь между толщиной волокон фибрина и интенсивностью образования тромбина [16],[17]. При добавлении низких концентраций тромбина к фибриногену образовывались массы, состоявшие преимущественно из толстых фибриновых волокон, увеличивавших пористость геля. Напротив, в присутствии высоких концентраций тромбина, сгустки включали в себя тонкие и короткие волокна фибрина, относительно устойчивые к фибринолизу.

Таким образом, механизмы системного гемостатического эффекта ТК и низкодозированного ФМ имеют значительные различия, несмотря на близость достигаемых гемостатических эффектов в условиях стимуляции фибринолиза.