Preview

Гематология и трансфузиология

Расширенный поиск

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОДГРУПП А1 И А2 АНТИГЕНА А СИСТЕМЫ АВ0: БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОСНОВА И СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ СТРАТЕГИЯ

https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-504-515

Полный текст:

Аннотация

Введение. Определение слабых вариантов антигена А и их дифференциация необходимы для правильного подбора эритроцитсодержащих сред при гемотрансфузиях. Для этого в сочетании с реактивами анти-А, которые одинаково реагируют с антигенами А1 и А2, применяются селективные реактивы анти-А1, реагирующие только с антигеном А1 . Поскольку внутри самих подгрупп наблюдается вариабельность экспрессии антигена А, а установленного стандарта для реагентов и методик не существует, трактовка полученных результатов зачастую вызывает затруднения.

Цель: создать стратегию определения вариантов антигена А с применением доступных реагентов в реакции агглютинации.

Методы. Сравнение эффективности четырех анти-А1 - и двух анти-Н-реагентов проведено на 23 образцах крови с группой А2 и А2В и контрольных образцах А1 и А1 В. Использовались два типа анти-А1 -реагентов: лектин Dolychos biflorus и моноклональные антитела. Все реагенты предназначались для реакции прямой агглютинации. Принадлежность эритроцитов к подгруппе А2 была подтверждена генетическим анализом.

Результаты. Показано, что анти-А1 -реагенты не взаимодействовали с эритроцитами А2В, но часто реагировали с эритроцитами А2. Сила реакции с эритроцитами А2 сильно варьировала и была слабее, чем с А1 -эритроцитами, однако вызывала затруднения в установлении подгруппы. Одновременное тестирование с реагентом анти-Н позволяло сделать однозначный вывод о принадлежности крови к подгруппе: сильная реакция указывала на А2, отрицательная или слабая  — на А1 . У двух доноров было отмечено расхождение результатов серологических и молекулярных методов исследования: серологически была определена подгруппа А3, генотипирование выявило аллель АВ0*А1 . В обоих случаях прямое секвенирование показало комбинацию мутантных аллелей, которая дает фенотип А3. При использовании коммерческих наборов для генотипирования методом полимеразной цепной реакции следует учитывать, что праймеры подобраны к наиболее часто встречающимся вариантам и не могут выявить все мутации гена АВ0.

Заключение. Надежная диагностика подгруппы А2 серологическими методами возможна с использованием лектина или моноклональных антител анти-А1 в сочетании с анти-H моноклональным реагентом.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование: исследование не имело спонсорской поддержки.

Для цитирования:


Головкина Л.Л., Каландаров Р.С., Стремоухова А.Г., Калмыкова О.С., Пушкина Т.Д., Сурин В.Л., Пшеничникова О.С., Николаева Т.Л., Оловникова Н.И. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОДГРУПП А1 И А2 АНТИГЕНА А СИСТЕМЫ АВ0: БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОСНОВА И СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ СТРАТЕГИЯ. Гематология и трансфузиология. 2019;64(4):504–515. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-504-515

For citation:


Golovkina L.L., Kalandarov R.S., Stremoukhova A.G., Kalmykova O.S., Pushkina T.D., Surin V.L., Pshenichnikova O.S., Nikolaeva T.L., Olovnikova N.I. DIFFERENTIATION OF THE A1 AND A2 SUBGROUPS OF THE AB0 SYSTEM: BIOLOGICAL BACKGROUND AND SEROLOGICAL STRATEGY. Russian journal of hematology and transfusiology. 2019;64(4):504–515. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-504-515

Введение

Современная концепция безопасности предполагает, что лицам со слабыми вариантами антигена А (А2, А3 и др.), нуждающимся в частых трансфузиях эритро­цитсодержащих компонентов, следует переливать донорские эритроциты, не содержащие антиген А1. Подобный подход обусловлен тем, что при трансфу­зии эритроцитов А больным с антигеном А или дру­гими слабыми вариантами возможно образование аллоиммунных анти-А -антител, а если такие анти­тела уже присутствуют, то существует риск развития посттрансфузионных реакций и осложнений [1-3]. У лиц с ослабленной экспрессией антигена А в крови могут присутствовать природные анти-А -антитела (экстраагглютинины). Анти-А-экстраагглютинины имеют 1-2 % лиц с подгруппой А2 и 25 % лиц с под­группой А2В [4]. Иногда анти-А1 можно обнаружить в сыворотке лиц с другими слабыми подгруппами ан­тигена А. Экстраагглютинины анти-А могут вызывать расхождения в результатах АВ0 тестирования и про­бы на индивидуальную совместимость. Реципиентам с иррегулярными анти-А1-аантителами рекоменду­ется переливать эритроциты, не несущие антиген А1 [5]. На практике это правило часто распространя­ют на всех реципиентов с подгруппой А2 , особенно нуждающихся в частых трансфузиях эритроцитсо­держащих компонентов. Экстраагглютинины анти-А имеют, как правило, низкие титр и авидность, поэто­му их не всегда можно обнаружить при исследовании сыворотки со стандартными эритроцитами в процессе перекрестного АВ0-тестирования. В связи с этим про­блема своевременного выявления больных со слабыми вариантами антигена А остается актуальной.

Антиген А характеризуется высоким полиморфиз­мом, т.е. представлен различными вариантами (под­группами), которые кодируются разными аллелями гена АВ0*А. Генетические основы системы АВ0, а так­же молекулярно-генетические события, приводящие к формированию разнообразных аллельных вариантов гена АВ0':А, подробно освещены в обзорах [6-10]. Две основные подгруппы антигена А — это А и А . Частота встречаемости подгрупп А1 и А2 различна в разных по­пуляциях. У лиц европеоидной расы среди групп А и АВ около 80-88 % принадлежат к А или А В, а остальные 12-20 % — к А2 или А2В [11, 12]. Частота встречаемости антигена Асреди лиц группы А составляет 14,7-17,8 %; частота фенотипа А В среди лиц группы АВ составляет 23,5-26,2 % [13]. Выраженный дисбаланс существует и в других популяциях [14]. Одной из причин такого дисбаланса может быть разное фенотипическое прояв­ление аллеля А(К101) в группах А и АВ: гетерозиготный генотип A(R101)/0 экспрессируется как А:-фенотип, а ге­терозиготный генотип A(R101)/В — как А2В-фенотип, что приводит к возрастанию частоты А2В по сравнению с А2 [15].

Важнейшим различием между А и А фенотипами яв­ляется существенная разница в количестве экспрессиру­емых на эритроците эпитопов антигена А. На эритроци­тах А их около 106, что примерно в четыре раза больше, чем на эритроцитах А2 [16]. Подгруппы слабее А2 (A3, Ax, Am, Ael) встречаются редко и характеризуются дальней­шим уменьшением числа сайтов антигена А на эритро­цитах. Подгруппы часто обнаруживают либо по очень слабой агглютинации, либо по расхождению между ре­зультатами прямого и обратного тестирования эритро­цитов при перекрестном определении группы АВ0.

Помимо количественных, у эритроцитов А и А есть качественные различия. У лиц с группами кро­ви А или А В могут вырабатываться анти-А -антите­ла, однако никогда не бывает наоборот. Это означает, что эритроциты А отличаются от А отсутствием ка­кой-то структуры. Серологическое разделение было подтверждено генетически, когда было показано суще­ствование двух различных ферментов [17]. Фермент А2-гликозилтрансфераза обладает более низкой актив­ностью и имеет болееузкую субстратную специфичность по сравнению с ферментом А1-гликозилтрансферазой.

Эритроциты А1 и А2 одинаково сильно реагируют с современными реагентами анти-А в методе прямой агглютинации. Различие между А - и А2-эритроцитами может быть установлено путем тестирования с анти-Алектином и моноклональными антителами анти-А . Эти реагенты вызывают агглютинацию эритро­цитов А1 и А1В, не реагируют с эритроцитами А2В, но могут вызывать слабую агглютинацию эритроци­тов А2. Установленного стандарта для реагентов и ме­тода не существует, поэтому нередки несоответствия в результатах, полученных с применением различных реагентов и в разных лабораториях [20].

Целью настоящей работы было создать стратегию определения вариантов антигена А с применением до­ступных реагентов в реакции агглютинации.

Материалы и методы

В исследовании использовали образцы крови доно­ров, полученные в отделении заготовки крови ФГБУ «НМИЦ гематологии» МЗ РФ после получения ин­формированного согласия; все тесты проводили после завершения иммуносерологического тестирования и исследования на патогены. Материалом исследова­ний были образцы крови 23 человек со слабым вари­антом антигена А, из которых у 16 человек была груп­па крови А2, у 5 — группа A2B, у 2 — серологически была определена группа A3, а также 12 образцов крови с антигеном А в качестве контроля (из них у 6 человек была группа крови А и у 6 — группа AB).

Применяли следующие методы.

Перекрестное определение группы крови систе­мы АВ0 в реакции агглютинации на плоскости с ис­пользованием Эритротест Цоликлонов анти-А (сер. 423R и 433F) и анти-В (сер 424R) (ООО «Гематолог», Москва) и стандартных эритроцитов групп А1, В, 0 (BioRad, США). Активными компонентами Цоликлонов являются моноклональные антитела класса IgM мыши: клоны А-90/16 и Birma (Цоликлон анти-А вариант R), клоны А-90/16, А-86/3 и 9113D10 (Цоликлон анти-А вариант F), клон В-85/2-В8 (Цоликлон анти-В вариант R).

Определение подгруппы антигена А в реакции аг­глютинации на плоскости с использованием монокло­нального реагента Цоликлона анти-А1 (сер. 261) (кло­ны 1Е3 и 5Е6), Эритротест анти-А: лектина (сер. 259), Цоликлона анти-Нкра (сер. 735) (клон Н-89/8) (ООО «Гематолог», Москва); анти-А1 лектина (сер. 020317В), анти-Н (А2) (сер. 080517С) (клон 10934C11) (ImuMed Antitoxin, Германия); анти-А1-лектина (сер. 118100201) (Bio-Rad, США). Силу реакции оценивали по 4-крестовой системе через 5 мин после смешивания эритро­цитов с реагентом в соответствии с таблицей 1.

 

Таблица 1. Оценка силы реакции гемагглютинации

Table 1. Strength of haemagglutination reaction

Сила реакции

Strength of agglutination

Вид агглютинации

Agglutination type

4+

Полная агглютинация, т.е. один плотный агглютинат

Complete agglutination, i.e. one solid agglutinate

3+

Смесь нескольких крупных и средних агглютинатов

Several large and medium agglutinates

2+

Смесь средних и мелких агглютинатов

А mixture of medium-sized and small agglutinates

1 +

Мелкие агглютинаты

Small agglutinates

+/-

Очень мелкая агглютинация на фоне свободных эритроцитов (смешанная агглютинация)

Weak granularity in the red cell suspension (mixed-field)

-

Отсутствие агглютинации

No agglutination

ДНК-анализ генаАВ0*А выполняли двумя методами: полимеразной цепной реакцией (ПЦР) и прямым сек- венированием. Геномную ДНК выделяли с помощью реактивов фирмы BAG (Германия) по методике произ­водителя и по стандартной методике депротеинизации фенолом после лизиса с протеиназой К. Концентрацию и чистоту ДНК определяли на спектрофотометре. Одна оптическая единица (OD) соответствовала кон­центрации ДНК 50 нг/мкл. Чистота ДНК, определяе­мая по отношению показателей при 260 и 280 нм (OD 260/280), составляла 1,6-1,8, концентрация конечной ДНК - 50-100 нг/мкл.

ПЦР проводили с помощью праймеров для выяв­ления вариантов генов системы АВ0 (AB0-variant kit) фирмы BAG (Германия). Детекцию полученных ре­зультатов осуществляли посредством электрофореза продуктов амплификации в 2%-ном агарозном геле, со­держащем бромистый этидий (1мкг/мл) в TBE-буфере. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом све­те (λ = 310 нм) при помощи транс-иллюминатора в виде полос ярко-оранжевого цвета. Наличие полос ампли­фикации внутреннего положительного контроля сви­детельствовало о корректности проведенной ПЦР Прямое секвенирование проводили по методу Сэнгера с помощью набора реактивов ABIPRISM®BigDyeTMT erminatorv.3.1. У всех образцов секвенировали экзоны 6 и 7 гена АВ0*А.

Результаты

В работе представлены результаты исследования образцов эритроцитов со слабыми вариантами антиге­на А с помощью различных реагентов — анти-А -лектина, анти-А1-моноклональных антител и дополни­тельного реагента — анти-Н-моноклональных антител для демонстрации возможности дифференцирования подгрупп антигена А серологическими методами. Принадлежность эритроцитов к той или иной под­группе была подтверждена генетическим тестирова­нием.

Детальные результаты исследований показаны в та­блице 2. Результаты реакции с Цоликлонами анти-А и анти-В приведены для демонстрации групповой при­надлежности (столбцы 1-3). Группу АВ0 подтвержда­ли перекрестным тестированием, то есть реакцией сыворотки со стандартными эритроцитами А, В, 0 (данные не приведены). Цоликлоны анти-А с индекса­ми R и F отличались по составу и содержали продукты различных клонов. Оба реагента одинаково активно реагировали с подгруппами А1, А2 и А3 (столбцы 1-2), что соответствовало требованиям к реагентам для ру­тинного тестирования.

В таблице 2 приведено сравнение четырех различ­ных анти-А -реагентов, три из которых представляли собой раствор лектина DoLichos biflorus (столбцы 5-7) и один реагент, Цоликлон анти-А , был смесью двух моноклональных антител (столбец 4). Результаты эксперимента и лабораторная практика показа­ли, что все анти-А -реагенты не взаимодействовали с эритроцитами A2B, но часто реагировали с эри­троцитами A2. Лектины анти-А1 производства фирм BioRad и ImuMed (Antitoxin) вызывали крупную аг­глютинацию А - и АВ-эритроцитов, но также явно реагировали (на 1+ — 2+) с большинством образцов эритроцитов А2. Эта реакция была существенно сла­бее, чем с A -эритроцитами, однако могла ввести в за­блуждение, особенно при отсутствии положительных (A) и отрицательных (А) контрольных образцов (эритроцитов A нет в доступных панелях стандарт­ных эритроцитов). Моноклональный реагент анти-А1 реагировал с А2-эритроцитами более избирательно: сила реакции с эритроцитами A2 было слабой (на 1+), но он менее активно реагировал и с эритроцитами А1 и A1B — агглютинация начинала формироваться позд­нее, и сила реакции была не выше 3+.

 

Таблица 2. Результаты серологического и генетического определения подгруппы антигена А; сравнение эффективности и специфичности анти-Al реагентов

Table 2. The results of the serological and genetic determination of the subgroup of antigen A; comparison of the efficacy and specificity of anfi-AI reagents

Эритроциты донора/больного

Red blood cells of donor/patient (№)

Результаты анализа (сила агглютинации)

Test results (agglutination strength)

I

2

3

4

5

6

7

8

9

10

АВО-группа

ABO blood group

Эритротест Цоликлон анти-А (R)

Erythrotest Zoliclone Anti-A (R)

Эритротест Цоликлон анти-А (F)

Erythrotest Zoliclone Anti-A (F)

Эритротест

Цоликлон

анти-В

Erythrotest

Zoliclone

Anti-B

Эритротест Цоликлон анти-Al моно

Erythrotest Zoliclone Anti-A I mono

Эритротест анти-Al лектин

Erythrotest Anti-A I lectin

Bio-Rad

Anti-Al

Lectin

ImuMed

Anti-Al

Lectin

Эритротест

Цоликлон

анти-Нкра

Erythrotest

Zoliclone

Anti-H)

ImuMed

Anti-H

ДНК- анализ генов ABO DN А

analysis of ABO genes

110742

4+

4+

-

1 +

3+

2+

2+

4+

4+

A2O2

А2

110812

4+

4+

-

-

-

2+

2+

4+

4+

A2O1

А2

111338

4+

4+

-

-

1-2+

1 +

1 +

4+

4+

A2O1

А2

111271

4+

4+

-

1 +

2+

3+

3+

4+

4+

A2O1

А2

111293

4+

4+

-

-

±

2+

2+

4+

4+

A2O1

А2

111655

4+

4+

-

-

-

1 +

1 +

4+

4+

A2O1

А2

111675

4+

4+

-

±

-

2+

2+

4+

4+

A2O1

А2

111564

4+

4+

-

±

2+

3+

3+

4+

4+

A2O1

А2

111370

4+

4+

-

-

±

2-3+

2-3+

4+

4+

A2O1v

А2

111349

4+

4+

-

-

±

2-3+

2-3+

4+

4+

A2O1v

А2

111372

4+

4+

-

±

±

3+

2+

4+

4+

A2O1v

А2

111620

4+

4+

-

±

±

2+

2+

4+

4+

A2O1v

А2

111912

4+

4+

-

-

±

1-2+

1-2+

4+

4+

A2O1v

А2

111878

4+

4+

-

-

1 +

2+

2+

4+

4+

A2O1v

А2

112155

4+

4+

-

±

1 +

1-2+

1-2+

4+

4+

A2O1v

А2

112126

4+

4+

-

-

1 +

1-2+

1-2+

4+

4+

A2O1v

А2

110718

4+

4+

4+

-

-

-

-

1 +

1 +

A2B1

A2B

110828

4+

4+

4+

-

-

-

-

1 +

1 +

A2B1

A2B

111625

3+

3+

4+

-

-

-

-

±

-

A2B1

A2B

111378

4+

медленно

4+

медленно

4+

-

-

-

-

1 +

-

A2B1

A2B

111595

4+

4+

4+

-

-

1 +

-

±

±

нд

np

A2B

112067

+2

+2

-

-

-

-

-

4+

4+

A1O1

Аз

111800

+2

+2

-

-

-

-

-

4+

4+

A1O1

Аз

 

Результаты анализа (сила агглютинации) Test results (agglutination strength)

Эритроциты донора/больного

Red blood cells of donor/patient (№)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

АВО-группа

ABO blood group

Эритротест Цоликлон анти-А (R)

Erythrotest Zoliclone Anti-A (R)

Эритротест Цоликлон анти-А (F)

Erythrotest Zoliclone Anti-A (F)

Эритротест

Цоликлон

анти-В

Erythrotest

Zoliclone

Anti-B

Эритротест Цоликлон анти-Al моно

Erythrotest Zoliclone Anti-A I mono

Эритротест анти-А1 лектин

Erythrotest Anti-A I lectin

Bio-Rad

Anti-Al

Lectin

ImuMed

Anti-Al

Lectin

Эритротест

Цоликлон

анти-Нкра

Erythrotest

Zoliclone

Anti-H)

ImuMed

Anti-H

ДНК- анализ генов ABO

DNА analysis of ABO genes

111668

4+

4+

-

3+

4+

4+

4+

±

-

нд

пр

A1

111617

4+

4+

-

3+

4+

4+

4+

±

-

нд

пр

A1

111607

4+

4+

-

3+

4+

4+

4+

±

-

нд

пр

A1

111667

4+

4+

-

3+

4+

4+

4+

1 +

-

нд

пр

A1

111586

4+

4+

-

3+

4+

4+

4+

1 +

-

нд

пр

A1

111616

4+

4+

-

3+

4+

4+

4+

1 +

-

нд

пр

A1

112033

4+

4+

4+

2+

3+

4+

4+

-

-

нд

пр

A1B

112164

4+

4+

4+

2+

3+

4+

4+

-

-

нд

пр

A1B

112117

4+

4+

4+

3+

3+

4+

4+

-

-

нд

пр

A1B

111649

4+

4+

4+

2+

3+

4+

4+

±

-

нд

пр

A1B

111659

4+

4+

4+

2+

3+

4+

4+

±

-

нд

пр

A1B

111350

4+

4+

4+

3+

3+

4+

4+

-

-

A1B1

A1B

Примечание: нд — генотипирование не проводили; О1, О1v, О2  — аллельные варианты гена О.

Note: пр — genotyping not performed; O1; Olv, O2 — allelic variants of the O gene.

 

Реакция с двумя анти-Н-моноклональными реаген­тами разных производителей была идентичной (столб­цы 8—9): отрицательной или слабой с эритроцитами А1 и ярко выраженной со всеми образцами А2.

На рисунке 3 показано на примере четырех образ­цов эритроцитов А, А, АВ и АВ, как выглядит реак­ция на плоскости с набором реагентов, необходимых для установления подгруппы антигена А.

В серологическое исследование были включены образцы крови доноров, которым был проведен АВ0 (столбец 10) ДНК-анализ с использованием праймеров фирмы BAG для выявления вариантных антигенов А, который подтвердил наличие аллеля АВ0*А2 у 21 доно­ра эритроцитов. В двух случаях серологически была определена подгруппа А3 (на плоскости наблюдалась замедленная агглютинация на 2+ на фоне свободных эритроцитов, в гелевом методе отмечали расслоение эритроцитов в пробирке), однако генотипирование вы­явило аллель АВ0*Аг Прямым секвенированием ДНК доноров этих образцов эритроцитов были идентифи­цированы аллели АВ0*А2.05 и АВ0*А2.06.

Обсуждение

Антигены групп крови систем АВ0 являются угле­водами (карбогидратами), то есть структурами, ко­торые формируются в результате биохимических процессов с участием гликозилтрансфераз. Гены всех углеводных антигенов, в том числе А и В, кодируют гликозилтрансферазы — ферменты, которые перено­сят конкретные сахара на углеводную цепь-предшест­венник и формируют соответствующий антиген [21]. Предшественником для синтеза антигенов А и В яв­ляется антиген Н, к которому А-гликозилтрансфераза присоединяет N-ацетилгалактозамин (GalNAc), а В-гликозилтрансфераза присоединяет галактозу (Gal) (рис. 1). На эритроцитах группы 0 присутствует большое количество антигена Н, неконвертированного в А- и/или B-антигены. Синтез А- и/или В-антигенов приводит к снижению количество антигена Н на по­верхности эритроцита. Таким образом, экспрессия ан­тигенов A и/или B и экспрессия антигена H обратно пропорциональны.

 

Рисунок 1. Структура антигенов А и В, типы олигосахаридных Н-цепей предшественников. GlNAc — N-ацетилглюкозамин; Gal — галактоза; Fuc — фукоза; GalNAc — N-ацетилгалактозамин. Типы цепей 2-4 являются эндогенными, тип 1 (не показан) может адсорбироваться на эритроциты из плазмы. Типы цепей различаются не только составом, но и положением гликозидной связи между сахарами (а или β; 1-3, 1-4). Полисахаридные цепи соединены с протеинами (P) или сфинголипидами (S) мембраны эритроцита

Figure 1. Structure of the A and B antigens; types of oligosaccharide precursor H-chains/ GlNAc — N-acetylglucosamine; Gal — galactose; Fuc — fucose; GalNAc — N-acetyl- galactosamine. Chain types 2-4 are endogenous, type 1 (not shown) can be adsorbed onto red blood cells from plasma. The types of chains differ in composition, as well as in the position of the glycosidic bond between sugars (a or β; 1-3, 1-4). Polysaccharide chains are linked to the proteins (P) or sphingolipids (S) of the erythrocyte membrane

 

Углеводные Н-цепи имеют различное биохимиче­ское строение. На эритроцитах могут присутство­вать четыре типа Н-цепей, на которых формируются соответственно 4 типа антигена А [22—24] (рис. 1). Нумерация подгрупп антигена А (А1, А2, А3) и цифро­вые обозначения типов углеводной цепи (типы 1, 2, 3, 4) не связаны между собой. Тип 1 Н-цепей синтезируется эпителиальными клетками и является предшествен­ником растворимых антигенов, которые обнаружива­ются в слюне или плазме у лиц-«секреторов». На эри­троциты такие антигены адсорбируются из плазмы. Эндогенные эритроцитарные типы Н-цепей — это типы 2, 3 и 4. На эритроцитах А экспрессируются все типы антигена А. На А - и А2В-эритроцитах присут­ствует антиген А, представленный на Н-цепях типа 2. Показано, что ключевым отличием фенотипов А1 и А2 является различная экспрессия антигена А типов 3 и 4: тип 3 отсутствует на эритроцитах А2В и слабо выра­жен на эритроцитах А , тип 4 полностью отсутствует на эритроцитах А и А В [25] (рис 2). Эти отличия связаны с тем, что активная А -гликозилтрансфераза эффективно конвертирует H вещество в А антиген и переносит GalNAc на Н-цепь любого типа, в то время как А2-гликозилтрансфераза имеет субстратные огра­ничения и не способна прикреплять иммунодоминант- ные сахара на Н-цепи типа 3 и 4.

 

Рисунок 2. Количественные и качественные различия A1- и А2-эритроцитов.

Высота столбцов демонстрирует относительное количество H- и А-антигенных детерминант на мембранах эритроцитов. Сильная Атрансфераза активно утилизирует молекулы Н-антигена (верхняя панель), превращая их в антиген А1, в то время как трансфераза А2 оставляет существенное количество антигена Н, не конвертированного в антиген А (нижняя панель). Эр — эритроциты

Figure 2. Quanfifafive and qualitative differences between A1 and A2 red blood cells. The height of the columns denotes the relative amount of H and A antigenic determinants on the membranes of red blood cells. The strong A1 transferase actively utilizes the molecules of the H antigen (upper panel) turning them into the A antigen, while the A2 transferase leaves a significant amount of the H antigen not converted to the A antigen (bottom panel). RBCs — red blood cells

 

Основным реагентом, используемым для дифферен­циации подгрупп, является анти-А1-лектин. Он пред­ставляет собой экстракт из семян бобового растения DoLichos biflorus. Экстракт реагирует с обеими под­группами А эритроцитов, но при нужном разведе­нии проявляет преимущественно анти-А1-активность. Другой анти-Адиагностикум, Цоликлон анти-А1, представляет собой комбинацию двух моноклональ­ных анти-А1-антител. Как показывают данные, пред­ставленные в таблице 2, и лектины, и моноклональные антитела могут вызывать агглютинацию некоторых образцов эритроцитов А2, причем сила агглютинации варьирует. Было установлено, что анти-Амоноклональные антитела, входящие в состав Цоликлона, реа­гируют с антигеном А, экспрессированном на Н-цепях типа 3 и 4 [25]. Эти структуры присутствуют на эри­троцитах А1, а на эритроцитах А2 их либо очень мало, либо они не обнаруживаются вообще (рис. 2). Зная эпитопную специфичность анти-А1-моноклональных антител, можно предполагать, что Цоликлон анти-А1 выявляет на эритроцитах А2 слабо экспрессирован­ные детерминанты антигена А типа 3, создавая ви­димость неспецифической реакции. Такая проблема не возникает при тестировании эритроцитов группы А2В, поскольку сильная В-трансфераза конкуриру­ет со слабой А2-трансферазой и утилизирует общие Н-предшественники.

Полезным реагентом для подтверждения подгруп­пы является анти-Н-реагент. Активная А -глико- зилтрансфераза превращает в антиген А существенно больше молекул Н, чем А2-гликозилтрансфераза. Таким образом, содержание антигена Н на эритроцитах А ниже, чем на эритроцитах А , и поэтому анти-Н-реа- генты практически не агглютинируют А -эритроциты, но дают сильную реакцию с А2-эритроцитами. В та­блице 2 и на рисунке 3 видно, как четко различают подгруппы антигена А все анти-Н-реагенты. Реагент компании ImuMed называется анти-Н (А2), однако ми­шенью антител является антиген Н, а дополнительная подпись в скобках (А2) — это скорее указание к при­менению. В настоящей работе были использованы только моноклональные анти-Н-реагенты. Экстракт из ULex europaeus также выявляет антиген Н и может применяться с той же целью.

 

Рисунок 3. Реакция агглютинации на плоскости эритроцитов A1 Α1B, А2 и А2В с реагентами анти-А, анти-В, анти-А1 и анти-Н (фото). В рядах 1-4 показана реакция агглютинации эритроцитов с различными анти-А1 реагентами. Отчетливо видно, что анти-А1 лектины агглютинируют эритроциты А2, однако сила агглютинации заметно слабее, чем с эритроцитами А1. Ряды 5-6 демонстрируют, что анти-Н реагенты сильно реагируют с эритроцитами А2 и практически не реагируют с эритроцитами А1. Ряды 7-8, агглютинация с цоликлонами анти-А и анти-В1 приведена для подтверждения группы крови

Figure 3. Slide agglutination of A1 Α1B, A2 and A2B red blood cells using anti-A, anti-B, Onti-A1 and anti-H reagents (photo). Rows 1-4 show the agglutination of red blood cells using various anti-Ai reagents. The figure clearly shows that Mnti-A1 lectins agglutinate A2 red blood cells; however, the strength of agglutination is noticeably weaker than with A1 red blood cells. Rows 5-6 demonstrate that anti-H reagents strongly react with A2 red blood cells and practically do not react with Ai red blood cells. In rows 7-8, the agglutination reaction using anti-A and anti-B Zoliclons is given to confirm the blood group

 

Таким образом, в рутинной практике для диф­ференциации подгрупп А1 и А2 в большинстве слу­чаев достаточно двух реагентов: анти-А и анти-А1. Моноклональные реагенты анти-А одинаково надежно выявляют А и А и четко реагируют с эритроцитами А , а реагенты анти-А при необходимости позволят дифференцировать А1 от А2 и более слабых подгрупп. Моноклональный реагент Цоликлон анти-А: явля­ется адекватной заменой лектину анти-А . В случае сомнительного результата реакции эритроцитов с анти-А -реагентом следует провести тестирование с реа­гентом анти-Н: сильная реакция укажет на А , отрица­тельная или слабая — на А1.

У двух доноров в настоящем исследовании было отмечено расхождение результатов серологических и молекулярных методов: серологически была опре­делена подгруппа А3, генотипирование методом ПЦР выявило аллель АВ0*А. Прямое секвенирование ДНК показало сочетание мутантных аллелей, которое про­являет себя как фенотип А [26]. Праймеры наборов А-variant Type (фирмы BAG) подобраны к наиболее ча­сто встречающимся вариантам и не могут выявить все мутации гена АВ0. За очевидными результатами генотипирования могут маскироваться мутантные аллели, что и наблюдалось в двух образцах.

Очевидно, что поиск генетических разновидностей антигена А представляет интерес для исследования эволюции гена, описания новых или редких вариан­тов [27], но в практической трансфузиологии гене­тическое типирование каждого реципиента со сла­бым антигеном А затруднительно и нерационально. Кроме того, результаты генетического анализа по­зволяют лишь предсказать наличие антигена; окон­чательное решение принимается на основе данных серологического исследования, как в приведенном выше случае. Тем не менее в литературе предлагает­ся использовать ДНК-анализ как подтверждающий тест в тех случаях, когда у здоровых доноров со сла­бой подгруппой антигена А не совпадают результа­ты перекрестного AB0-типирования, и компонент крови при этом бракуют. Авторы считают, что уточ­нение группы с помощью ДНК-анализа позволит избежать нерациональной отбраковки таких компо­нентов [28].

Список литературы

1. Дашкова Н.Г., Рагимов А.А., Асоскова Т.К. Значение изоантигена А2 и имунных анти-А1 антител в трансфузиологии. Анестезиология и реаниматология. 2009; 6: 62–4.

2. Helmich F., Baas I., Ligthart P. et al. Acute hemolytic transfusion reaction due to a warm reactive anti-A1. Transfusion. 2018; 58: 1163–70. DOI: 10.1111/trf.14537

3. Jaben E.A., Jacob E.K., Tauscher C. et al. Clinically signifi cant anti-A(1) in a presumed АВ0-identical hematopoietic stem cell transplant recipient: a case report. Transfusion. 2013; 53: 202–5. DOI: 10.1111/j.1537-2995.2012.03696.x

4. Reid M.E., Lomas-Francis C. The blood group antigen factsbook. 2nd ed. Academic Press, 2004.; DOI: 10.1016/B978-0-12-586585-2.X5000-8

5. Order of the Ministry of Health of the Russian Federation (Ministry of Health of Russia) April 2, 2013, N 183n, Moscow: “On approval of the rules for the clinical use of donated blood and (or) its components”.

6. Yamamoto F. Molecular genetics of АВ0. Vox Sang. 2000; 78: 91–103.

7. Seltsam A., Hallensleben M., Kollmann A., Blasczyk R. The nature of diversity and diversifi cation at the АВ0 locus. Blood. 2003; 102: 3035–42. DOI: 10.1182/blood-2003-03-0955

8. Prager M. Molecular genetic blood group typing by the use of PCR-SSP technique. Transfusion. 2007;47:54–9. DOI: 10.1111/j.1537-2995.2007.01311.x

9. Olsson M.L., Chester M.A. Polymorphism and recombination events at the АВ0 locus: a major challenge for genomic АВ0 blood grouping strategies. Transfus Med. 2001; 11: 295–313.

10. Chen D.P., Sun C.F., Ning H.C. et al. Genetic and mechanistic evaluation for the weak A phenotype in Ael blood type with, IVS6 + 5G>A АВ0 gene mutation. Vox Sang. 2015; 108: 64–71. DOI: 10.1111/vox.12196

11. Technical manual. Ed. Mark E. Brecher. 15th ed., Bethesda, AABB, 2005. 12. Донсков С.И., Мороков В.А. Группы крови человека. Руководство по иммуносерологии. М.: Бином; 2014.

12. Трансфузиология. Национальное руководство. Под ред. А.А. Рагимова, 2-е изд. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2018.

13. Shastry S., Bhat S. Imbalance in A(2) and A(2)B phenotype frequency of АВ0 group in South India. Blood Transfus. 2010; 8: 267–70. DOI: 10.2450/2010.0147-09

14. Ogasawara K., Yabe R., Uchikawa M. et al. Different alleles cause an imbalance in A2 and A2B phenotypes of the АВ0 blood group. Vox Sang. 1998; 74: 242–7.

15. Economidou J., Hughes-Jones N.C., Gardner B. Quantitative measurements concerning A and B antigen sites. Vox Sang. 1967; 12: 321–8.

16. Schachter H., Michaels M.A., Tilley C.A., Crookston M.C., Crookston J.H. Qualitative differences in the N-acetyl-D-galactosaminyltransferases produced by human A1 and A2 genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1973; 70: 220–4. DOI: 10.1073/pnas.70.1.220

17. Storry J.R., Olsson M.L. Genetic basis of blood group diversity. Br J Haematol. 2004; 126: 759–71. DOI: 10.1111/j.1365-2141.2004.05065.x

18. Yamamoto F., McNeill P.D., Hakomori S. Human histo-blood group A2 transferase coded by A2 allele, one of the A subtypes, is characterized by a single base deletion in the coding sequence, which results in an additional domain at the carboxyl terminal. Biochem Biophys Res Commun. 1992; 187: 366–74. DOI: 10.1016/s0006-291x(05)81502-5

19. Yoshida A., Dave V., Prchal J. Uncertainty in identifi cation of blood group A subtypes by agglutination test. Hum. Hered. 1985; 35: 1–6. DOI: 10.1159/000153505

20. Watkins W.M. Genetic regulation of the structure of blood-group-specifi c glycoproteins. Biochem Soc Symp. 1974; 40: 125–46.

21. Clausen H., Hakomori S. ABH and related histo-blood group antigens; immunochemical differences in carrier isotypes and their distribution. Vox Sang. 1989; 56: 1–20.

22. Zhang Wei, Zhu Zi-yan. Structural modifi cation of H histo-blood group antigen. Blood Transfus. 2015; 13: 143–9. DOI: 10.2450/2014.0033-14

23. Luiz Carlos de Mattos. Structural diversity and biological importance of АВ0, H, Lewis and secretor histo-blood group carbohydrates. Rev Bras Hematol Hemoter. 2016; 38(4): 331–40. DOI: 10.1016/j.bjhh.2016.07.005

24. Svensson L., Rydberg L., de Mattos L.C., Henry S.M. Blood group A(1) and A(2) revisited: an immunochemical analysis. Vox Sang. 2009; 96: 56–61. DOI: 10.1111/j.1423-0410.2008.01112.x

25. Barjas-Castro M.L., Carvalho M.H., Locatelli M.F., Bordin S., Saad S.T. Molecular heterogeneity of the A3 subgroup. Clin. Lab. Haematol. 2000; 22: 73–8.

26. Головкина Л.Л., Стремоухова А.Г., Пушкина Т.Д. Выявление редкого аллеля антигена А системы АВ0 Аel у женщины из Дагестана. Интермедикал. 2015; 1(7): 25–8.

27. Westhoff C.M. Blood group genotyping. Blood. 2019; 133: 1814–20. DOI: 10.1182/blood-2018-11-833954


Об авторах

Л. Л. Головкина
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Головкина Лариса Леонидовна, доктор медицинских наук, заведующая лабораторией трансфузиологической иммуногематологии


Р. С. Каландаров
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Каландаров Рахман Самиевич, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории трансфузиологической иммуногематологии


А. Г. Стремоухова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Стремоухова Алла Геннадьевна, врач клинической лабораторной диагностики лаборатории трансфузиологической иммуногематологии


О. С. Калмыкова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Калмыкова Ольга Сергеевна, заведующая лабораторией контроля качества и безопасности гемотрансфузий


Т. Д. Пушкина
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Пушкина Татьяна Дмитриевна, биолог лаборатории трансфузиологической иммуногематологии


В. Л. Сурин
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Сурин Вадим Леонидович, старший научный сотрудник лаборатории генной инженерии


О. С. Пшеничникова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Пшеничникова Олеся Сергеевна, старший научный сотрудник лаборатории генной инженерии


Т. Л. Николаева
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Николаева Татьяна Леонидовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологии кроветворения


Н. И. Оловникова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Оловникова Наталья Ивановна, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории физиологии кроветворения 

тел.: +7 (916) 915-25-01



Для цитирования:


Головкина Л.Л., Каландаров Р.С., Стремоухова А.Г., Калмыкова О.С., Пушкина Т.Д., Сурин В.Л., Пшеничникова О.С., Николаева Т.Л., Оловникова Н.И. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОДГРУПП А1 И А2 АНТИГЕНА А СИСТЕМЫ АВ0: БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОСНОВА И СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ СТРАТЕГИЯ. Гематология и трансфузиология. 2019;64(4):504–515. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-504-515

For citation:


Golovkina L.L., Kalandarov R.S., Stremoukhova A.G., Kalmykova O.S., Pushkina T.D., Surin V.L., Pshenichnikova O.S., Nikolaeva T.L., Olovnikova N.I. DIFFERENTIATION OF THE A1 AND A2 SUBGROUPS OF THE AB0 SYSTEM: BIOLOGICAL BACKGROUND AND SEROLOGICAL STRATEGY. Russian journal of hematology and transfusiology. 2019;64(4):504–515. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-504-515

Просмотров: 1891


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0234-5730 (Print)
ISSN 2411-3042 (Online)