Настоящее исследование представляет собой ретроспективный анализ случаев с диагнозом ЛХ, установленным в патологоанатомическом отделении ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России на биопсийном материале больных «НМИЦ гематологии» и на консультативном материале, присланном из других лечебных учреждений России за период 2018–2019 гг. В исследование включены 794 больных с верифицированным диагнозом ЛХ (возрастной диапазон — 18–91 год; медиана — 34 года; соотношение женщины: мужчины — 1: 1,1). В биопсийном материале на основании гистологического и иммуногистохимического (ИГХ) исследований в соответствии с критериями классификации ВОЗ [11] были определены варианты ЛХ и иммунофенотип опухолевых клеток. Выявление экспрессии ВЭБ выполняли с помощью ИГХ метода с целью выявления II и III типов латентности — антител к латентному мембранному протеину ВЭБ (клон LMP1, цитоплазматическая экспрессия), и методом хромогенной in situ гибридизации с зондами к малым РНК EBV (EBER — Epstein — Barr virus-encoded small RNAs) для определения всех типов латентности (ядерная реакция).

ИГХ исследования. С парафиновых блоков с помощью микротома выполняли срезы толщиной 3 мкм и монтировали на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином. Стекла высушивали при температуре 37 °C в течение 12 ч и перед нанесением антител при температуре 60 °C в течение 1 ч. Высушенные на воздухе срезы маркировали в зависимости от поставленных задач. Окрашивание проводили по стандартному протоколу «IHC protocol F» с использованием готовой системы детекции, имеющей высокую степень усиления сигнала без биотина. Титр исследуемых антител и необходимый буфер для демаскировки определяли опытным путем индивидуально для каждого антитела. Все этапы окрашивания проводили автоматически. Перед заключением под покровное стекло проводили дегидратацию срезов с помощью этанола, для осветления среза использовали ксилол. В качестве заключающей среды использовали среду для заключения Surgipath Sub-X Leica.

При проведении вирусологического исследования определяли серологические маркеры ВЭБ, цитомегаловируса (ЦМВ) и вируса простого герпеса 1-го и 2-го типов (ВПГ-1, ВПГ-2). Методом твердофазного непрямого иммуноферментного анализа выполняли исследование сыворотки крови больных на наличие IgM к ЦМВ (IgM ЦМВ), ВПГ 1-го, 2-го типов (IgM ВПГ-1, IgM ВПГ-2) и вирусному капсидному антигену ВЭБ (IgM VCA ВЭБ), а также оценивали титр антител IgG к ЦМВ (IgG ЦМВ), IgG к ВПГ-1, ВПГ-2 (IgG ВПГ-1, IgG ВПГ-2), IgG к раннему антигену ВЭБ (IgG EA ВЭБ) и количество IgG к ядерному антигену 1-го типа ВЭБ (IgG EBNA-1 ВЭБ). Титр специфических противовирусных IgG, соответствующий разведению 1: 3200 и выше, был определен как превышающий нормальные значения. Концентрация IgG EBNA-1 ВЭБ более 60 усл. ед. была определена как высокая [19].

Статистический анализ. Обработка результатов проведена с помощью программы Statistica 12. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.

За 2018–2019 гг. из 794 случаев с установленным диагнозом ЛХ на долю кЛХ пришлось 725 (91 %) случаев, на долю НЛХЛП — 69 (9 %) случаев. Больные с установленным диагнозом НЛХЛП находились в возрастном диапазоне от 22 до 91 года (медиана — 45 лет), отмечено преобладание мужского пола (соотношение мужчины: женщины — 2: 1). Среди локализаций взятия биопсийного материала с установленным диагнозом НЛХЛП встречались: лимфатические узлы, костный мозг, селезенка, печень, паравертебральные мягкие ткани, кости. У 7 (10 %) из 69 больных на момент диагностики НЛХЛП отмечались участки диффузной В-крупноклеточной лимфомы. Структура кЛХ у 725 больных представлена на рисунке 1, демографические характеристики больных различными гистологическими вариантами кЛХ — в таблице 1.

ВЭБ-позитивная ЛХ была в 82 (11 %) из 725 случаев кЛХ, возрастной диапазон составил 18–81 год (медиана — 45 лет), в 2,5 раза чаще заболевание было диагностировано у мужчин, из них 11 (13 %) из 82 больных были ВИЧ-позитивны. Наибольшая частота ВЭБпозитивных случаев наблюдалась при смешанно-клеточном варианте — у 23 (82 %) из 28 больных. ВЭБпозитивными оказались 4 (33 %) из 12 наблюдений кЛХ, богатой лимфоцитами, 57 (12 %) из 479 случаев нодулярного склероза 1-го типа и 15 (9 %) из 171 случая нодулярного склероза 2-го типа. Все случаи НЛХЛП были ВЭБ-негативными. У 7 из 82 больных ВЭБ-позитивной кЛХ на этапе диагностики было выполнено серологическое исследование крови на наличие антител к герпесвирусам. У 6 из 7 обследованных больных был повышен титр антител класса IgG к ядерному антигену ВЭБ (> 40 у. е.), и во всех 7 случаях был повышен титр антител класса IgG к герпесвирусам 1-го и 2-го типов (табл. 2).

При сравнении экспрессии вариабельных маркеров при кЛХ экспрессия CD20 значимо чаще отмечалась при нодулярном склерозе 2-го типа (NS2) по сравнению с 1-м типом (NS1) (p = 0,0071), что следует учитывать при дифференциальной диагностике с группой В-клеточных крупноклеточных лимфом (табл. 3).

В классификации ВОЗ [10],[20] отмечено наличие «перекрестных» признаков кЛХ, богатой лимфоцитами, с НЛХЛП. Не все случаи кЛХ, богатой лимфоцитами, в равной мере обладают этими «перекрестными» признаками. Богатая лимфоцитами кЛХ была установлена только у 14 (2 %) из 725 больных, из них у 4 (29 %) из 11 больных были отмечены транзиторные («перекрестные») гистологические и иммунофенотипические признаки с НЛХЛП. Группа кЛХ, богатой лимфоцитами, с наличием «перекрестных» признаков с НЛХЛП, статистически достоверно отличалась по выраженности В-зон в виде крупных нодулей (р = 0,0157) и по экспрессии опухолевыми клетками CD20 (p = 0,0404) (табл. 4).

Приводим два собственных наблюдения ВЭБ-ассоциированной ЛХ с лимфоидным преобладанием.

Больная С., 47 лет, имелись В-симптомы и периферическая лимфаденопатия. По данным ультразвукового исследования размер шейных и надключичных лимфатических узлов составил 1,1–1,7 см, аксиллярных — 7,5 см, подвздошных — 2,3 см, паховых — 2,0 см, размеры селезенки — 17,1 × 8,3 см, структура селезенки была гомогенная. Сопутствующее заболевание — рак щитовидной железы. Выполнена биопсия аксиллярных лимфатических узлов, удален конгломерат общими размерами 7,5 × 4,6 × 1,6 см, на разрезах серовато-белесоватого цвета, крупнодольчатого вида. При гистологическом исследовании: гистоархитектоника ткани лимфатического узла нарушена, что обусловлено наличием крупных нодулеподобных структур без признаков кольцевидного фиброза. Интра- и экстранодулярно среди мелких лимфоидных клеток и отдельных эпителиоидных гистиоцитов определялись разрозненно расположенные крупные клетки с морфологией клеток Ходжкина и LP-клеток (рис. 2 А, Б).

При ИГХ крупные опухолевые клетки экспрессировали CD20, Oct-2 (гиперэкспрессия), PAX5, BОB.1, CD30, MUM.1, Fascin, CD45 (слабо), а также были позитивны при реакции in situ гибридизации с зондами к малым молекулам РНК ВЭБ. В основе нодулеподобных структур при реакции с антителами к CD23 визуализировалась сеть фолликулярных дендритных клеток с участками дезорганизации. Реакция с антителами к CD15 в опухолевых клетках была негативна (рис. 3 А–К).

С учетом особенностей иммуногистоархитектоники, иммунофенотипа опухолевых клеток и экспрессии ВЭБ опухолевый субстрат был отнесен к кЛХ, богатой лимфоцитами, ВЭБ+, занимающей промежуточное положение между нодулярной ЛХ с лимфоидным преобладанием, и кЛХ ВЭБ+. Учитывая развитие у больной одновременно двух заболеваний (рака щитовидной железы и ЛХ), ей была выполнена тиреоидэктомия, в последующем проведены гормонотерапия и 6 курсов химиотерапии по программе BEACOPP-14. Достигнута полная ремиссия обоих заболеваний, которая сохраняется в течение 18 мес.

Больной Б., 32 года, отмечались В-симптомы, лимфаденопатия всех групп лимфатических узлов брюшной полости, забрюшинного пространства, малого таза (максимально до 53 × 30 × 38 мм — конгломерат левых поясничных лимфатических узлов). Заболевание манифестировало в 2016 г. с болей в поясничной области. Выполнена биопсия забрюшинного лимфатического узла, удален конгломерат общими размерами 35 × 20 × 15 мм, на разрезах серовато-белесоватого цвета, однородного вида. При гистологическом исследовании: срезы ткани лимфатического узла с утолщенной капсулой, фиброзными прослойками, многочисленными гранулемоподобными скоплениями из кластеров эпителиоидных гистиоцитов с формированием небольших нодулеподобных структур из мелких лимфоидных клеток, зрелых плазматических клеток и разрозненно расположенных крупных клеток Рид — Березовского — Штернберга, клеток Ходжкина, клеток со светлыми многолопастными ядрами с морфологией LP-клеток, отдельных мумифицированных форм. В части нодулеподобных структур определялись лимфоидные фолликулы с неширокими центрами размножения (рис. 4 А–В).

При иммуногистохимическом исследовании крупные опухолевые клетки экспрессировали CD20 (мономорфная мембранная реакция практически во всех крупных клетках), CD19 (мономорфная мембранная реакция), CD79a (слабая мембранная/цитоплазматическая реакция в небольшой части крупных опухолевых клеток), CD30 (мембранная, цитоплазматическая, dot-like реакция); отмечалась экспрессия В-клеточных транскрипционных факторов: PAX5 (умеренная ядерная экспрессия по сравнению с мелкими В-клетками резидуальных фолликулов), Oct-2 (ядерная гиперэкспрессия по сравнению с мелкими В-клетками резидуальных фолликулов), BОB.1 (интенсивная ядерная реакция). Крупные опухолевые клетки были позитивны при реакции с антителами к ВЭБ (LMP1, цитоплазматическая экспрессия). Иммуногистоархитектоника и иммунофенотип опухолевых клеток представлены на рисунке 5 (А–З).

С учетом особенностей иммуногистоархитектоники, иммунофенотипа опухолевых клеток и экспрессии ВЭБ опухолевый субстрат был квалифицирован как кЛХ, богатая лимфоцитами, ВЭБ+, с морфологическими и иммунофенотипическими признаками, занимающими промежуточное положение между нодулярной ЛХ с лимфоидным преобладанием и кЛХ.

ВЭБ может играть прямую или косвенную роль в патогенезе ЛХ путем запуска патогенного механизма, или являться отражением унаследованной или приобретенной иммунной дисрегуляции, которая опосредует как развитие злокачественного новообразования, так и реактивацию ВЭБ [21]. У 6 обследованных больных с повышенными титрами антител к ядерному антигену ВЭБ отмечалось повышение титра антител класса IgG к герпесвирусам 1-го и 2-го типов, у двух из этих больных были также повышены антитела класса IgG к цитомегаловирусу. Таким образом, повышение содержания всех герпесвирусных антител, а не избирательное повышение содержания антител к ВЭБ, свидетельствует в пользу нарушения баланса иммунорегуляции, а не специфического заболевания [22].

Жизненный цикл ВЭБ является двухфазным, с фазами литической репликации и латентности. Латентность ВЭБ в B-клетках обычно прогрессирует от III типа к I типу [23]. При заражении покоящихся наивных В-клеток ВЭБ входит в латентность III типа (экспрессируются все гены латентности, в том числе EBNA-2), генерируя высокоиммуногенные вирусные белки, которые запускают сильную цитотоксическую реакцию Т-клеток. Латентность III типа также встречается у больных с тяжелой иммуносупрессией. В дальнейшем вирус ограничивает экспрессию своих генов и вступает в латентность II типа с экспрессией ядерного антигенаВЭБ (EBNA-1), латентных мембранных белков (LMP-1 и LMP-2). Во время латентности II типа B-клетки дифференцируются в B-клетки памяти. Реактивация вируса происходит из-за миграции пораженных ВЭБ B-клеток памяти в лимфоидную ткань [23]. ВЭБ еще больше ограничивает экспрессию генов и входит в латентность I типа, при которой экспрессируются только малые РНК, кодируемые EBNA-1 и EBV (EBER). EBNA-1 экспрессируется во всех инфицированных вирусом клетках и отвечает за поддержание и репликацию эписомального генома ВЭБ [24].

EBNA-2 и LMP-1 являются основными трансформирующими белками ВЭБ. LMP-1 индуцирует молекулы клеточной адгезии, активирует антиапоптотические белки (BCL2, A20), может имитировать CD40 и через белки TRADD и TRAF запускает сигнальный путь NF-B для стимуляции пролиферации клеток [25]. Аналогично, EBNA-2 играет критическую роль в иммортализации клеток за счет усиления экспрессии каскада генов сигнального пути NOTCH [26].

ВЭБ-позитивный статус оказывает влияние на состав Т-клеточной популяции реактивного микроокружения при кЛХ. Микроокружение опухоли ВЭБассоциированной кЛХ характеризуется значительно более высоким числом CD68+, CD163+ макрофагов, чем в ВЭБ-негативной кЛХ [27]. В зависимости от наличия различных сигналов микроокружения макрофаги могут подвергаться поляризации в отношении двух функциональных состояний: макрофаги фенотипа М1 характеризуются активной выработкой провоспалительных цитокинов и цитотоксических молекул и участвуют в реализации Т-хелперных иммунных реакций 1-го типа (Th1). Для макрофагов фенотипа М2 характерна высокая фагоцитарная активность, они участвуют в Т-хелперных иммунных реакциях 2-го типа (Th2), а также стимулируют процессы пролиферации и ангиогенеза [28],[29]. В составе реактивного микроокружения ВЭБ-позитивной кЛХ преобладают макрофаги с фенотипом М1, а ВЭБ-негативной кЛХ — макрофаги с фенотипом М2 [30].

Прогностическое значение ВЭБ при ЛХ дискутабельно. Два крупных исследования 1997 г. и 1998 г., посвященных изучению влияния ВЭБ на течение ЛХ, выявили лучшие показатели общей выживаемости и достижения полной ремиссии для ВЭБ-положительных случаев по сравнению с ВЭБ-негативной ЛХ [31],[32]. Это несколько удивительно, если учесть, что онкогенный белок LMP-1 высоко экспрессируется в ВЭБ-позитивных клетках Рид — Березовского — Штернберга. Возможно, это связано с тем, что злокачественные клетки ВЭБпозитивной ЛХ более чувствительны к химиотерапевтическим агентам, или ВЭБ-позитивные клетки могут являться мишенью для иммунного цитолиза, особенно после циторедуктивной химиотерапии. Сообщаемая более высокая экспрессия BCL2 при ВЭБ-негативной ЛХ может свидетельствовать о большей устойчивости к апоптозу, индуцированному химиотерапией, в ВЭБ-негативных случаях [33]. Однако по более современным публикациям создается впечатление о негативномвлиянииВЭБна общую выживаемость при ЛХ, что продемонстрировала в своем исследовании группа исследователей из Туниса, которые выявили худшую общую выживаемость ВЭБ-позитивной ЛХ у больных с ранними стадиями заболевания [34].

ВЭБ-позитивная кЛХ, по данным настоящего исследования, составила 11 % от всехслучаевкЛХ. Наиболее часто ВЭБ-позитивными являлись случаи смешанноклеточного варианта кЛХ — 82 %, что соотносится с литературными данными [35],[36]. На втором месте оказалась кЛХ, богатая лимфоцитами, — 33 % случаев кЛХ. Ввиду наличия «перекрестных» морфологических и иммунофенотипических признаков с НЛХЛП [20], экспрессия ВЭБ имеет важное значение в дифференциальной диагностике данных вариантов.

При кЛХ, богатой лимфоцитами, чаще, чем при других подтипах кЛХ, отмечается экспрессия В-клеточных транскрипционных факторов: Oct-1, Oct-2, BOB.1 и BCL6, также в половине случаев отмечается наличие реактивного микроокружения с иммунофенотипом фолликулярных Т-клетокхелперов (Тfh), что делает данный подтип сходным с НЛХЛП. Экспрессия маркеров CD30, CD15, а также маркеров сигнального пути NFkB (REL-B, C-REL, TRAF1, p-50, и MUM.1) сопоставима с кЛХ. Иммунофенотип опухолевых клеток и реактивного микроокружения наиболее соответствует иммунофенотипу неопухолевого аналога — В-клетки позднего этапа герминальной дифференцировки с экспрессией поверхностных маркеров фолликулярной дифференцировки, В-клеточных транскрипционных факторов, активационного антигена CD30 с Tfh реактивным микроокружением [9].

Патоморфологическая диагностика кЛХ, богатой лимфоцитами, сложна ввиду редкости данной нозологическойформы и наличия общих черт с НЛХЛП. Для кЛХ, богатой лимфоцитами, характерен нодулярный характер роста, диффузный рост встречается редко. Нодули небольших размеров, представлены резидуальными лимфоидными фолликулами с резко расширенной зоной мантии, в которой неравномерно разрозненно расположены немногочисленные крупные клетки с морфологией LP-клеток, отдельные — с морфологией клеток Ходжкина и клеток Рид — Березовского — Штернберга [10],[37]. В части фолликулоподобных структур можно обнаружить резидуальные центры размножения, которые, как правило, смещены относительно центра фолликула, но не замещены опухолевыми клетками в отличие от НЛХЛП.

Важным фактором в диагностике кЛХ, богатой лимфоцитами, является иммуногистоархитектоника крупных опухолевых клеток и В-клеточного микроокружения при реакции с антителами к CD20 с визуализацией крупных опухолевых клеток, расположенных в расширенной зоне мантии, что сопоставимо с реакцией с антителами к CD30 (позитивны крупные опухолевые клетки) и к IgD (позитивна расширенная зона мантии в нодулярных структурах). Дифференциальная диагностика данного варианта кЛХ проводится не только с другими вариантами ЛХ, но и с мелкоклеточными В-клеточными лимфомами с нодулярным ростом.

В настоящее время известно, что клетки Ходжкина являются клональными В-клетками с экспрессией CD30 и PAX5, однако классический В-клеточный маркер CD20 экспрессируется только в 20–33 % случаев, а экспрессия другого В-клеточного маркера CD79a отмечается в 8–10 % случаев [38],[39]. Интерпретация позитивного окрашивания опухолевых клеток при кЛХ при реакции с антителами к CD20 зависит от выбранного порогового значения экспрессии. По данным ряда авторов, пороговое значение экспрессии CD20 при кЛХ варьирует от 5 до 50 % позитивных опухолевых клеток [39],[40],[41]. При кЛХ экспрессия CD20 является гетерогенной — частичное окрашивание клеточной мембраны часто слабее, чем в нормальных реактивных В-клетках, и, в основном, наблюдается только в части опухолевых клеток, в отличие от НЛХЛП, при которой опухолевые клетки интенсивно мономорфно экспрессируют CD20. В отличие от НЛХЛП экспрессия CD45, как правило, отсутствует при кЛХ [37].

При оценке экспрессии В-клеточных маркеров в опухолевых клетках необходимо учитывать их интенсивность и наличие градиента экспрессии В-клеточных транскрипционных факторов. Градиент экспрессии PAX5 (слабая ядерная экспрессия в крупных опухолевых клетках по сравнению с интенсивной экспрессией в мелких В-клетках реактивного микроокружения) является важным диагностическим признаком кЛХ.

Особенностью первого представленного клинического наблюдения явилась морфология НЛХЛП с сохранной В-клеточной транскрипционной программой в крупных опухолевых клетках. Однако с учетом наличия интенсивной экспрессии CD30 и позитивной реакции EBER в крупных опухолевых клетках мы отнесли данный случай к кЛХ, богатой лимфоцитами, ВЭБ+, с «перекрестными» признаками с НЛХЛП.

Особенностью второго представленного клинического случая явился «перекрест» морфологической картины, характерной для кЛХ, богатой лимфоцитами, наличие экспрессии ВЭБ и сохранного В-клеточного иммунофенотипа крупных опухолевых клеток (интенсивная экспрессия CD20, CD19, CD79a, транскрипционных факторов В-клеточной дифференцировки: PAX5, BOB.1, гиперэкспрессия Oct-2), что послужило основанием для отнесения данного субстрата к кЛХ, богатой лимфоцитами, ВЭБ+, с «перекрестными» признаками с НЛХЛП.

Таким образом, доля ВЭБ-позитивных случаев кЛХ варьирует в зависимости от иммунокомпетентного статуса хозяина и гистологического варианта. ЛХ с лимфоидным преобладанием включает в себя кЛХ, богатую лимфоцитами, НЛХЛП и транзиторную форму, сочетающую в себе признаки обеих нозологий, для дифференциальной диагностики которых требуется проведение расширенного ИГХ исследования. Экспрессия ВЭБ опухолевыми клетками при ЛХ с лимфоидным преобладанием свидетельствует в пользу кЛХ, богатой лимфоцитами, с транзиторными признаками с НЛХЛП. Дальнейшее изучение патогенетической роли ВЭБ при ЛХ необходимо для разработки терапевтических подходов с использованием таргетной терапии.