Исследование минимальной остаточной болезни (МОБ) при острых лейкозах широко применяется в клинической практике. Наличие МОБ на определенных этапах терапии является прогностическим фактором и ассоциировано с высоким риском развития рецидива [1]. Исследование МОБ позволяет проводить стратификацию больных на группы риска и изменять терапию. Кроме того, эффективность новых препаратов, например моноклональных антител, в настоящее время оценивается с помощью исследования МОБ в рамках клинических испытаний. Таким образом, измерение МОБ является суррогатной конечной точкой и позволяет сократить период наблюдения [2],[3].

Методы исследования МОБ должны быть чувствительными, точными, надежными, быстрыми и доступными. В настоящее время широко применяются два метода — полимеразная цепная реакция (ПЦР) и многоцветная проточная цитометрия (МПЦ).

Цель настоящей работы — охарактеризовать основные технологии обнаружения остаточных опухолевых клеток при острых лейкозах.

Количественная ПЦР в реальном времени с подбором клоно-специфичных (пациент-специфичных) праймеров к реаранжировкам генов иммуноглобулина и/или Т-клеточного рецептора. При дифференцировке Т- и В-клеток происходит перестройка (или реаранжировка) генов Т-клеточного рецептора (ТКР) и иммуноглобулина (ИГ). Каждая зрелая В- или Т-клетка имеет собственный уникальный реаранжированный ген ИГ или ТКР, соответственно. При лимфоидных новообразованиях обнаруживается опухолевый клон лимфоцитов (или лимфоидных предшественников), и все клетки этого клона имеют одинаковый ген ИГ или ТКР. Этот клон может быть обнаружен методом ПЦР с фрагментным анализом ПЦР-продуктов. В норме, если клетки поликлональны по ИГ и ТКР, все ПЦР-продукты будут различаться по нуклеотидному составу и длине. При обнаружении клона (при лимфоидных новообразованиях, в том числе ОЛЛ) будет доминировать определенный ПЦР-продукт.

Более 90 % В-клеточных ОЛЛ имеют клональные реаранжировки генов ТКР, и около 30 % Т-клеточных ОЛЛ имеют клональные реаранжировки генов ИГ [4]. Клональные реаранжировки генов ИГ либо ТКР выявляют суммарно у 98 % больныхВ-ОЛЛ и у 95 % больных T-ОЛЛ [5]. При ОЛЛ это объясняется повышенной и сохраняющейся активностью рекомбинантного комплекса в клетках-предшественницах. При ОЛЛ само по себе выявление Т- или В-клеточной клональности не является критерием для установления диагноза или определения прогноза заболевания и не позволяет судить о линейной принадлежности опухоли, а также не является способом определения МОБ, так как чувствительность этого метода близка к чувствительности морфологического метода. Определение клональности при ОЛЛ до начала лечения является необходимым, поскольку позволяет определить опухоль-специфичные (пациент-специфичные) мишени и контролировать МОБ на протяжении всех этапов терапии [6]. Оценка МОБ при ОЛЛ при помощи подбора пациент-специфичных праймеров состоит из следующих этапов:

1. Определение Т- и В-клеточной клональности по генам дельта-, гамма-, бета-цепей ТКР, перестроек тяжелой и легкой цепи ИГ в дебюте заболевания. Определение нуклеотидной последовательности клональных продуктов. Подбор и тестирование пациентспецифичных праймеров. 2. Исследование костного мозга (КМ) в контрольных точках в зависимости от протокола лечения с подобранными пациент-специфичными праймерами [6],[7].

Таким образом, без исследования КМ в дебюте ОЛЛ оценка МОБ в контрольных точках невозможна.

Поскольку для каждого больного и для каждой клональной реаранжировки подбирается индивидуальный праймер, то условия ПЦР реакции и чувствительность метода будут различными [6],[7].

Для оценки МОБ и определения чувствительности метода проводят построение стандартной (калибровочной) кривой с известным количеством опухолевой ДНК. Для этого моноклональную опухолевую ДНК больного, полученную в дебюте заболевания, разводят в поликлональной смеси ДНК, выделенной из мононуклеарных клеток периферической крови как минимум 6 здоровых доноров. Определение МОБ с подбором пациент-специфичных праймеров является количественным методом и имеет подсчетную чувствительность, в пределах которой может быть определено точное количество опухолевых клеток по отношению к нормальным клеткам, и общую чувствительность, которая не позволяет определить количество, но позволяет определить наличие опухолевых клеток, в том случае если их количество выходит за пределы подсчетной чувствительности [6],[7].

Рассмотрим, что означают данные ответы на конкретном примере (рис. 1). После построения стандартной (калибровочной) кривой у больного К., страдающего В-ОЛЛ, определена подсчетная чувствительность равная 10–3. Это означает, что после начала лечения определить точное количество опухолевых клеток будет возможно, только если в образце их будет более одной опухолевой клетки на 1000 нормальных клеток. У данного больного на 36-й день терапии (рис. 1) по протоколу «ОЛЛ-2009» (NCT01193933) [8] определялось большое количество опухолевых клеток – 2,8 × 10–2. Также у метода определена общая чувствительность равная 10–4, это означает, что если в образце после лечения опухолевых клеток меньше, чем количество, определенное подсчетной чувствительностью (в данном случае 10–3), но больше чем 1 клетка на 10 000 нормальных, то можно сделать вывод о наличии опухолевых клеток. Однако подсчитать их количество невозможно. На 70-й день от начала терапии у больного К. количество опухолевых клеток в образце было меньше подсчетной чувствительности, но больше общей чувствительности, то есть МОБ определялась без подсчета количества опухолевых клеток (рис. 1).

Клональный состав опухолевой популяции нестабилен и клональные реаранжировки могут меняться с течением заболевания, что усложняет процесс контроля МОБ по установленным в дебюте заболевания мишеням. У части больных это может приводить к ложноотрицательным результатам [4],[9]. Однако речь идет именно о частичной смене клональных реаранжировок, и использование нескольких клональных мишеней в процессе контроля МОБ позволяет избежать такой проблемы.

Анализ транскриптов химерных генов методом количественной ПЦР с реакцией обратной транскрипции. При переносе генетического материала с одной хромосомы на другую происходит образование химерного гена. Ген транскрибируется с образованием матричной РНК (мРНК), с которой транслируется аномальный белок. Некоторые хромосомные транслокации специфичны для лейкозов определенного типа и имеют прогностическую значимость, поэтому их определяют до проведения терапии в дебюте заболевания, что можно использовать для проведения мониторинга МОБ. Анализ транскриптов химерных генов при помощи ПЦР является простым и недорогим методом, обладающим высокой чувствительностью, однако этот метод имеет существенное ограничение ввиду того, что слитные гены у больных ОЛЛ встречаются нечасто [10],[11]. Суммарная частота t(9;22)/bcr-abl, t(1;19)/E2A-PBX1, t(4;11)/MLL-AF4, t(12;21)/ETV6-RUNX1 (TEL-AML1) при В-ОЛЛ составляет 40–45 %. Химерные транскрипты с участием гена MLL возникают в результате реаранжировок 11q23, обнаруживаются и при ОЛЛ, и при ОМЛ и ассоциированы с неблагоприятным прогнозом. Детекция МОБ с помощью этих транскриптов представляется трудной задачей, так как химерные гены KMT2A (MLL) могут возникать вследствие 50 различных транслокаций [12].

Контроль МОБ при ОЛЛ при помощи оценки экспрессии химерного гена проводится методом количественной ПЦР в реальном времени с предварительным проведением реакции обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) [13]. В случае ОТ-ПЦР химерных транскриптов для получения количественного значения МОБ в контрольных точках используют стандарты или калибраторы с известным числом молекул [10]. Возможно также использование подхода, в котором количественную оценку транскрипта оценивают по отношению к экспрессии гена «домашнего хозяйства» [13]. Гены «домашнего хозяйства» — гены, необходимые для поддержания важнейших жизненных функций организма, которые экспрессируются практически во всех тканях и клетках на относительно постоянном уровне.

На практике широко проводится мониторинг МОБ по анализу транскрипта химерного гена BCR-ABL. Этот аномальный ген образуется в результате реципрокной транслокации t(9;22), которая также называется филадельфийской хромосомой (или Ph-хромосомой, где Ph — сокращение от англ. «Philadelphia chromosome», филадельфийская хромосома). Установлено, что разрывы гена ABL при данной транслокации происходят всегда в одном месте, а разрывы гена BCR могут возникнуть в разных участках. В зависимости от места разрыва возможно образование нескольких типов транскрипта (р190, р210 и р230). Разные по длине BCR-варианты белка BCR-ABL характерны для разных заболеваний: р210 (реже р230) чаще обнаруживаются при хроническом миелолейкозе (ХМЛ), а р190 — при В-клеточном ОЛЛ с Ph-хромосомой (Ph-позитивном ОЛЛ). Однако при Ph-позитивном ОЛЛ все-таки может выявляться вариант р210 или встречаться одновременно р190 и р210. Поэтому в дебюте заболевания необходимо установить тип транскрипта, а затем отслеживать его количество методом ОТ-ПЦР в контрольных точках. Такой способ мониторинга МОБ предусмотрен в протоколе лечения Ph-позитивных ОЛЛ взрослых «Ph+ ALL-2012m» [14].

У больных ОМЛ контроль МОБ молекулярно-генетическим методом представляется сложной задачей, так как нет унифицированных маркеров. Некоторые генетические мутации и транскрипты слитных генов могут быть использованы для определения прогноза заболевания и мониторинга МОБ [15]. Примером варианта ОМЛ, при котором мониторинг МОБ успешно осуществляется по анализу химерного транскрипта, является острый промиелоцитарный лейкоз (ОПЛ). Для ОПЛ характерна транслокация (15;17), которая приводит к образованию химерного гена PML-RAR [16]. В российском протоколе терапии ОПЛ по модифицированной программе AIDA (mAIDA) предусмотрен постоянный мониторинг МОБ по оценке экспрессии PML-RAR для своевременного изменения терапевтического воздействия в случае развития молекулярного рецидива. МОБ у больных ОПЛ другими методами (в т. ч. МПЦ) не проводят [14].

У больных ОМЛ наиболее часто встречаемыми хромосомными реаранжировками являются t(8;21) и inv(16)/t(16;16), которые ведут к появлению химерных генов RUNX1-RUNX1T1(AML1-ETO) и CBFβ-MYH11 соответственно. Частота их обнаружения составляет 15–45 %, и все они ассоциированы с благоприятным прогнозом [17]. Молекулярные исследования по мониторингу МОБ с использованием в качестве мишеней RUNX1-RUNX1T1 и CBFβ-MYH11 немногочисленны и включают относительно малое число больных. Эти исследования показали, что более высокие уровни химерных транскриптов ассоциированы с более короткой безрецидивной выживаемостью [18]. В работе J. Ouyang и соавт. [18] у больных с количеством химерных транскриптов RUNX1-RUNX1T1 или CBFβ-MYH11  0,1 % рецидивов не было, с количеством 0,1–10 % рецидив развился у 30 % больных, с количеством  10 % рецидив развился у 50 % больных.

Наиболее известным и изученным белком с мутациями в его гене, который ассоциирован с ОМЛ, является рецепторная тирозинкиназа 3 (FLT3). Этот белок имеет функцию внутриклеточной тирозинкиназы и участвует в росте и дифференцировке стволовых клеток [19]. В 30 % случаев ОМЛ обнаруживаются мутации гена FLT3. Существует несколько мутаций данного гена, наиболее часто обнаруживаются внутренние тандемные дупликации (FLT3-internal tandem duplication (ITD)), которые ассоциированы с неблагоприятным прогнозом. У больных с выявленной мутацией FLT3 определяется нормальный кариотип, однако иногда определяется сочетание FLT3 и t(6;9)(p23;q34), а также t(15,17)(q22; q12). Мутации в киназном домене FLT3 (FLT3/TKD) встречаются у больных с нормальным кариотипом в 6–7 % случаев, однако прогностическая роль на долгосрочные результаты терапии этих мутаций не доказана [20]. Ограничением применения мутации гена FLT3 в качестве мишени для мониторинга МОБ является ее нестабильность при проведении терапии: мутации могут меняться или исчезать [21].

В сравнении с мутациями гена FLT3, мутации NPM1- гена более стабильны. Встречаются примерно у 30 % больных ОМЛ с аномальным кариотипом и у 50 % больных ОМЛ с нормальным кариотипом. Ген NPM1 располагается на 5-й хромосоме и кодирует фосфопротеин, который участвует в поддержке стабильности генома, образовании рибосом, регуляции транскрипции и опухолевой супрессии [22]. В исследованиях, в которых использовали в качестве мишени мутации гена NPM1 для мониторинга МОБ, установили прогностическую значимость этого маркера [23].

На этапе диагностики исследование мутаций проводится при помощи фрагментного анализа с капиллярным электрофорезом. Если в образце менее 10 % опухолевых клеток с одной из данных мутаций, результат будет отрицательным. Мутантный аллель NPM1 больше «дикого» аллеля на 4 пары нуклеотидов и легко выявляется при проведении капиллярного электрофореза [24].

Альтернативной мишенью для молекулярного мониторинга МОБ при ОМЛ является исследование гиперэкспрессирующихся генов, таких как WT1, EVI1 и PRAME. Эти гены экспрессируются в низких количествах в нормальных гемопоэтических клетках [25]. Ограничением исследования генов WT1 и PRAME является то, что в нормальных регенерирующих клетках КМ они также могут быть гиперэкспрессированы, что приводит к ложноположительным результатам. Однако в случаях, когда на фоне постоянной экспрессии WT1 в периоде ремиссии его экспрессия повышается, можно заподозрить надвигающееся развитие рецидива [26],[27].

Согласно рекомендациям Европейской рабочей группы по острым лейкозам [28], определение минимальной остаточной болезни с помощью ПЦР следует проводить, если имеются мутации NPM1, RUNX1-RUNX1T1, CBFB-MYH11. Выявление мутаций FLT3 и экспрессии EVI1 не должно использоваться в качестве одиночных маркеров МОБ. Однако их обнаружение может быть полезным при использовании их в сочетании с основным маркером МОБ. Экспрессия WT1 может быть оценена, если у больного нет других индикаторов МОБ. Оценивать МОБ методом ПЦР в периферической крови и КМ рекомендуется перед лечением, после 2 циклов индукции/консолидации и при окончании терапии, а также каждые 3 мес. в течение 2 лет после окончания терапии в КМ или крови (или каждые 4–6 нед. в периферической крови) [28]. В этих рекомендациях также определяются условия молекулярной прогрессии и молекулярного рецидива. Молекулярная прогрессия — это увеличение количества копий МОБ ⩾ 1 lg между любыми двумя положительными образцами у больного с молекулярной персистенцией МОБ. Молекулярный рецидив — это увеличение значения МОБ ⩾ 1 lg между двумя положительными образцами у больного, у которого ранее был негативный МОБстатус. Преобразование отрицательного в положительное значение МОБ должно быть подтверждено при повторном исследовании через 4 нед. после первого положительного результата анализа. Если МОБ увеличивается в последующих точках исследования ⩾ 1 lg, то диагностируют молекулярный рецидив [28].

Исследование химерных транскриптов (РНК) методом ОТ-ПЦР позволяет достичь чувствительность, превосходящую метод МПЦ, но имеет несколько недостатков. РНК склонна к деградации, а ее эффективность конверсии в комплементарную ДНК варьирует. Кроме того, количество РНК в лейкемических клетках также различно и нестабильно в ходе терапии. Все это ведет к тому, что МОБ, оцененная на основе РНК, лишь в ограниченной степени сопоставима между разными больными [29].

Детекция МОБ методом МПЦ основана на выявлении лейкоз-ассоциированного иммунофенотипа (ЛАИФ). ЛАИФ—это сочетание антигенов, характерное для опухолевых клеток и не обнаруживающееся (или обнаруживающееся в небольшом количестве) на нормальных гемопоэтических клетках. Проявлением ЛАИФ может быть наличие экспрессии миелоидных маркеров на клетках лимфоидного происхождения (например, экспрессия CD33 при В-ОЛЛ), повышенная экспрессия антигенов (например, CD7 при Т-ОЛЛ или CD10 при В-ОЛЛ), сниженная экспрессия антигенов (например, CD38 при В-ОЛЛ), а также эктопическая экспрессия (появление в КМ клеток с фенотипом, встречающимся в норме в других органах и тканях, например наличие в КМ клеток сфенотипом Т-линейных предшественников [30]). Повышение или снижение экспрессии антигенов на опухолевых лимфобластах оценивается по сравнению со здоровыми аналогами гемопоэтических предшественников.

Поиск МОБ методом МПЦ может быть выполнен на основе двух методических подходов [31]. Первый подход подразумевает поиск ЛАИФ на лейкемических клетках в дебюте заболевания. По данным исследования в дебюте заболевания подбирают панель моноклональных антител, которую затем используют для мониторинга МОБ при проведении терапии. У каждого больного она может быть различной. Второй подход требует наличия сведений о нормальном иммунофенотипе зрелых клеток и их предшественников, а поиск МОБ сводится к поиску клеток с иммунофенотипом, отличным от нормального. В этом случае сведения об иммунофенотипе бластных клеток в дебюте заболевания не обязательны, и во всех контрольных точках применяют одну универсальную и широкую панель моноклональных антител, которая позволяет обнаружить опухолевые клетки определенной линейности. То есть для детекции МОБ у больных В-ОЛЛ, Т-ОЛЛ и ОМЛ применяют абсолютно разные сочетания моноклональных антител. В настоящее время рекомендуется комбинировать оба подхода: в дебюте заболевания производить поиск ЛАИФ с помощью той же панели, по которой в дальнейшем будет производиться детекция МОБ. ЛАИФ, определенный в дебюте, используется как отправная точка в поиске МОБ, однако все клеточные популяции сравниваются с нормальными стадиями созревания гемопоэтических клеток [32],[33].

Общие представления о детекции МОБ методом МПЦ у больных В-ОЛЛ. В-клеточные предшественники (гематогоны) дифференцируются в зрелые В-клетки в КМ, которые затем покидают КМ и высвобождаются в периферическую кровь. Особенности изменения антигенного профиля, происходящего при В-лимфопоэзе, хорошо изучены. Линейно ассоциированнымВ-клеточныммаркером является CD19, но на самых ранних В-клеточных предшественниках CD19 отсутствует, а на поверхности клеток экспрессируется CD34 совместно с CD22. Затем по мере созревания В-клеточные предшественники начинают экспрессировать CD19, CD34 и CD10. Далее гематогоны теряют экспрессию CD34, экспрессия CD10 снижается, а экспрессия CD19 и CD45 повышается. Переходя в зрелую фазу, В-клетки приобретают мембранную экспрессию IgM, характеризуются высокой экспрессией CD45 и отсутствием CD10. Количество В-клеточных предшественников в КМ крайне вариабельно и зависит от возраста [30],[34],[35].

Зная иммунофенотипическую характеристику стадий нормального развития В-клеток КМ, можно дифференцировать их с опухолевыми В-лимфобластными клетками (рис. 2). Однако вследствие того, что антигенный профиль нормальных и опухолевых клеток пересекается, необходимо исследовать коэкспрессию многих маркеров. Для этих целей рекомендуют множество панелей моноклональных антител, и оптимальным является сочетание CD19, CD10, CD34, CD38, CD20, CD58, иногда полезным может быть включение CD11a, CD13, CD33, CD9, CD22, CD81 [30],[36],[37],[38].

Общие представления о детекции МОБ методом МПЦ у больных Т-ОЛЛ. Иммунофенотип лейкемических клеток при Т-ОЛЛ близок к иммунофенотипу нормальных Т-клеточных предшественников. Однако в отличие от В-клеток, созревание Т-клеток происходит в тимусе, а не в КМ. Т-клетки в КМ представлены только зрелыми Т-клетками, попавшими из периферической крови. Детекция МОБ при Т-ОЛЛ подразумевает поиск в пунктате КМ клеток с иммунофенотипом Т-клеточных предшественников. Зрелые Т-клетки в костном мозге имеют иммунофенотип CD7+ CD3cyt+ CD5+ CD2+ CD3+ и экспрессируют CD4 или CD8. При поиске МОБ уделяют внимание наличию опухолевых клеток с иммунофенотипом незрелых Т-клеток: цитоплазматическая экспрессия CD3 без поверхностной экспрессии CD3, а также снижение экспрессии CD2, CD5 или аномальной экспрессии CD4 и CD8, наличие маркеров CD34, TdT, высокая экспрессия CD99 и низкая — CD45. Может быть полезным также исследование нелинейной коэкспрессии миелоидных антигенов [30],[39].

При поиске МОБ могут встречаться нормальные клетки с нетипичным иммунофенотипом в небольшом количестве. При анализе CD7+ -популяции большинство Т-клеток имеет иммунофенотип CD3+ CD5+ , однако может встречаться субпопуляция CD3– CD5+ , которая соответствует NK-клеткам и CD3+ CD5– , которые являются γδ-Т-клетками, количество которых увеличивается с возрастом [39],[40].

Общие представления о детекции МОБ методом МПЦ у больных ОМЛ. Принцип детекции МОБ при ОМЛ такой же, как и при ОЛЛ, и основан на поиске клеток с ЛАИФ. Примерами ЛАИФ при ОМЛ могут быть: обнаружение лимфоидных маркеров на клетках миелоидного происхождения (например, экспрессия CD7); повышенная экспрессия антигенов (например, CD33, CD34, CD99); сниженная экспрессия антигенов (например, CD38, HLA-DR); асинхронная коэкспрессия ранних и поздних антигенов (например, CD34 и CD11b) [41]. Пример детекции МОБ методом МПЦ показан на рис. 3. Следует учитывать, что на нормальных гемопоэтических клетках, особенно при регенерации клеток КМ, может встречаться «аномальная» экспрессия ряда антигенов. Лимфоидные антигены CD2, CD7 и CD56 присутствуют на нормальных CD34+ предшественниках, но таких клеток в норме немного [42],[43],[44].

В сравнении с детекцией МОБ при ОЛЛ, поиск МОБ при ОМЛ представляет собой более трудную задачу. Иммунофенотип миелоидных бластных клеток значительно отличается у разных больных, поэтому отработка стандартной системы гейтирования становится проблемной. Кроме того, популяция бластных клеток даже у одного больного может быть гетерогенной и состоять как из незрелых клеток-предшественниц, так и из клеток с экспрессией зрелых миеломоноцитарных маркеров. Поэтому важным при исследовании МОБ на этапах терапии является изучение иммунофенотипа бластных клеток в дебюте заболевания для установления основного ЛАИФ с помощью той же панели антител, которая затем будет использоваться для мониторинга МОБ. Однако для ОМЛ характерен «иммунофенотипический сдвиг», то есть исчезновение экспрессии антигенов, которые обнаруживались в дебюте заболевания, и/или появление новых антигенов на бластных клетках при проведении терапии.

Изменения в иммунофенотипе лейкозных клеток обнаруживают как при проведении лечения, так и при развитии рецидива [45],[46]. M.R. Baer и соавт. [47] показали, что у 91 % больных ОМЛ при рецидиве заболевания иммунофенотип бластных клеток изменяется, но это изменение не ассоциировано с прогнозом. D. Voskova и соавт. [48] показали смену ЛАИФ, а также цитогенетических и молекулярных параметров у больных с рецидивом ОМЛ. В исследовании ОМЛ у детей отмечено, что при рецидиве заболевания иммунофенотип лейкозных клеток становится незрелым, т. е. «теряются» антигены CD14, CD11b, CD15 [45].

Исследование МОБ методом МПЦ возможно у 80– 100 % больных ОМЛв отличие отметода ПЦР, который применим лишь у 30 % больных. Однако стандартизация метода МПЦ остается дискутабельной. В разных лабораториях значительно отличаются используемые панели антител, количество одновременно анализируемых параметров, а также применяемые подходы анализа данных. Согласно рекомендациям Европейской рабочей группы по острым лейкозам [28], анализ МОБ у больных ОМЛ предлагается проводить с помощью не менее 8-цветного анализа с включением в панель моноклональных антител против CD7, CD11b, CD13, CD15, CD19, CD33, CD34, CD45, CD56, CD117, HLADR. Выделение бластных клеток должно выполняться на основе анализа CD45, CD34, CD117, CD13, CD33, а также прямого и бокового светорассеяния. В случаях необходимости дополнительно исследовать комбинацию антигенов CD64, CD11b, CD14, CD4, CD34, HLADR, CD33, CD45, позволяющую оценить моноцитарную дифференцировку клеток.

Для решения проблем, связанныхснизкимразличием в антигенном профиле бластных клеток и нормальных предшественников и «иммунофенотипическим сдвигом», необходимо использовать комплексную стандартизированную панель моноклональных антител, позволяющую одновременно исследовать коэкспрессию большого количества антигенов. Увеличивающееся количество цветов приводит к тому, что ручная обработка данных становится крайне трудной, поэтому применение автоматических алгоритмов анализов является перспективным [49].

Количественное определение и чувствительность детекции МОБ методом МПЦ. При детекции МОБ методом МПЦ в контрольной точке проводят анализ всех клеток КМ. Применяя принципы поиска МОБ, описанные выше, находят опухолевую популяцию клеток с определенным иммунофенотипом и подсчитывают количество клеток, составляющих данную популяцию. Далее определяют количество проанализированных ядросодержащих клеток (используя нуклеотропные красители Syto или выделение клеток по показателям прямого и бокового светорассеяния) или количество лейкоцитов (используя маркер CD45). Затем определяют долю опухолевых клеток от всех ядросодержащих клеток или лейкоцитов. Результат исследования МОБ считают положительным, если при цитометрическом исследовании выявлена популяция лейкемических клеток, состоящая, по меньшей мере, из 10–50 клеток с аберрантной экспрессией определенных антигенов (количество клеток, формирующих минимальную популяцию, в разных лабораториях может отличаться). Если среди собранных клеток не обнаружено и 10–50 лейкемических клеток, то делается заключение, что МОБ не выявлена при достигнутой чувствительности анализа.

При этом не исключается вероятность того, что МОБ будет обнаружена, но будет меньше достигнутого порога чувствительности. Чувствительность же определяется при каждом анализе и зависит от общего количества проанализированных клеток. Например, если за минимальную принимается популяция, состоящая из 20 клеток, то чувствительность определяется по формуле 1.

Необходимая чувствительность метода составляет 0,01 %. Для того, чтобы достичь такую чувствительность, необходимо проанализировать 200 000 клеток и более (если минимальной была принята популяция, состоящая из 20 клеток). Если такая чувствительность не достигается, например, вследствие низкой клеточности КМ или значительного разведения материала периферической кровью, то необходимо провести повторную пункцию КМ и повторное исследование МОБ.

В последнее время при мониторинге МОБ уделяют особое внимание понятиям LOD и LLOQ, которые аналогичны понятиям общей и подсчетной чувствительности при ПЦР. LOD (англ. limit of detection) — это минимальный порог детекции, когда найдена популяция не менее чем из 30 клеток, что позволяет сделать заключение просто о наличии МОБ (формула 2). LLOQ (англ. lower limit of quantifi cation) — это порог точной количественной оценки, который достигается, если найдена популяция не менее чем из 50 клеток, когда возможно определить уровень МОБ точно и воспроизводимо (формула 3).

LOD и LLOQ, так же как и чувствительность, зависят от количества собранных клеток. Таким образом, если среди собранных событий обнаружена популяция, состоящая из 50 аберрантных клеток и более, то МОБ выявляется и может быть точно подсчитана. В этом случае в заключении указывают подсчитанное значение МОБ. Если среди собранных событий обнаружена популяция, состоящая из более 30, но менее 50 аберрантных клеток, то МОБ выявляется, однако точная количественная оценка не может быть дана. В этом случае в заключении указывают диапазон от LOD до LLOQ, в котором находится истинное значение МОБ [50].

Таким образом, основными методами, используемыми в диагностике МОБ, являются ПЦР и МПЦ. Применимость обоих методов при анализе МОБ при ОЛЛ достигает 90 %, что привело к интеграции ПЦР и МПЦ в протоколы терапии. Применимость ПЦР для поиска МОБ при ОМЛ составляет только 30 %, а исследование МОБ методом МПЦ возможно в 80–100 % случаев, но сопряжено с методическими трудностями: требует высокого уровня подготовленности и профессионализма персонала, хорошего технического оснащения и широкого набора моноклональных антител, удовлетворяющих требованиям современных методических рекомендаций. Диагностика МОБ должна быть доступна для оценки ответа на лечение у каждого больного острым лейкозом, так как позволяет провести точную оценку риска и своевременно оптимизировать терапию.