Чернецкая Дарья Михайловна, научный сотрудник лаборатории генной инженерии
125167, Москва
Сурин Вадим Леонидович, старший научный сотрудник лаборатории генной инженерии
125167, Москва
Саломашкина Валентина Валерьевна, ведущий специалист лаборатории генной инженерии
125167, Москва
Пшеничникова Олеся Сергеевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории генной инженерии
125167, Москва
Яковлева Елена Владимировна, кандидат медицинских наук, гематолог отдела коагулопатий
125167, Москва
Зозуля Надежда Ивановна, доктор медицинских наук, заведующая научно-консультативным отделом коагулопатий
125167, Москва
Судариков Андрей Борисович, доктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной гематологии
125167, Москва
Лихачева Елена Аркадьевна, кандидат медицинских наук, врач-гематолог отдела коагулопатий
125167, Москва
Шабанова Елена Сергеевна, генетик, ассистент кафедры медицинской генетики
191015, Санкт-Петербург
Перина Фарида Галимовна, гематолог, Центр детской онкологии и гематологии
620149, Екатеринбург
Введение. Болезнь Виллебранда (БВ) вызывается различными вариантами нарушения функции фактора фон Виллебранда (vWF), определяемыми патологическими изменениями в кодирующем его гене vWF. Особый интерес представляет тип 2N, характеризующийся близким к нормальному значением антигена vWF (vWF:Ag) при утрате им способности связываться с фактором VIII (FVIII) и отсутствием защиты последнего от протеолиза. За счет этого коагуляционная активность FVIII может быть низкой, что приводит к сходным фенотипическим проявлениям у больных с типом 2N БВ и гемофилией А.
Цель — выявление больных с типом 2N БВ на основании молекулярно-генетических методов.
Материалы и методы. Использованы данные из историй болезни больных БВ. Учитывали соотношение FVIII:C и vWF:AG, которое при 2N типе БВ должно быть меньше 0,7. Поиск патогенных вариаций проводили секвенированием экзонов и прилежащих к ним интронных областей гена vWF по методу Сэнгера. Поскольку наследование 2N типа БВ рецессивное, для диагноза требовалось найти два патогенных варианта.
Результаты. По данным исследования параметров гемостаза (FVIII:C/vWF:Ag < 0,7) были отобраны 3 больных, у которых предполагался диагноз «2N тип БВ». Проведен анализ показателей больного, у которого предполагался диагноз «гемофилия А», который, однако, не подтвердился при секвенировании гена F8. Во всех перечисленных случаях определение первичной структуры функционально значимых областей гена vWF позволило верифицировать диагноз БВ тип 2N. Одна больная (№ 4) была гомозиготна по патогенному варианту p.Arg854Gln (c.2561 G>A). У больной № 3 была найдена гетерозиготная замена p.Arg816Trp (c.2446 C>T), соответствующая типу 2N, и ранее не описанная инсерция c.2098_2099insG, вызывающая сдвиг рамки считывания. У больной № 1, выявленной по параметру (FVIII:C/vWF:Ag < 0,7), и у больного № 2 с изначальным диагнозом «гемофилия А» было выявлено сочетание делеции c.2435delC и замены p.Thr791Met (c.2372 C>T) в гетерозиготном состоянии. Генные варианты p.Thr791Met и p.Arg854Gln ассоциированы с типом 2N, а делеция c.2435delC приводит к дисфункциональности аллеля.
Заключение. Молекулярные методы позволили диагностировать 2N тип БВ, дифференцируя его и от других типов БВ, и от гемофилии А.
Introduction. Von Willebrand disease (vWD) is caused by von Willebrand factor (vWF) dysfunction resulting from pathogenic variants in the vWF gene coding the vWF protein. vWD type 2N is of particular interest, as it is characterized by almost normal vWF antigen level (Ag:vWF) and vWF loss of ability to bind FVIII and protect it from premature clearance, which leads to a low FVIII coagulation activity (FVIII:C). Therefore, the same phenotype occurs in patients with 2N type of vWD and hemophilia A.
Aim — to identify patients with 2N type vWD using molecular genetic methods.
Methods. Data from the medical histories of vWD patients were used. The major parameter in consideration was FVIII:C to vWF:Ag ratio, which is expected to be below 0.7 in type 2N of vWD. Pathogenic variants in exons and exon-intron junctions of the vWF gene were identified by Sanger sequencing. Due to recessive inheritance of type 2N, verification of the 2N vWD diagnosis required the identification of two pathogenic variants.
Results. Three patients were considered as suffering from type 2N of vWD according to hemostasis parameters (FVIII:C/vWF:Ag < 0.7). One patient with a preliminary hemophilia A diagnosis was included after sequencing of the F8 gene, which showed no alterations, so 2N type of vWD was suspected. In all cases, sequencing of the relevant functional regions of the vWF gene led to verification of vWD type 2N. One woman (patient # 4) had a homozygous pathogenic variant p.Arg854Gln (c.2561 G>A) associated with type 2N vWD. One woman (patient # 3) was a compound heterozygote for the pathogenic variant p.Arg816Trp (c.2446 C>T) associated with type 2N and a newly described insertion c.2098_2099insG, that leads to a frameshift. The woman with FVIII:C/vWF:Ag < 0.7 (patient # 1) and the patient # 2 with preliminary hemophilia А diagnosis were both compound heterozygotes for the same combination of pathogenic variants — c.2435delC and p.Thr791Met (c.2372 C>T). Pathogenic variant p.Thr791Met is associated with type 2N, while the deletion c.2435delC should lead to allele disabling.
Conclusion. Molecular methods allow more precise differentiation of type 2N from other types of vWD and hemophilia A.
Болезнь Виллебранда (БВ) названа именем финского врача Эрика Адольфа фон Виллебранда, который впервые описал ее в 1926 г., выделив среди других случаев врожденных геморрагических диатезов и гемофилии [
Первая линия лечения БВ — это терапия десмопрессином (DDAVP, аналог вазопрессина), он используется как при легкой форме гемофилии А, так и при легком течении БВ [
БВ вызывается патологическими изменениями в гене vWF, а гемофилия А — изменениями в гене F8. Однако имеются больные, у которых присутствуют изменения в обоих генах [
Рисунок 1. Доменная структура vWF [3][15]. Расположение найденных патогенных вариантов обозначено на схеме гена. Красным цветом выделены варианты, связанные со сдвигом рамки считывания и дисфункциональностью аллеля. Синим цветом обозначены замены, вызывающие тип 2N
Figure 1. Domain structure of vWF [3][15]. Location of the pathogenic variants found is shown on gene map. Red color marks frameshifts leading to allele dysfunction. Blue color marks pathogenic variants causing 2N type
Целью настоящей работы было выявление больных с типом 2N БВ на основании молекулярно-генетических методов.
В работу включены 4 больных, для каждого из которых были получены образцы крови и анамнестические данные: двое больных из ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России (Москва) и по одному больному — из ГАУЗ СО Центр детской онкологии и гематологии (Екатеринбург) и ФГБОУ ВО «СЗГМУ им И.И. Мечникова» Минздрава России (Санкт-Петербург).
Кровь больных была направлена в лабораторию генной инженерии для проведения генетического исследования после того, как лечащим врачом на основании наличия в анамнезе кровотечений, характерных для БВ, и данных коагулогических тестов был установлен диагноз БВ. Для больных, у которых были определены vWF:Ag и FVIII:C, рассчитывали соотношение FVIII:C/vWF:Ag. В исследование включали только больных с соотношением FVIII:C/vWF:Ag менее 0,7. Было выявлено двое таких больных (№ 1, № 3).
Кровь больного № 2 была направлена в лабораторию для подтверждения диагноза «гемофилия А», который был установлен на основании анамнестических данных о тяжелых кровотечениях в сочетании со сниженной плазменной активностью FVIII:C, однако по результатам исследования гена F8 у него не было выявлено патогенных вариантов. Результаты исследования соотношения FVIII:C/vWF:Ag у этого больного были получены уже после получения данных молекулярно-генетического анализа гена vWF и оказались меньше 0,7.
У больной № 4 проводили дифференциальный диагноз между типом 2N БВ и носительством гемофилии А. У этой больной были исследованы FVIII:C и vWF:Ag, соотношение FVIII:C/vWF:Ag составило < 0,7, поэтому образцы ее крови были направлены на исследование.
Концентрация в плазме vWF:Ag была измерена иммунотурбидиметрическим методом. Активность в плазме фактора VIII (FVIII:C) была измерена клоттинговым методом, ристоцетин кофакторную активность (vWF:RCo) измеряли агрегационным методом, активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) — клоттинговым методом (табл. 2).
Методы экстракции ДНК, полимеразной цепной реакции (ПЦР), очистки продуктов ПЦР, секвенирования и анализа полученных нуклеотидных последовательностей описаны ранее [
Для постановки молекулярно-генетического диагноза были проанализированы следующие экзоны гена vWF: 17–21, 24, 25, 27, 28. Праймерные системы для амплификации вышеперечисленных экзонов представлены в таблице 1. Позиции праймеров и номенклатура патогенных вариантов указаны согласно референсной последовательности NCBI NG_009072. Температура отжига для всех пар праймеров была 62 °С.
Таблица 1. Последовательности праймеров, использованных для амплификации и секвенирования гена vWF
Table 1. Primer sets used for amplification and sequencing of vWF gene
Номер экзона Exon number | Система праймеров от 5`к 3` Primer set from 3` to 5`. | Позиция в гене vWF (NG_009072) Position in vWF gene (NG_009072) | Размер фрагмента, пн Fragment length, bp |
16 | ACC ACA GTC CTT GCT GTC CA | 71829–71848 | 340 |
GCC CCA GTT TAC CCA TCC AT | 72228–72209 | ||
17 | AAC GTT AGC AAG CTG TGC TTC A | 77711–77732 | 339 |
ACG CAC ATC TGA CGG TGT CA | 78049–78030 | ||
18 | GAT GCC CTC CCA GTC CCA CA | 80045–80064 | 400 |
CTC ACT CAT CCC TGC CTA CA | 80444–80425 | ||
19 | GCT GGA GGA GGG CTT TAG AT | 88117–88136 | 259 |
TGG AGG CAA GTG CGG AAG GT | 88375–88356 | ||
20 | GTG TTC CTT CAT TGC CTC CAT | 89760–89780 | 310 |
CAG ATC CAC AGA ACC CAA CCT | 90069–90049 | ||
21 | GAT CCT GTG ACA CGT ACT CA | 92985–93004 | 379 |
TAG CTC TGC CTC ATC CTC TT | 93363–93344 | ||
23–24 | GGA ATG TTC CCC TTT CCC CT | 98547–98566 | 614 |
CAC TCT GTG TCC ATA CCA CCA | 99160–99140 | ||
25 | CCA GAC TAA GAG CCA GAG TTC C | 100817–100838 | 354 |
CAT CCA GTC CCT ACT AAC ACT | 101170–101150 | ||
26–27 | CCA ACA TTA TCT CCA GAT GGC | 101674–101694 | 1180 |
TTA CCC AAA ACC TAG TCT CTA A | 102853–102832 | ||
28 | CAG AAG TGT CCA CAG GTT CT | 104871–104890 | 1510 |
GCA GAT GCA TGT AGC ACC AA | 106380–106361 |
Таблица 2. Данные истории болезни больных (в скобках — референсные значения)
Table 2. Patient’s medical history data (in parenthesis — normal range)
Номер больного Patient No. | Возраст, годы Age, years | Пол Sex | vWF: Ag, % (40–150) | FVIII: C, % (50–150) | FVIII: C/ VWF: Ag | vWF: RCo, % (40–150) | АЧТВ, с APTT, s (29–38) | Предполагаемый диагноз Assumed diagnosis |
1 | 50 | Ж/F | 27,5 | 13 | 0,47 | 109 | 61 | БВ/vWD |
2 | 53 | М | 68,9 | 5,9 | 0,09 | 63 | 94 | ГА/HA |
3 | 16 | Ж/F | 58,2 | 5,6 | 0,1 | нд/nd | 58,2 | БВ/vWD |
4 | 37 | Ж/F | 79 | 34,8 | 0,44 | 73,6 | 1,2** | 2N/ГА*/2N/HA* |
Поскольку наследование типа 2N рецессивное, то диагноз считали подтвержденным при наличии двух патогенных вариантов. В случае, если в указанных экзонах обнаруживали два патогенных варианта, соответствующих типу 2N, поиск завершали. Если в указанных экзонах находили только один вариант, соответствующий типу 2N, то проводили поиск по остальным экзонам гена vWF, чтобы найти нарушение, целиком прекращающее работу второго аллеля. Пары праймеров для экзонов, где были обнаружены изменения, приведены в таблице 1. Праймерные системы, разработанные в лаборатории генной инженерии, позволяют исключить параллельную амплификацию соответствующих фрагментов псевдогена. Патогенность новой мутации была определена согласно классификатору American College of Medical Genetics (ACMG) [
У всех включенных в исследование больных диагноз тип «2N БВ» был подтвержден молекулярно-генетическими методами. У каждого больного найдено два патогенных варианта гена vWF, и хотя бы один из них локализован в области, отвечающей за связь с FVIII (табл. 3).
Таблица 3. Генетические характеристики больных БВ типа 2N
Table 3. Genetic characteristics of vWD 2N patients
Номер больного Patient No. | Патогенный вариант Pathogenic variant | Описание Reference | Экзон Exon | Домен Domain | Тип БВ VWD type |
1 | c.2435delC | [18] | 18 | D`, субдомен TIL` D`, subdomain TIL` | 3 (потеря функциональности гена) 3 (total loss of function) |
p.Thr791Met c.2372 C>T | [19] | 18 | D`, субдомен TIL` D`, subdomain TIL` | 2N | |
2 | c.2435delC | [18] | 18 | D`, субдомен TIL` D`, subdomain TIL` | 3 (потеря функциональности гена) 3 (total loss of function) |
p.Thr791Met c.2372 C>T | [19] | 18 | D`, субдомен TIL` D`, subdomain TIL` | 2N | |
3 | p.Arg816Trp c.2446 C>T | [20] | 19 | D`, субдомен IL` D`, subdomain TIL` | 2N тяжелый 2N severe |
c.2098_2099insG | Новая / New | 16 | D2 | ||
4 | p.Arg854Gln c.2561 G>A | [21] | 20 | D`, субдомен E` D`, subdomain E` | 2N легкий 2N mild |
p.Arg854Gln c.2561 G>A |
У двух больных (№ 1 и № 2) найден один и тот же набор патогенных вариантов в гетерозиготном состоянии в субдомене TIL домена D`: c.2435delC и c.2372 C>T Thr791Met. Это компаундное сочетание замены Thr791Met, ассоциированной с БВ типа 2N, и делеции c.2435delC, приводящей к отсутствию функционального фактора [
У больной № 3 выявлена замена p.Arg816Trp в сочетании с неописанной ранее инсерцией c.2098_2099insG. Обе вариации представлены в гетерозиготном состоянии и локализованы в субдомене TIL` домена D`. Новый вариант c.2098_2099insG соответствует критериям патогенного варианта ACMG (PVS:1, PS:1, PM:1).
У больной № 4 обнаружена замена p.Arg854Gln в гомозиготном состоянии в субдомене E` домена D`.
Данные по двум (№ 1 и № 2) из 4 больных, включенных в исследование, были частично опубликованы ранее [
У больной № 1 была диагностирована БВ, но не уточнен тип заболевания. У нее наблюдались симптомы, типичные для БВ: меноррагии, десневые кровотечения, кровотечения из лунок после удаления зубов и гематома после аппендэктомии.
Генетический анализ больной № 4 был проведен для дифференциальной диагностики между 2N БВ и носительством гемофилии А с целью планирования семьи. Молекулярный анализ позволил определить выявленную у нее замену p.Arg854Gln в гомозиготном состоянии как патогенный вариант, обусловливающую развитие типа 2N БВ.
Кровь больной № 3 была направлена в лабораторию в связи с диагнозом БВ у больной, однако тип БВ не был установлен. Значение vWF:Ag, составившее 58,2 %, было в пределах нормы, при этом определялась низкая активность FVIII:C, оставлявшая 5,6 %, что было характерно для типа 2N БВ. Выявленная у нее замена p.Arg816Trp описана как вызывающая тип 2N, но в гетерозиготном состоянии ее недостаточно для появления симптомов. У этой больной найден второй патогенный вариант в гетерозиготном состоянии — c.2098_2099insG. Эта инсерция не описана ранее в литературе, однако ее патогенность очевидна (frameshift-мутация в середине гена — это «нулевая мутация»). Сочетание «нулевой мутации» с патогенным вариантом типа 2N, а также лабораторные данные позволяют заключить, что у больной именно 2N тип БВ.
Результаты коагулогического анализа (табл. 2) характерны для больных с типом 2N БВ [
Выявленные замены p.Thr791Met, p.Arg816Trp и p.Arg854Gln являются наиболее частыми среди патогенных изменений, вызывающих тип 2N [
Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что молекулярно-генетический анализ, основанный на определении мутаций в гене vWF, дает возможность эффективно отличать БВ 2N типа не только от других типов этого заболевания, с чем вполне успешно справляются коагулогические тесты, но и от гемофилии А, что не всегда удается сделать с их помощью [
The authors declare that there are no conflicts of interest present.