Плотные гранулы тромбоцитов свое название получили за интенсивную визуализацию при электронной микроскопии вследствие высокого содержания в них кальция и фосфора [1]. Дефицит плотных гранул (ДПГ) тромбоцитов представляет собой группу гетерогенных нарушений системы гемостаза, в основе которых лежит количественный дефект дельта-гранул тромбоцитов [2]. Хорошо известны синдромальные формы ДПГ тромбоцитов — синдром Чедиака — Хигаси и Германского — Пудлака, сочетающиеся с альбинизмом, кровоточивостью и рядом других отклонений [3–5]. Однако изолированный ДПГ тромбоцитов в литературе представлен мало, генетические аномалии, ответственные за это нарушение, также изучены недостаточно, доступные лабораторные методы не всегда позволяют обнаружить это заболевание. Поэтому нередко больным с ДПГ тромбоцитов не устанавливается правильный диагноз.

ДПГ тромбоцитов приводит к геморрагическому синдрому от легкой до тяжелой степени тяжести [6]. Abraham S. M. и соавт. [7] предоставили информацию о 6 больных с ДПГ тромбоцитов в возрасте от 19 месяцев до 17 лет, наиболее частым симптомом у которых было носовое кровотечение, у части больных возникали субдуральные гематомы, а у 17-летней больной наблюдались меноррагии и анемия, требовавшие переливания концентратов тромбоцитов и эритроцитов в дополнение к антифибринолитикам.

Одним из диагностических методов первой линии, оценивающих функцию тромбоцитов, является оптическая агрегометрия, основанная на оценке светопропускающей способности богатой тромбоцитами плазмы после добавления индукторов агрегации, таких как АДФ, адреналин, коллаген, ристомицин, арахидоновая кислота и ряд других [8][9]. При ДПГ тромбоцитов не всегда наблюдается нарушение агрегационной функции тромбоцитов, лишь в ряде случаев выявляют отсутствие второй волны агрегации (чаще на АДФ) и снижение агрегации на коллаген [10–12]. «Золотым стандартом» диагностики ДПГ тромбоцитов является подсчет количества гранул и оценка их размеров с помощью электронной микроскопии [1][13]. В последнее время все большее практическое значение приобретает исследование тромбоцитов методом проточной цитометрии [14][15]. Для измерения содержания плотных гранул и их функциональной способности используют мепакрин, являющийся производным акридина. Методика основана на оценке разницы свечения, испускаемого тромбоцитами с накопленным мепакрином, до и после их активации [16–18], что позволяет дифференцировать ДПГ тромбоцитов и дефекты их мобилизации [19].

Цель настоящего сообщения — представить клиническое наблюдение 37-летней больной с выраженным геморрагическим синдромом, у которой ДПГ тромбоцитов обнаружен при помощи электронной микроскопии и подтвержден методом проточной цитометрии.

В работу включены образцы крови от 25 здоровых добровольцев обоего пола (средний возраст — 38 лет, диапазон возраста — от 18 до 51 года, 9 мужчин и 16 женщин) в качестве контроля и отработки методов диагностики ДПГ тромбоцитов, а также одна больная с геморрагическим синдромом неясного генеза.

Кровь для исследования забирали из локтевой вены в пластиковую пробирку, содержащую 3,2%-ный раствор натрия лимоннокислого трехзамещенного. Для взятия крови применяли иглу 19 G. Соотношение объемов крови и цитрата натрия — 9 : 1. Использовали вакуумные системы для забора крови. Кровь центрифугировали при 150–200 g в течение 5 мин.

Электронно-микроскопическое исследование нефик­сированных тромбоцитов проводили в течение 2 часов после взятия крови. Для оценки количества плотных гранул 30 мкл богатой тромбоцитами плазмы наносили на покрытую формваром сетку (mesh-200) по методике J. White [15] в течение 15 сек. После отмывания в дистиллированной воде и высушивания сетки исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа «Libra 120» (Carl Zeiss, Германия) при ускоряющем напряжении 120 кВ с последующим фотографированием на увеличениях 1985, 6300 и 20 000. В первую очередь образцы исследовали на малом увеличении (×250) для оценки распределения материала на подложке, определения количества агрегатов и выбора репрезентативных участков для исследования. Количество плотных гранул подсчитывали в 60–120 нефиксированных тромбоцитах. В агрегатах тромбоцитов, а также тромбоцитах с явлениями распластывания, активации и дегрануляции, пузырьковидными изменениями гиаломера плотные гранулы не подсчитывали. Плотными гранулами считали типичные электронноплотные образования округлой формы с «хвостами» или «в виде кошелька». Именно такие структуры большинство лабораторий NASCOLA расценивают как плотные гранулы. Образования средней и низкой электронной плотности небольших размеров или в виде «цепочек» не интерпретировали как плотные гранулы и исключали из подсчета. Морфометрические исследования проводили с использованием программной оболочки ITEM микроскопа «Libra 120» (Carl Zeiss, Германия). Для установления локальных особенностей пробоподготовки и уточнения нормальных диапазонов изу­чаемых морфологических параметров были изучены тромбоциты у 25 здоровых лиц.

Исследование тромбоцитов при помощи проточной цитофлуориметрии проводили в течение 2 часов после взятия крови. Для детекции применяли меченые антитела против GPIIb (CD41a) (Invitrogen eBioscience, США). Для оценки функционального состояния плотных гранул использовали мепакрин. Активацию тромбоцитов осуществляли коллагеном (ООО «Технология-Стандарт»). Для разведения образцов использовали фосфатно-солевой буфер (Bio-Rad, США), который перед началом работы фильтровали через шприцевой фильтр 0,22 мкм.

Все измерения выполнены на проточном цитометре «CytoFlex» (Beckman Coulter, США) с фиолетовым, синим и красным твердотельным лазерами. Результаты получали и обрабатывали с помощью программы «CytExpert». Для установления размеров применяли калибровочные шарики: 1,0 и 2,0 мкм из набора «Flow Cytometry Sub-micron Particle Size Reference Kit, Green Fluorescent» (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с инструкциями производителя. Для исключения взаимного засвечивания от флуорофоров данной панели предварительно проводили компенсационный эксперимент с помощью набора «VersaComp Antibody Capture Beads» (Beckman Coulter, США).

После пробоподготовки богатую тромбоцитами плазму разводили фосфатно-солевым буфером. После разведения в образец добавляли мепакрин и инкубировали смесь в течение 30 мин в темном месте. Далее тромбоциты активировали добавлением коллагена. Пробы инкубировали 10 мин. После этого окрашивали загруженные мепакрином тромбоциты антителами к CD41 и инкубировали смесь еще в течение 20 мин. Далее окрашенную пробу разбавляли буфером и проводили измерение. Для неактивированных тромбоцитов методика отличалась лишь отсутствием стадии активации. Для установления локальных особенностей пробоподготовки и уточнения нормальных диапазонов изучаемых параметров цитометрии были изучены тромбоциты у 25 здоровых добровольцев.

Больная В. О., 1985 г. рождения, обратилась в Алтайский центр патологии гемостаза для уточнения диагноза. На момент осмотра предъявляла жалобы на обильные и продолжительные месячные, носовые и десневые кровотечения, легкое образование синяков, кровотечение после удаления зубов, родов. В детском возрасте носовые кровотечения были чаще, по информации из медицинской документации ранее было обнаружено снижение содержания в крови антигена фактора фон Виллебранда — до 36 %, в связи с чем больная наблюдалась гематологом с диагнозом «болезнь Виллебранда». Со слов больной, для профилактики геморрагий использовала фактор свертывания крови VIII без существенного эффекта. Из хронических заболеваний отмечала двусторонний пиелонефрит на фоне аномалии развития, частые, до 7–9 раз в течение года, простудные заболевания. При опросе, осмотре и изучении медицинской информации обнаружены проявления дисплазии соединительной ткани: неоднократно были вывихи голеностопных суставов, пролапс митрального клапана, грыжи дисков LV–SI, киста правого яичника, аномалии почек и мочеточника. Наследственность по геморрагическим заболеваниям была не отягощена.

При осмотре кожные покровы были нормальной окраски, имелись единичные петехии без четкой локализации, а также экхимоз в области икроножной мышцы слева, имелся умеренный сколиоз. Подкожная жировая клетчатка была выражена слабо, лимфатические узлы не увеличены. Выслушивалось везикулярное дыхание, хрипов не было, частота дыхания — 15 в мин. Тоны сердца были ясные, ритм — правильный, шумов и акцентов не было, частота сердечных сокращений — 78 в мин, артериальное давление — 110/70. Живот при пальпации был мягкий, безболезненный, печень и селезенка не увеличены.

Для уточнения диагноза проведено исследование системы гемостаза (табл. 1). Было выявлено снижение агрегации тромбоцитов лишь на адреналин-индуктор. Не обнаружено снижения концентрации антигена и активности фактора фон Виллебранда, а также недостаточности коагуляционных факторов, активность фибринстабилизирующего фактора не была снижена. Кроме того, выполнено исследование клеток периферической крови с целью определения размера тромбоцитов и наличия включений в лейкоциты, при котором не было обнаружено гигантских форм тромбоцитов.

Значимых нарушений коагуляционного гемостаза у больной с геморрагическими проявлениями не обнаружено, имелась лишь умеренная дисфункция тромбоцитов. Было выполнено исследование морфологии тромбоцитов при помощи электронной микроскопии. Исследованы 4 сетки Mesh 200. Определялись многочисленные тромбоциты округлой формы, расположенные поодиночке и малыми скоплениями. Размер тромбоцитов был незначительно увеличен: средний размер на подложке — 3,85–4,33 мкм; элементы канальцевой системы — немногочисленные, мелкие, грануломер скудный, плотные гранулы мелкие, располагались преимущественно на границе грануломера. Тромбоциты были с выраженными элементами грануломера, единичные. Немногочисленные агрегаты тромбоцитов, а также тромбоциты с явлениями распластывания, активации и дегрануляции в исследовании не учитывали. Среднее количество плотных гранул в одном тромбоците было 1,43, что существенно ниже нормы (норма — более 4,9).

Дополнительно для подтверждения диагноза было проведено исследование способности тромбоцитов к накоплению и секреции мепакрина до и после их активации, которую оценили с помощью метода проточной цитометрии. Для отобранной популяции CD41+ исследовали интенсивность свечения до и после загрузки тромбоцитов мепакрином, а также после активации коллагеном загруженных мепакрином тромбоцитов. Появление свечения для CD41-положительных событий свидетельствовало о наличии плотных гранул в тромбоцитах и их функциональной способности к накоплению субстанций, в том числе мепакрина. После активации тромбоцитов оценили уменьшение количества положительных событий CD41+/FITC+, за счет выделения мепакрина тромбоцитами. Границу контроля (n = 25) для положительных событий проводили по неокрашенным образцам. При исследовании образцов богатой тромбоцитами плазмы в группе здоровых добровольцев положительные события после загрузки тромбоцитов мепакрином были в диапазоне 15–40 % и снижались в среднем до 5 % после активации тромбоцитов. У больной было получено снижение мепакриновой флуоресценции для CD41-положительных событий до 1,94 %, что свидетельствовало о нарушении функционирования плотных гранул тромбоцитов (рис. 2). После активации тромбоцитов коллагеном положительные события CD41+/FITC+ у больной были 1,09 % (рис. 3).

На основании полученных данных (уменьшение количества плотных гранул при электронной микроскопии, снижение мепакриновой флуоресценции для CD41-положительных событий) больной был установлен диагноз: «Тромбоцитопатия: дефицит плотных гранул, дисплазия соединительной ткани по типу недифференцированной». Были даны рекомендации по использованию ингибиторов фибринолиза, осмотр гинеколога для решения вопроса о применении гормональных контрацептивов и др.

Дифференциация многочисленных вариантов тромбоцитопатий чрезвычайно затруднена в клинической практике вследствие недостаточной технической оснащенности гематологических лабораторий. Синдромальные формы ДПГ легче распознать, поскольку у таких больных имеется сопутствующая клиническая симптоматика (глазокожный альбинизм, иммунодефицит и другие нарушения) [20]. Изолированный ДПГ тромбоцитов диагностировать намного сложнее, при исследовании плазменного гемостаза не обнаруживаются какие-либо изменения, агрегационная функция тромбоцитов не всегда нарушена. Методы диагностики этого заболевания плохо стандартизированы, поэтому подавляющая часть клинических лабораторий не оценивают количество гранул тромбоцитов. Ограниченный перечень диагностических методик и низкая техническая оснащенность клинических лабораторий закономерно ведут к тому, что больных изолированным ДПГ тромбоцитов называют больными болезнью, «подобной болезни Виллебранда» (vWD-like), поскольку оба состояния проявляются одинаковыми симптомами [21]. В описываемом нами клиническом примере больная также длительное время наблюдалась гематологом с диагнозом «болезнь Виллебранда».

Исследование тромбоцитов методом проточной цитометрии было рекомендовано Международным обществом специалистов по тромбозу и гемостазу в качестве инструмента для диагностики нарушений функции тромбоцитов, в том числе ДПГ [15]. Накопление и высвобождение мепакрина плотными гранулами тромбоцитов также оценивают при помощи проточной цитометрии. В лаборатории патологии гемостаза г. Барнаула разработана методика диагностики ДПГ тромбоцитов при помощи проточной цитометрии, предварительные результаты ее внедрения (исследование 42 больных с геморрагическими проявлениями) весьма обнадеживают, результаты клинической апробации этого современного диагностического метода будут представлены в очередной публикации.

Отсутствие возможности оценить плотные гранулы тромбоцитов у больных с рецидивами разных локализаций является причиной того, что в ряде клинических ситуаций больные с выраженным геморрагическим синдромом остаются без правильного диагноза и лечения. Представленное клиническое наблюдение демонстрирует, что исследование накопления мепакрина в тромбоцитах методом проточной цитометрии позволяет эффективно обнаружить ДПГ тромбоцитов. Кроме того, изучение поглощения и высвобождения мепакрина тромбоцитами на проточном цитометре имеет перспективное значение в диагностической практике гематолога, поскольку позволяет дифференцировать дефицит плотных гранул и дефект секреции (нарушение реакции высвобождения гранул).