ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДА DSP30 В СОЧЕТАНИИ С ИНТЕРЛЕЙКИНОМ-2 ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ЛИМФОЛЕЙКОЗОМ

Введение

На долю хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) при­ходится около четверти случаев всех лейкозов и неходжкинских лимфом среди взрослого населения европейских стран [1]. ХЛЛ отличается гетерогенно­стью клинических проявлений — от бессимптомного или медленно прогрессирующего до агрессивного течения с показаниями к началу специфической терапии [1, 2]. Для стратификации больных на группы риска и определения подходов к лечению применяются раз­личные параметры: системы стадирования по Binet и Rai, возраст, время удвоения абсолютного количе­ства лимфоцитов, концентрация р2-микроглобулина, экспрессия CD38 и ZAP70, мутации генов тяже­лых цепей иммуноглобулинов (мутационный статус) и цитогенетические нарушения [1, 3]. В клинической практике используется международный прогностиче­ский индекс (МПИ, CLL-IPI), для которого необходи­мо исследование делеции 17р13/ТР53. Однако, соглас­но рекомендациям международной рабочей группы по исследованию ХЛЛ (iwCLL), для оценки прогноза важно использовать данные о других генетических на­рушениях [1].

Применение флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) с использованием ДНК-зондов к локусам из­вестных хромосомных аберраций позволяет выяв­лять хромосомные нарушения у 80 % больных ХЛЛ. Наиболее часто встречающимися хромосомными аберрациями являются делеция 13q14 — 51—57 % случаев, делеция 11q22/ATM — 12—20 %, трисомия хромосомы 12 — 16 %, делеция 17р13/ТР53 — 7 % [4, 5]. В 2000 г. Dohner и соавт. [5] предложили иерар­хическую прогностическую модель ХЛЛ на основа­нии анализа общей выживаемости больных с харак­терными хромосомными аберрациями, выявленных при FISH-исследовании. Медиана общей выживае­мости в группе с делецией 17р составила 32 месяца, с делецией 11q — 79 месяцев, с трисомией хромосо­мы 12 — 114 месяцев, с отсутствием аберрацией — 111 месяцев, с изолированной делецией 13q — 133 ме­сяца [5]. На сегодняшний день иерархическая модель ХЛЛ сохраняет свою актуальность [6]. Однако изме­нения кариотипа при ХЛЛ не ограничиваются этими хромосомными нарушениями.

Выявление хромосомных аберраций при ХЛЛ с по­мощью стандартного цитогенетического исследования (СЦИ) затруднено в связи с крайне низкой митоти­ческой активностью опухолевых В-лимфоцитов [7]. Применение стандартных стимуляторов деления В-лимфоцитов, таких как липополисахарид (LPS) и 12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (TPA), незна­чительно увеличивает количество делящихся опухо­левых клеток. Клональные хромосомные аберрации выявляются не более чем у половины больных [7—9].

В исследованиях Decker и соавт. [10] было показа­но иммуностимулирующее влияние на деление клеток ХЛЛ CpG-олигонуклеотида DSP30 за счет актива­ции внутриклеточных сигнальных путей, приводящей к пролиферации опухолевых В-клеток, продукции цитокинов, секреции иммуноглобулина на поверхности клетки и экспрессии таких молекул, как CD25, CD80, CD86. Увеличение на мембране клеток ХЛЛ костимулирующих молекул CD80, CD86 приводит к актива­ции Т-лимфоцитов, которые способствуют формиро­ванию специфического микроокружения опухолевых В-лимфоцитов [11]. Молекула CD25 представляет собой вариабельный домен комплекса рецептора к ин­терлейкину-2 и определяет высокое сродство к этому цитокину. Добавление интерлейкина-2 (IL-2) при сти­муляции клеток CpG-олигонуклеотидом DSP30 уси­ливает пролиферацию клеток ХЛЛ [10, 12].

В ряде клинических исследований была показана эффективность использования сочетания CpG-DSP30 и IL-2 в качестве стимулятора деления В-лимфоцитов для исследования кариотипа больных ХЛЛ [4, 13]. В исследовании Haferlach и соавт. [4] при стиму­лировании DSP30 и IL-2 СЦИ успешно выполнено 98 % больным, из них аберрантный кариотип выявлен в 83 % случаев и комплексные нарушения кариоти- па (3 и более хромосомных нарушения) обнаружены в 21 % случаев. Результаты наших предыдущих иссле­дований и данные литературы свидетельствуют о неза­висимом неблагоприятном прогностическом значении комплексных нарушений кариотипа [9, 14, 15].

Наличие делеции 17р13/ТР53 является неблаго­приятным прогностическим фактором. Потеря гена ТР53, выявляемая при FISH-исследовании у боль­ных ХЛЛ, коррелирует с коротким временем до на­чала терапии, низкой общей выживаемостью и рези­стентностью к стандартной иммунохимиотерапии [16—18]. Применение новых таргетных препаратов, таких как ибрутиниб и венетоклакс, улучшает эффек­тивность лечения больных с делецией 17р13 [19—21]. В ряде исследований показана высокая ассоциация делеции 17р с комплексным кариотипом: в 65—80 % случаев делеция 17р выявляется в составе комплекс­ного кариотипа [4, 14]. Однако в исследовании Thomp­son и соавт. [14] многофакторный анализ результатов лечения ибрутиниб-содержащими схемами больных с резистентным и рецидивирующим течением ХЛЛ показал независимое негативное влияние на бессо- бытийную и общую выживаемость комплексного кариотипа вне зависимости от наличия делеции 17р, выявленной при FISH-исследовании. В работе Ander­son и соавт. [22] показано, что комплексный кариотип является доминирующим фактором риска прогрессии ХЛЛ у больных при лечении венетоклаксом.

Ряд исследователей выделяет в отдельную группу риска больных ХЛЛ с выявленными при кариотипировании транслокациями [15, 23, 24]. В работе Mayr и соавт. [25] впервые было показано, что наличие лю­бых транслокаций неблагоприятно влияет на течение ХЛЛ. Транслокации встречаются примерно у 30 % больных ХЛЛ как в составе комплексного кариотипа, так и в виде единственного нарушения [15, 23, 24]. В кариотипе они могут быть представлены в виде сбалансированных и несбалансированных трансло­каций. [26]. В составе комплексного кариотипа чаще встречаются несбалансированные транслокации. В исследовании Rigolin и соавт. [24] было выявле­но, что несбалансированные транслокации влияют на общую выживаемость и время до начала терапии у больных ХЛЛ.

Особое внимание среди сбалансированных пере­строек занимают транслокации с вовлечением генов тя­желой цепи иммуноглобулинов (IGH) в регионе 14q32. Данные транслокации встречаются в 5—7 % случаев ХЛЛ и ассоциируются с неблагоприятным прогнозом. По мнению авторов, больные с транслокациями IGH представляют собой отдельную группу с морфологи­ческими особенностями, такими как плазматизация цитоплазмы опухолевых лимфоцитов и наличие про­лимфоцитов [26—28].

Таким образом, актуальным остается исследование кариотипа больных ХЛЛ для изучения спектра и ча­стоты встречаемости отдельных хромосомных анома­лий и выявления комплексных нарушений кариотипа для формирования групп риска и разработки индиви­дуальных подходов к лечению.

Целью настоящей работы являлась оценка эффек­тивности использования DSP30 в сочетании с IL2 при культивировании клеток крови/костного мозга/ лимфоузла больных ХЛЛ для выявления клональных нарушений кариотипа.

Материалы и методы

В исследование включены 50 больных ХЛЛ, наблю­давшихся в ФГБУ НМИЦ гематологии Минздрава России в период с марта 2016 по декабрь 2017 г.: 34 муж­чины и 16 женщин в возрасте от 35 до 86 лет (медиа­на возраста — 58 лет). Диагноз ХЛЛ был установлен на основании данных проточной цитометрии. На опу­холевых клетках выявлялась экспрессия CD5, CD19, CD23, слабая экспрессия CD20 и поверхностного им­муноглобулина. СЦИ и флюоресцентная гибридиза­ция in situ (FISH) выполнены 31 больному до начала терапии и 19 больным, получавшим лечение, с рези­стентным и рецидивирующим течением заболевания. Всем 50 больным выполнено СЦИ и FISH.

СЦИ. При культивировании в 39 случаях исследо­вали клетки периферической крови, в 10 — клетки костного мозга, в 1 — клетки биоптата лимфоузла. Клетки культивировали в питательной среде RPMI 1640 с добавлением эмбриональной телячьей сыво­ротки в соотношении 4:1, L-глутамина в конечной концентрации 0,584 мг/мл, антибиотика гентами- цина в конечной концентрации 0,28 мг/мл с двумя комбинациями митогенов: (1) DSP30 + IL2 — имму­ностимулятором деления олигонуклеотидом DSP30 в конечной концентрации 2 нмоль/мл (TibMolBiol, Германия) и 200 Ед/мл интерлейкином-2 (IL2, Sigma- Aldrich, США) (DSP30 + IL2); (2) LPS + TPA — стиму­лятором деления В-лимфоцитов липополисахаридом LPS E.coli (SIGMA, США) в конечной концентрации 0,01мг/мл и ТРА в конечной концентрации 0,01 нг/мл (SIGMA, США). Культивировали при температуре 37 °С в течение 72 часов, последние 17 часов с добавле­нием колцемида (KaryoMAX, Gibco, США) 0,15 г/мл среды. Обработку гипотоническим раствором, фик­сацию клеток и приготовление препаратов хромосом проводили по стандартной методике. 46 больным были выполнены 2 серии постановки культур, 4 больным — только с DSP30 и IL2. G-дифференциальную окраску хромосом осуществляли по методике Seabright, 1971 г. [29] с модификациями. Кариотип описывали в соот­ветствии с Международной цитогенетической номен­клатурой ISCN, 2016 [30]. По возможности анализи­ровали 20 метафаз.

FISH. Мононуклеары периферической крови (костного мозга) выделяли на градиенте плотности 1,077 раствора Lympho Separation Medium (LSM, “ISN Biomedicals"). При FISH-анализе исследова­ли мононуклеары периферической крови у 48 боль­ных, костного мозга — у одного больного, клетки биоптата лимфоузла — у одного больного. В работе использовали многоцветный зонд: P53(TP53)/ATM and D13S319/13qter/12cen CLL PROFILER Kit (“Aquarius®Cytocell", Великобритания). Для подтвер­ждения перестройки локуса гена тяжелой цепи Ig (14q32) 4 больных использовали ДНК-зонд: Vysis LSI IGH Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe (Ab­bott, США). Для подтверждения перестройки локуса гена легкой цепи (2p11) 1 больному выполнено FISH- исследование с ДНК-зондом XL 2p11 IGK BA Break Apart Probe (Metasystems, США).

Статистический анализ. Статистический анализ про - водили с использованием программы для статистиче­ской обработки данных R 3.5.0 (Lucent Technologies, США) и Excel 2016 (Microsoft, США). Для сравнения результатов кариотипирования двух серий культур с DSP30 + IL2 и LPS + TPA применяли парный тест Манна — Уитни. Различия считали статистически значимыми приp < 0,05.

Результаты

В результате культивирования с DSP30 + IL2 СЦИ успешно выполнено 41 (82 %) больному (табл. 1). Аберратный кариотип выявлен у 36 (72 %) больных: у 15 (30 %) из них была найдена одна аберрация, у 8 (16 %) — две и у 13 (26 %) — три или более аберра­ций (комплексные нарушения кариотипа) (рис. 1). Нормальный кариотип выявлен у 5 (10 %) больных, но у 3 из них при FISH-исследовании были выявлены аберрации: у 2 — делеция 13q, у одного — делеция 11q (табл. 3, № 14, 31, 40). В одном случае при отсутствии митозов в культуре с DSP30 + IL2 хромосомные нару­шения были выявлены при культивировании с LPS + TPA (табл. 3, № 48).

При культивировании с LPS + TPA кариотипирова- ние успешно выполнено 38 (83 %) больным (табл. 1). Аберрантный кариотип в культуре с LPS + TPA выявлен только в 16 (35 %) случаях: в 7 (15 %) из них найдена одна аберрация, в 4 (9 %) — две и в 5 (11 %) — комплексные нарушения кариотипа (рис. 1). Нормаль­ный кариотип выявлен у 22 (48 %) больных, но у 14 из них при культивировании с DSP30 + IL2 были вы­явлены аберрации. У 14 (28 %) больных с нормальным кариотипом в культуре с LPS + TPA при культиви­ровании с DSP30 + IL2 выявлены клональные хро­мосомные аберрации: у 4 — комплексные нарушения кариотипа, у 3 — делеция 13q (у одного — с t(13;18) (q14;p11)), у 2 — трисомия 12, у одного — делеция 17p, у одного — делеция 11q и 13q, у одного — делеция 11q, у одного — делеция 6q, у одного — сбалансированная и несбалансированная транслокации с участием хро­мосомы 8 (табл. 3, № 3, 12, 13, 15, 17, 20, 21, 23, 24, 37, 39, 41, 42, 49).

У 7 из 14 больных в культуре с LPS + TPA хро­мосомные аберрации были выявлены только в одной из 20 метафаз (неклональные нарушения), при этом в культуре с DSP30 + IL2 они обнаружены в среднем в 60 % метафаз.

Показано достоверное различие между количе­ством метафаз с хромосомными аномалиями, полу­ченными при культивировании с DSP30 + IL2 и LPS + TPA (критерий Вилкоксона, p = 0,000023). При FISH- исследовании хромосомные нарушения были выявле­ны у 41 из 50 больных (82 %): у 32 — одна аберрация, у 7 — 2 аберрации, у 2 — комплексный кариотип.

В группе больных до начала терапии хромосом­ные аберрации выявлены у 21 из 31 (68 %) больного в культуре с DSP30 + IL2 и у 8 (26 %) в культуре с LPS + TPA. Комплексные нарушения кариотипа в культуре с DSP30 + IL2 выявлены в 5 случаях (16 %), в культу­ре с LPS + TPA — в одном случае. В группе больных, получающих терапию, у большинства из которых от­мечалось рецидивирующее и резистентное течение, хромосомные аберрации выявлены у 16 из 19 (84 %) в культуре с DSP30 + IL2 и у 7 (44 %) в культуре LPS + TPA. Комплексные нарушения кариотипа в культуре с DSP30 + IL2 выявлены у 8 (42 %), в культуре с LPS + TPA — у 4 (25 %).

Частота выявления комплексного кариотипа в культу­ре с DSP30 + IL2 составила 13 (26 %), в культуре с LPS + TPA — 5 (11 %), методом FISH — 2 (4 %) (табл. 2). Из 13 больных c комплексными нарушениями в культу­ре с DSP30 + IL2 при FISH-исследовании аберрации или не были выявлены (3 случая), или выявлены 1—2 аномалии (8 случаев). Делеция 17p методом FISH опре­делена менее чем у половины больных с комплексными нарушениями кариотипа (5 из 13), у 4 из них изолиро­ванно. У 6 из 8 больных с комплексным кариотипом без делеции 17p обнаружена делеция 11q (табл. 2).

При СЦИ были выявлены различные структурные аберрации, не входящие в стандартную диагностиче­скую панель при FISH-исследовании. В 11 случаях выявлены несбалансированные транслокации, в 6 — сбалансированные транслокации, (в 4 из них — с во­влечением локуса генов IGH/14q32), в 6 — сочетания сбалансированных и несбалансированных трансло­каций. Несбалансированные транслокации в повто­ряющихся точках разрыва хромосом (2q, 7p, 8р, 17p, 15q, 19q) чаще выявлялись в составе комплексного кариотипа — 10 из 17 (59 %) случаев. Среди сбаланси­рованных транслокаций кроме транслокаций с вовле­чением локуса IGH/14q32 выявлены следующие: t(1;4) (?p31;q33-q34), t(2;7)(q31-32;q36), t(2;12)(q13;p12-13), t(12;18)(q10;p10), t(13;18)(q14;p11), t(13;21)(q21;q22), t(14;17)(q10;q10).

В кариотипе у 4 больных выявлены сбалансирован­ные транслокации, затрагивающие локус генов IGH (14q32): t(6;14)(p21;q32), t(9;14)(p13;q31-32), t(2;14)(p14- 15;q31-32), t(14;19)(q32;q13) (табл. 3, № 5, 10, 20, 36). Во всех 4 случаях перестройка локуса генов IGH под­тверждена методом FISH.

У 5 больных выявленные при FISH делеции 13q14, 11q22 и 17p13 по результатам СЦИ сопровождались сбалансированными или несбалансированными транслокациями в этих локусах: у 2 больных в кариотипе выявлены несбалансированные транслокации с вовлечением локусов 11q22 и 17p13 (табл. 3, № 13, 24); у одного больного в разных субклонах выявлены делеция 13q14 и t(13;18) (q14;p11) (табл. 3, № 49); у 2 больных в разных субклонах выявлены различные хромосомные аберрации — делеции, сбалансированные и несбалансированные транслокации с вовлечением локуса 17p13/ТР53 (табл. 3, № 7, 12). У одного больного (табл. 3, № 7) с потерей локуса гена ТР53 по результатам FISH-исследования в двух культурах выявлены различные хромосомные аберрации с участием хромосомы 17: в культуре с DSP30 + IL2 выявлена t(14;17)(q10;q10), в культуре с LPS + TPA — несбалансированная t(12;17)(q24;q21) и моносомия 17. У одного больного с трисомией 12, выявленной при FISH-исследовании, одна из хромосом 12 по результатам СЦИ вовлечена в t(12;18)(q10;p10) (табл. 3, № 21). У одного больного при отсутствии трисомии по результатам FISH в культуре с DSP30 + IL2 выявлена несбалансированная t(12;16)(q14;q23) — случай частичной трисомии 12, то есть наличие дополнительного длинного плеча хромосомы 12, подтвержденное при FISH с использованием ДНК-зонда к локусу гена MDM2/12q15 (табл. 3, № 16).

Выявляемость характерных для ХЛЛ хромосомных нарушений методом FISH, методом СЦИ при культивировании с DSP30 + IL2 и методом СЦИ при культивировании с LPS + TPA составила: для делеции 13q14 — 38 % (10 % — биаллельная делеция), 14 и 13 %; для делеции 11q22 — 34, 26 и 4 %; для трисомии 12 — 14, 16 и 8 %; для делеции 17p13 — 18, 14 и 8 % соответственно. Комплексные нарушения в кариотипе при культивировании с DSP30 + IL2 выявлены у 13 больных (26 %), при культивировании с LPS +
TPA — у 5 больных (11 %) и лишь у 2 больных (4 %) при исследовании методом FISH (табл. 2).

Таким образом, при использовании двух методов исследования, СЦИ и FISH, увеличилась частота выявления хромосомных аберраций. При отсутствии митозов (9 больных) и хромосомных аберраций (5 больных) при кариотипировании DSP30 + IL2 были определены хромосомные аберрации методом FISH у 10 из них: у 6 — делеция 13q, у 3 — делеция 11q, у одного — делеция 17р (табл. 3, № 9, 14, 18, 26, 27, 30, 31, 32, 40, 44). В 9 случаях отсутствия хромосомных нарушений при FISH-исследовании были выявлены хромосомные нарушения: в культуре с DSP30 + IL2 в 5 случаях и в культуре с LPS + TPA в одном случае, среди них комплексные нарушения кариотипа, t(6;14)(p12;q32), делеция 6q, несбалансированная t(12;16)(q14;q23) и делеция 1q (табл. 3, № 5, 16, 19, 23, 33, 46, 48). На рисунке 2 представлен пример комплексного кариотипа, выявленного при культивировании с DSP30 + IL2 (культивирование с LPS + TPA не проводилось из-за малого количества исследуемого материала). При FISH-исследовании у данного больного хромосомные аберрации не выявлены
(табл. 3, № 46).

Обсуждение

СЦИ является важным методом, позволяющим, в отличие от FISH-исследования, анализировать весь кариотип, выявлять диагностические и прогностиче­ски значимые хромосомные нарушения и предостав­ляющим дополнительную информацию о патогенезе опухолевых заболеваний системы крови. Проведение СЦИ у больных ХЛЛ затруднено в связи с низкой митотической активностью опухолевых В-лимфоцитов. CpG-олигонуклеотид DSP30 в сочетании с интерлейкином-2 обладает способностью стимули­ровать к делению опухолевые клетки ХЛЛ. Результа­ты проведенного исследования показали, что эффек­тивность СЦИ у больных ХЛЛ более чем в два раза выше при культивировании с DSP30 и IL2, чем со стандартными В-клеточными митогенами LPS и TPA: аберрантный кариотип выявлен у 36 (72 %) и 16 (35 %) больных соответственно.

Следует отметить, что у 14 больных (28 %) хромосом­ные аберрации были обнаружены только в культуре с DSP30 + IL2, в то время как в культуре с LPS + TPAу 7 из 14 выявлен нормальный кариотип и еще у 7 некло­нальные нарушения, то есть хромосомные аберрации выявлены в одной из 20 метафаз. При этом при культи­вировании с DSP30 + IL2 хромосомные перестройки были выявлены в среднем в 60 % метафаз, что подтвер­ждало клональную природу хромосомных аберраций. В настоящем исследовании показано достоверное раз­личие между количеством метафаз с хромосомными аномалиями, полученными при культивировании с DSP30 + IL2 и LPS + TPA.

Комплексный кариотип является неблагоприятным фактором прогноза у больных ХЛЛ. Согласно дан­ным литературы, комплексный кариотип сохраняет неблагоприятное прогностическое значение у больных ХЛЛ, получающих как стандартную химиотерапию, так и терапию новыми препаратами таргетного дей­ствия, такими как ибрутиниб и венетоклакс [14, 22]. Описано, что комплексные нарушения кариотипа коррелируют с коротким временем до начала терапии и низкой общей выживаемостью [24]. В настоящем исследовании сравнение результатов кариотипирования и FISH-анализа показало наибольшую выявляе- мость комплексного кариотипа при культивировании с DSP30 + IL2 — 13 (26 %) случаев, что в два раза пре­вышает частоту выявления в культуре с LPS + TPA — у 5 (13 %) и методом FISH — у 2 (4 %) больных. Частота выявления комплексного кариотипа при кариотипировании с DSP30 + IL2 в группе больных, получающих терапию, у которых было резистентное и рецидивиру­ющее течение заболевания, и в группе больных до на­чала терапии составила 84 и 16 % соответственно.

В литературе описана взаимосвязь комплексных на­рушений кариотипа и делеции 17p и 11q [15, 23]. Имен­но с данной корреляцией многие исследователи свя­зывают неблагоприятное прогностическое значение комплексных нарушений кариотипа [4, 15, 31]. Однако в работах Thompson и соавт. [14] и Rigolin и соавт. [24] показано, что вне зависимости от наличия делеции 17р комплексный кариотип является независимым неблаго­приятным фактором прогноза. В проведенном нами ис­следовании делеция 17p методом FISH была определена у 5 (38,5 %) из 13 больных с комплексным кариотипом. В 5 из 8 случаев с комплексными нарушениями без де­леции 17p в кариотипе присутствовала делеция 11q.

Ряд исследователей выделяет в отдельную группу риска больных ХЛЛ с выявленными при кариотипи- ровании транслокациями [15, 23, 24]. В работе Mayr и соавт. [25] впервые было показано, что наличие лю­бых транслокаций имеет неблагоприятное значение при ХЛЛ. Несбалансированные транслокации мо­гут быть выявлены в составе комплексного кариотипа в 35—73 % случаев [15, 24]. В нашем исследовании наиболее часто несбалансированные транслокации в повторяющихся точках разрыва хромосом (2q, 7p, 8р, 17p, 15q, 19q) выявлялись в составе комплексного кариотипа — у 10 из 17 (59 %). В ряде исследований показано, что наличие несбалансированных перестроек в составе комплексного кариотипа связано с укороче­нием времени до начала терапии и низкой общей вы­живаемостью [15, 24].

Среди сбалансированных транслокаций у 4 больных выявлены транслокации, затрагивающие локус генов IGH (14q32): t(6; 14)(p21;q32), t(9;14)(p13;q31-32), t(2;14) (p14-15;q31-32), t(14;19)(q32;q13), что подтверждено ме­тодом FISH с использованием зонда к локусу генов IGH. По данным литературы, транслокации с вовле­чением локуса генов IgH встречаются в 5—7 % случаев ХЛЛ и ассоциируются с неблагоприятным прогнозом [4, 26, 27].

В данной работе показано, что выявляемые при FISH делеции 13q14, 11q22, 17p13 могут в отдельных случа­ях сопровождаться при СЦИ сбалансированными или несбалансированными транслокациями в этих локусах, что согласуется с данными других авторов [4, 15]. Были выявлены делеция 13q и t(13;18)(q14;p11) в разных субклонах, несбалансированные транслока­ции с вовлечением локусов 11q22 и 17p13, различные хромосомные аберрации — делеции, сбалансирован­ные или несбалансированные транслокации с вовле­чением локуса 17p13/TP53. Возможно, что все случаи объединяет схожее развитие клональной эволюции: возникновение в исходном клоне делеции, затем в ходе опухолевой прогрессии образование субклонов со сба­лансированными и несбалансированными транслока­циями в известной точке разрыва хромосомы и в це­лом нарастание геномной нестабильности.

Частичная трисомия хромосомы 12 в виде несба­лансированной транслокации t(12;16)(q14;q23) была определена только при культивировании ввиду того, что в набор для проведения FISH-исследования включена проба, которая представляет собой ДН- К-зонд к центромерному региону хромосомы 12. Для подтверждения частичной трисомии хромосо­мы 12 мы использовали ДНК-зонд к локусу гена MDM2/12q15. В литературе описано, что трисомия хромосомы 12 может быть представлена как в виде полной, так и в виде частичной трисомии [8, 32].

Определен минимальный участок дупликации — регион q13q22, в котором ведется поиск генов-кан­дидатов, предположительно среди них HIP1R, MYF6, ANAPC5, E2F1, BAX, P27, CDK4 и ген MDM-2 [33-35].

Считается, что нет отличия в прогностическом значе­нии полной и частичной трисомии ввиду того, что частичная трисомия происходит за счет дупликации региона q13q22 хромосомы 12 [8].

Результаты СЦИ и FISH различаются по частоте выявленных хромосомных аномалий. В настоящем исследовании наиболее часто встречающейся хромосомной аберрацией по результатам FISH- исследования была делеция 13q14, которая выявлена в 19 (38 %) случаев, из них в 5 — биаллельная деле­ция. При СЦИ делеция 13q была определена только у 7 (14 %) пациентов в культуре с DSP30 + IL2 и у 2 (4 %) — в культуре с LPS + TPA. Описано, что де­леция 13q14 более чем в половине случаев является субмикроскопической и не определяется при СЦИ [13, 36, 37]. Полученные данные согласуются с ре­зультатами других исследований: делеция 13q была определена при СЦИ с использованием DSP30 + IL2 менее чем в половине случаев по сравнению с частотой выявления методом FISH (14 и 38 % соответственно). По данным литературы, у больных ХЛЛ до начала терапии делеция 13q14 при FISH- анализе выявляется в 55-57 % [4, 5].

В проведенном исследовании частота выявления де- леции 11q в культуре DSP30 + IL2, LPS + TPA и мето­дом FISH составила 13 (26 %), 6 (13 %) и 17 (34 %). Со­гласно литературным данным, делеция 11q на момент диагностики определяется у 12-19 % больных ХЛЛ методом FISH [4, 5, 9]. Можно предположить, что бо­лее низкая выявляемость делеции 13q и более высокая частота делеции 11q связана с включением в исследо­вание больных с прогрессией и рефрактерным тече­нием заболевания, которые характерны для больных с делецией 11q и не свойственны для больных с делецией 13q. По данным FISH, делеция 11q выявлена у 37 % (7 из 19) больных с рецидивирующим и рефрактерным течением, из них у 3 — в составе комплексного кариотипа. На момент диагностики делеция 11q определя­лась у 23 % (7 из 31) больных ХЛЛ.

Таким образом, при совместном использовании двух методов исследования, СЦИ и FISH, значительно уве­личивается частота выявления хромосомных аберра­ций. Выполнение СЦИ с использованием при культи­вировании DSP30 и IL2 не заменяет FISH, но является необходимым методом исследования, позволяющим выявлять дополнительные хромосомные аберрации, в том числе транслокации и, что особенно важно, выделять группу больных самого неблагоприятного прогноза ХЛЛ с комплексными нарушениями для разработки терапевтической тактики.