Болезнь Виллебранда (БВ) — наиболее распространенное геморрагическое заболевание свертывающей системы крови. Проявления геморрагического диатеза при БВ чрезвычайно полиморфны — от единичных петехий до внезапно возникающего сильного кровотечения. Широкая вариабельность частоты возникновения и выраженности геморрагических проявлений зависит от уникальных свойств фактора Виллебранда (von Willebrand factor, vWF). vWF обладает широким спектром функциональной активности. Он принимает участие в реализации механизмов адгезии тромбоцитов, стабилизирует фактор свертывания VIII (FVIII), обеспечивая его физиологический клиренс, а также связывается с коллагеном при повреждении эндотелиальной выстилки сосуда. Фиксация мультимера vWF к коллагену и тромбоцитам в месте повреждения сосудистой стенки инициирует его переход под воздействием силы сдвига жидкости (крови) в открытую (нитевидную) конформацию, обеспечивающую максимальную гемостатическую эффективность этого адгезивного белка [1].

Различные качественные дефекты vWF (нарушение взаимодействия с тромбоцитами, парциальный дефицит мультимеров высокой молекулярной массы), а также снижение способности связываться с FVIII лежат в основе патогенеза БВ 2-го типа. При более распространенном 1-м типе БВ, обусловленном умеренным количественным дефицитом vWF, проявления клинически значимого геморрагического диатеза наблюдаются при снижении концентрации антигена vWF (vWF:Ag) менее 30 %. Тем не менее кровотечение может возникать и у лиц с концентрацией vWF:Ag, находящейся в диапазоне 30–50 % [2]. Однако и более высокие концентрации vWF:Ag у больных БВ не исключают развитие геморрагического диатеза, хотя при этом риск тяжелого кровотечения значительно меньше. Это свидетельствует о том, что в основе геморрагических проявлений у больных БВ 1-го типа лежит не только количественный дефицит vWF (или его мультимеров), но и изменения его функциональных характеристик. При этом ускорение клиренса FVIII и, как следствие, уменьшение количества этого фактора в кровотоке у больных БВ 1-го типа, может рассматриваться не только с точки зрения количественного дефицита vWF, но и с позиции качественного дефекта — нарушения функции стабилизатора по отношению к FVIII [3–5].

В последние годы широко используются коммерческие тесты для исследования связывающей способности vWF с коллагеном. Рядом лабораторий эти тесты используются с целью улучшить диагностику и дифференциальную диагностику типов и подтипов БВ [6][7].

Тест коллаген-связывающей способности vWF (vWF collagen binding activity, vWF:CB) позволяет исследовать адгезивные характеристики vWF — возможность фиксироваться к коллагену, используя специфичные коллаген-связывающие домены. При соответствующей оптимизации тест преимущественно оценивает связывание с коллагеном мультимеров vWF высокой молекулярной массы. Показано, что уменьшение vWF:CB отражает уменьшение количества мультимеров высокой молекулярной массы в исследуемом образце [8][9]. Для оценки vWF:CB используют тест-системы, содержащие коллаген I и III типов (vWF:CBAI и vWF:CBAIII) в различных пропорциях. Клиническая целесообразность данного теста рассматривается в плоскости проведения дифференциального диагноза между БВ 1-го и 2-го типа, то есть, в известной степени, выполняет ту же задачу, что и исследование ристоцетин-кофакторной активности vWF (vWF:RCo). Тем не менее, высказано мнение, что тест vWF:CB не является альтернативой исследованию vWF:RCo, но может использоваться в дополнение к последнему для расширения диагностической панели [6]. Опубликованы лишь единичные работы, посвященные изучению роли коллагена различных типов в гемостазе и возможного клинико-диагностического значения тестов, основанных на определении vWF:CB с различными типами коллагена [10–12].

Целью настоящего исследования явилась оценка частоты встречаемости нарушений vWF:CBAI и vWF:CBAIII у женщин с диагностированной БВ 1-го типа и диагностических возможностей этих тестов.

Исследование проводилось с 1 августа по 30 ноября 2019 г. на базе амбулаторно-консультативного отделения СПб ГБУЗ «Городская больница № 26». В проспективное исследование были включены 224 женщины с ранее диагностированной БВ 1-го типа. Для верификации диагноза использовали диагностические рекомендации, принятые в Российской Федерации [13].

Для оценки специфичности тестов vWF:CBAI и vWF:CBAIII были обследованы 80 здоровых женщин-доноров крови (контрольная группа) отделения переливания крови СПб ГБУЗ «Городская больница № 26», при обследовании которых использовали апробированный ранее опросник для выявления возможных признаков чрезмерной кровоточивости [14]. В исследование были включены только лица, давшие отрицательные ответы по всем пунктам опросника.

При включении в исследование все больные и участницы контрольной группы подписали добровольное информированное согласие. Перед проведением исследования получено положительное заключение локального этического комитета СПб ГБУЗ «Городская больница № 26» (протокол № 3 от 24 июля 2019 г.).

В рамках исследования выполняли забор крови из периферической вены с последующим изу­чением показателей: vWF:Ag, FVIII:C, vWF:RCo. Исследования образцов крови выполняли на автоматическом коагулометре «Elite PRO» (Instrumentation Laboratory, США) с использованием реагентов «HemosiIL» (Instrumentation Laboratory, США). В этих же образцах на иммуноферментном анализаторе «Tecan Infinite F50» (Tecan, Австрия) с использованием реагентов Technoclone (Technoclone GmbH, Австрия) выполняли исследования vWF:CBAI и vWF:CBAIII. Для оценки результатов использовали референсные интервалы, рекомендованные производителями тест-систем: vWF:Ag — 50–160 %, FVIII:C — 50–150 %, vWF:RCo — 50–160 %, vWF:CBAI — 0,6–1,3 Ед./мл и vWF:CBAIII — 0,4–2,5 Ед./мл.

При выполнении анализа полученных результатов больных разделяли на группы по признаку снижения изучаемых показателей ниже границы референсного интервала.

Статистический анализ. Полученные результаты представлены в виде средних значений с ошибкой репрезентативности. Статистический анализ выполняли с использованием пакетов «Statistica for Windows, 10.0» (StatSoft Inc., США).

При изучении женщин с ранее диагностированной БВ 1-го типа выявлена значительная вариабельность в сочетании количественных и качественных лабораторных характеристик vWF. Снижение vWF:CBAI было выявлено у 133 (59,4 %) больных, а снижение vWF:CBAIII отмечалось у 26 (11,6 %) больных. Уменьшение концентрации vWF:Ag ниже границы референсного интервала имело место у 77 (34,4 %) больных и находилось в диапазоне от 10 до 48 % (среднее — 35,4 ± 2,3 %). Как видно из данных, представленных на рисунке 1, у 38 (49,4 %) больных со снижением концентрации vWF:Ag при концентрации vWF:Ag от 14 до 48,4 % (среднее — 38,5 ± 1,4 %) значения показателей vWF:CBAI и vWF:CBAIII не выходили за нижнюю границу референсных интервалов (vWF:CBAI — от 0,6 до 3,64 Ед./мл, среднее — 1,09 ± 0,09 Ед./мл; vWF:CBAIII — от 0,4 до 3,24 Ед./мл, среднее — 1,18 ± 0,11 Ед./мл). В 27 наблюдениях (35,1 % от числа больных со снижением концентрации vWF:Ag) наряду со снижением концентрации vWF:Ag от 10 до 48 % (среднее — 35,4 ± 2,2 %) также наблюдалось снижение vWF:CBAI ниже границы референсного интервала, которое находилось в диапазоне от 0,2 до 0,59 Ед./мл (среднее — 0,4 ± 0,03 Ед./мл), в то время как показатель vWF:CBAIII не выходил за нижнюю границу референсного интервала (минимально — 0,4 Ед./мл, максимально — 2,27 Ед./мл, среднее — 0,89 ± 0,11 Ед./мл). У 10 (13 %) больных уменьшение концентрации vWF:Ag ниже границы референсного интервала от 17,5 до 43 % (среднее — 35,5 ± 2,9 %) сопровождалось также снижением vWF:CBAI от 0,001 до 0,52 Ед./мл (среднее — 0,24 ± 0,05 Ед./мл) и vWF:CBAIII от 0,1 до 0,36 Ед./мл (среднее — 0,24 ± 0,03 Ед./мл). В двух наблюдениях (2,5 %) наряду со снижением концентрации vWF:Ag ниже границы референсного интервала (45 % и 47,8 %) отмечено снижение vWF:CBAIII (0,3 и 0,35 Ед./мл), в то время как показатель vWF:CBAI находился в пределах референсного интервала (0,79 и 0,82 Ед./мл).

На момент проведения исследования концентрация vWF:Ag находилась в пределах референсного интервала у 147 больных с ранее диагностированной БВ 1-го типа (65,6 % от числа больных, включенных в исследование), при этом у 45 больных (30,6 % от числа больных без снижения концентрации vWF:Ag ниже границы референсного интервала), показатели vWF:CBAI и vWF:CBAIII также не выходили за нижнюю границу референсных интервалов (рис. 2). Однако у 87 больных (59,2 % от числа больных без снижения концентрации vWF:Ag ниже границы референсного интервала) отмечено также снижение vWF:CBAI от 0,1 до 0,59 (среднее — 0,38 ± 0,01 Ед./мл), а у 6 больных (4,1 % от числа больных с vWF:Ag в пределах референсного интервала) выявлено также снижение vWF:CBAIII от 0,065 до 0,38 Ед./мл (среднее — 0,27 ± 0,06 Ед./мл). В 9 наблюдениях (6,1 % от числа больных концентрации vWF:Ag в пределах референсного интервала) отмечено снижение vWF:CBAI от 0,1 до 0,58 (среднее — 0,36 ± 0,1 Ед./мл) и vWF:CBAIII от 0,14 до 0,37 Ед./мл (среднее — 0,21 ± 0,05 Ед./мл).

В проведенном исследовании установлено, что нарушение такой адгезивной функции vWF, как взаимодействие с коллагеном, является частым явлением при БВ 1-го типа. Более часто наблюдали нарушение связывания с коллагеном I типа (59,4 %), в то время как нарушение связывания с коллагеном III типа выявляли реже (11,6 %). При этом оба теста (vWF:CBAI и vWF:CBAIII) обладали высокой специфичностью, поскольку ни в одном из 80 наблюдений у лиц конт­рольной группы нарушения способности vWF связываться как с коллагеном I, так и с коллагеном III типа, не обнаружено.

В литературе указывается, что применение теста связывания vWF с коллагеном может играть двойственную роль. С одной стороны, тест позволяет предположить нарушение нормального соотношения мультимеров vWF в плазме крови у больных БВ 2-го типа, а с другой стороны, выявить возможный дефект адгезии vWF к коллагену [8][9]. Согласно результатам настоящего исследования установлено, что использование тестов vWF:CBAI и vWF:CBAIII позволяет оценить функциональную особенность vWF у больных БВ 1-го типа.

Ранее было показано [15][16], что отдельные домены vWF вступают во взаимодействие с различными типами коллагена. Домен А3 vWF связывается с коллагеном I типа и коллагеном III типа, в то время как домен А1 взаимодействует с коллагенами IV и VI типов. У больных БВ выявлен ряд мутаций в домене А3, таких как p.Ser1731Thr, pTrp1745Cys и pSer1783Ala [17–19]. У этих больных описан геморрагический фенотип при нормальных показателях vWF:Ag, VWF:RCo и достаточном количестве мультимеров высокой молекулярной массы vWF [4].

В настоящем исследовании снижение показателя vWF:CBAI при нормальных значениях vWF:Ag отмечено у 87 больных (38,8 % от числа больных). Изолированное снижение показателя vWF:CBAIII отмечалось существенно реже — в 2,7 % наблюдений. С такой же частотой было обнаружено одновременное снижение показателей vWF:CBAI и vWF:CBAIII, при нормальной концентрации vWF:Ag. При этом, согласно условиям включения в исследование, на предшествующем исследованию этапе наблюдения у этих женщин регистрировали снижение концентрации vWF:Ag и чрезмерную кровоточивость. Это свидетельствует о диагностическом потенциале исследования vWF:CBAI и vWF:CBAIII. Ранее диагностическая полезность исследования коллаген-связывающей способности vWF (с использованием тест-системы со смесью коллагенов) была показана рядом других исследователей [20][21].

Полученные результаты иллюстрируют значительную мозаичность функциональных характеристик vWF. Помимо хорошо известного при БВ 1-го типа волнообразного изменения таких показателей, как vWF:Ag и FVIII:C (что нередко требует повторного выполнения данных тестов для лабораторного подтверждения БВ у лиц с клиническими проявлениями повышенной кровоточивости), также имеет место значимая изменчивость показателей, характеризующих связывание vWF с коллагеном. В выполненном исследовании лабораторные показатели у женщин с ранее диагностированной БВ 1-го типа на момент выполнения исследования варьировали от полностью нормальных до сниженных значений показателей vWF:Ag, vWF:CBAI и vWF:CBAIII. В этом аспекте оценка связывания vWF с коллагеном, особенно с коллагеном I типа, представляется значимой для разграничения здоровых лиц и больных БВ. При этом возможность проведения дифференциальной диагностики между 1-м и 2-м типом БВ с помощью данных тестов требует дальнейшего изучения именно из-за высокой частоты встречаемости нарушения функции связывания vWF с коллагеном у женщин с БВ 1-го типа.

Дальнейшего изучения требует и возможность применения исследования связывания vWF с различными типами коллагена для стратификации риска развития геморрагических осложнений. Биологическая природа нарушения коллаген-связывающей функции vWF в настоящее время неясна. Логично предположить, что точечные мутации, в частности в области, кодирующий домен А3 белка vWF, могут вносить существенный вклад в реализацию его адгезивной функции, но, учитывая свойство vWF выступать в качестве белка острой фазы, нельзя исключить и другие механизмы влияния на текущую функциональную активность vWF. Подводя итог сказанному, представляется возможным сделать следующие выводы:

В последние годы достигнуты очевидные значительные успехи в понимании биологических механизмов, участвующих в патогенезе БВ. Новые знания привели к значительному прогрессу в диагностических алгоритмах и подходах к лечению этой наиболее распространенной геморрагической коагулопатии. Тем не менее, диагностика и классификация БВ, стратификация риска геморрагических осложнений по-прежнему создают серьезные проблемы в клинической практике. Требуются дальнейшие исследования для определения диагностической и клинической значимости полученных результатов.