Preview

Гематология и трансфузиология

Расширенный поиск

ПОЛУЧЕНИЕ ОЧИЩЕННОГО КОНЦЕНТРАТА ФИБРИНОГЕНА

https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-1-73-78

Полный текст:

Аннотация

Цель работы — разработать метод получения концентрата фибриногена, свободного от балластных белков, для производства гемостатического препарата на основе фармацевтической субстанции фибриногена.

Материалы и методы. Метод основан на выделении фибриногена из раствора криопреципитата осаждением раствором полиэтиленгликоля с последующей вирусной инактивацией сольвент/детергентом. Очистку от продуктов вирусной инактивации и балластных белков проводили путем двухступенчатой обработки полученного концентрата фибриногена раствором глицина.

Результаты. Разработанная лабораторная методика выделения фибриногена была оптимизирована по основным параметрам и масштабирована в условиях опытного производства.

Заключение. Разработанная лабораторная методика выделения фибриногена характеризуется высоким выходом целевого продукта и может применяться при производстве гемостатического препарата.

Для цитирования:


Хурдин В.В., Берковский А.Л., Сергеева Е.В., Суворов А.В. ПОЛУЧЕНИЕ ОЧИЩЕННОГО КОНЦЕНТРАТА ФИБРИНОГЕНА. Гематология и трансфузиология. 2019;64(1):73-78. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-1-73-78

For citation:


Khurdin V.V., Berkovskiy A.L., Sergeeva E.V., Suvorov A.V. PRODUCTION OF PURIFIED FIBRINOGEN CONCENTRATE. Russian journal of hematology and transfusiology. 2019;64(1):73-78. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-1-73-78

Введение

На протяжении многих лет хирургия нуждалась в гемостатических препаратах, которые могли бы оста­новить кровотечение при минимальной инвазивности вмешательства и изменениях соединяемых тканей и улучшить процесс регенерации за счет биологиче­ского сродства используемых материалов. Использо­вание биологических адгезивных средств в качестве гемостатических препаратов открывает возможности в хирургической практике. Таким биологическим ад­гезивом может являться фибриновый клей, компонен­ты которого выделяются из плазмы крови человека.

Фибриноген (фактор свертывания I) представляет собой белок плазмы крови, растворимый гликопро­теин — комплекс трех пар полипептидных (α, β и γ) цепей [1], который под действием тромбина (фактора свертывания 11а) преобразуется в фибрин — нераство­римый биополимер, сеть волокон которого является основой кровяного сгустка, обеспечивающего гемостаз. Наряду с обеспечением гемостаза фибриноген участву­ет в заживлении ран, развитии опухолей и в метастазировании [2]. Недостаточность фибриногена проявляет­ся нарушением гемостаза и приводит к кровотечениям. Дефицит фибриногена может быть как врожденным, так и приобретенным. Наиболее распространенным является приобретенный дефицит в результате гемодилюции, кровопотери и диссеминированного внутрисо-судистого свертывания [3]. Основным методом лечения и профилактики гипофибриногенемии является заме­стительная терапия препаратами и компонентами кро­ви, содержащими фибриноген [4].

Добавление тромбина к раствору фибриногена ини­циирует процесс перехода растворимого фибриногена в фибрин с образованием плотного, вязкоэластичного, клейкого сгустка. Механизм, посредством которого мономеры фибрина полимеризуются с образовани­ем решетчатой трехмерной структуры, был объектом множества исследований. Наличие катионов Ca2+ и Zn2+ уменьшает время образования сгустка и увели­чивает как его вязкоэластичность, так и плотность [5]. Трансформация растворимого фибриногена в сгусток разделена на ряд последовательных этапов, а именно: образование фибрин-мономеров, их полимеризация с формированием линейных протофибрилл и образо­вание нерастворимого трехмерного геля (коагуляция, гелеобразование). Фактор ХШа вызывает полимеризацию и образование поперечных сшивок между фибри­ном и фибронектином, а также другими адгезивными белками, усиливая взаимодействие фибрина с тромбо­цитами и сосудистой стенкой, что обеспечивает повы­шение гемостатических свойств фибрина. Благодаря действию фактора ХШа аналогичным образом вовле­кается в сгусток а2-антиплазмин и тем самым увели­чивается его резистентность к плазмину [5].

В настоящее время существуют несколько методов вы - деления фибриногена. К ним относятся спирто-холодовое осаждение [6], высаливание и обработка раствора, содержащего фибриноген, хлоридом аммония [7]. Все эти способы характеризуются низким выходом целево­го продукта и делают процесс выделения трудоемким за счет приготовления сложных буферных растворов и необходимости их последующего отмывания. Дли­тельность этих процедур приводит к значительным по­терям продукта в ходе получения. Более того, часто ис­пользуемая стадия термической пастеризации раствора фибриногена с целью инактивации вирусов и дру­гих патогенов приводит к частичной полимеризации в конечном продукте, что, в свою очередь, сказывается на конечной концентрации фибриногена.

Целью данной работы является разработка способа получения лиофилизованной формы вирус-безопасного высокоочищенного концентрата фибриногена с оптимизацией технологических условий процесса выделения, который может конкурировать с существу­ющими в настоящее время методами выделения по чи­стоте конечного продукта.

Материалы и методы

В качестве исходного сырья использовали свеже­замороженную плазму (СЗП) человека, полученную в отделении заготовки крови и ее компонентов (ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, Москва) согласно «Инструкции по проведению донорского прерывистого плазмафереза», утвержденной Минздра­вом России 23.09.2002 [8]. Аттестацию СЗП проводили в соответствии с техническим регламентом «О требова­ниях безопасности крови, ее продуктов, кровезамеща­ющих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии», утвержден­ным постановлением Правительства Российской Феде­рации от 26 января 2010 года № 29 [9].

Концентрацию фибриногена (г/л) измеряли коагулологическим методом на анализаторе MC 4 PLUS (Merlin Medical, Германия). Для проведения коагулологических измерений использовали плазму-калибратор, аттестованную по содержанию фибриногена, и высо­коактивный тромбин. Для разведения исследуемых об­разцов использовали имидазоловый буфер. Контроль построения калибровочных прямых осуществляли с помощью контрольной плазмы (плазма крови челове­ка с нормальными и патологическими параметрами си­стемы гемостаза). Использовали реагенты производства МБООИ «Общество больных гемофилией» (Россия).

Содержание фибриногена в процессе выделения и по­лучения концентрата определяли, смешивая в кювете коагулометра по 100 мкл исследуемого раствора фибри­ногена и 50 мкл тромбина с активностью 50 МЕ/мл. Из­меряли время от момента добавления тромбина до мо­мента образования сгустка. Содержание фибриногена определяли по калибровочному графику, построенному заранее с использованием последовательных разведе­ний вторичного стандарта фибриногена (плазма-калиб­ратор) с известной концентрацией фибриногена.

Концентрацию общего белка определяли методом Бредфорда на спектрофотометре Ultrospec 2100 pro (GE HealthCare, США). В качестве калибратора ис­пользовали раствор бычьего сывороточного альбуми­на с концентрацией 60 г/л (ООО «Агат-Мед», Россия). Молекулярно-массовое распределение в полученных образцах концентрата фибриногена изучали методом SDS-электрофореза на полиакриламидном геле в гра­диенте 4—15 %. Использовали систему для электро­фореза Fast System (GE HealthCare, США).

Результаты

 

Таблица 1. Влияние температуры на концентрацию фибриногена при растворении фибриноген-содержащей пасты

Table 1. Effect of temperature on the fibrinogen concentration during the process of fibrinogen-containing paste dissolution

Температура растворения, °С

Dissolution temperature, °С

37

30

20

Концентрация фибриногена в растворе, г/л

Fibrinogen concentration in solution, g/l

37-39

34-36

24-26

Основным сырьем для получения фибриногена явился криопреципитат (КП), полученный из СЗП че­ловека. В качестве метода получения КП использова­ли криофракционирование. Для этого СЗП подверга­ли медленному размораживанию при 0—2 оС для того, чтобы большая часть криоглобулиновых белков оста­лась в осадке, который затем отделяли центрифугиро­ванием. Содержание фибриногена в КП составляло ~90 % от общего белка. Полученный КП растворяли в трехкратном объеме дистиллированной воды в при­сутствии нефракционированного гепарина (2 МЕ/мл). После растворения КП его обрабатывали 3 % гелем гидроксида алюминия при интенсивном перемеши­вании. Сорбирующий гель отделяли от раствора цен­трифугированием, а полученный супернатант обраба­тывали полиэтиленгликолем (ПЭГ)-4000. Активность факторов протромбинового комплекса после сорб­ции значительно уменьшилась и составила не более 0,04 МЕ/мл (контроль активности вели по фактору II). Фибриноген из раствора выделяли, осаждая его ПЭГ- 4000 при интенсивном перемешивании. рН раствора при этом доводили до величины, близкой к изоэлек- трической точке фибриногена (6,6-6,8), 0,5 М раство­ром уксусной кислоты. Полученный супернатант передавали на производство очищенного фактора VIII, а преципитат использовали далее для получения кон­центрата фибриногена.

Содержащую фибриноген пасту растворяли при ин­тенсивном перемешивании в десятикратном объеме буфера, содержащего 10 мМ трехзамещенного цитрата натрия и 0,15 М хлорида натрия. рН корректировали 0,5 М раствором трис-основания до уровня 7,8-8,0. После растворения пасты раствор центрифугировали для осветления. Процесс растворения фибриногена зависел от температуры: концентрация фибриногена в растворе возрастала с 25 до 38 г/л при увеличении температуры растворения с 20 до 37 °С.

С целью обеспечения вирусной безопасности кон­центрата фибриногена была проведена сольвент/детер - гентная вирусная инактивация раствора, содержащего фибриноген. В качестве агентов вирусной инактива­ции были выбраны 1 % раствор Tween-80 (моноолеат полиоксиэтиленсорбитан) и 0,3 % TnBP (три-н-бутил- фосфат) [10]. Раствор, содержащий фибриноген, инку­бировали при комнатной температуре при непрерыв­ном перемешивании в течение 6-10 часов. Для очистки концентрата фибриногена от продуктов вирусной инактивации и инактивирующих агентов полученный раствор подвергали процедуре 3-кратной экстракции вазелиновым маслом при интенсивном перемешива­нии в течение 2 часов. Затем супернатант, содержащий фибриноген, центрифугировали и отделяли водный слой, содержащий раствор фибриногена. Отделе­ние фибриногена от балластных белков проводили методом переосаждения. В раствор при интенсивном перемешивании добавляли глицин. При этом образо­вывался осадок фибриногена, который затем отделяли центрифугированием. Осадок растворяли в буфере, содержащем 10 мМ трехзамещенный цитрат натрия и 0,15 М хлорид натрия. Процедуру осаждения прово­дили дважды, каждый раз отмывая осадок холодным раствором глицина. При добавлении глицина по мере его растворения наблюдалось образование белково­го осадка. После его отделения центрифугированием были взяты пробы надосадочной жидкости, в которой определяли концентрацию фибриногена (табл. 2).

При добавлении глицина до концентрации в раство­ре, равной 1 М, к концентрату фибриногена при ин­тенсивном перемешивании наблюдалось мгновенное образование белковых сгустков. После центрифуги­рования были взяты пробы надосадочной жидкости, при исследовании которых установлено, что в них содержится еще значительное количество (5,81 г/л) неосадившегося фибриногена. Увеличение концен­трации глицина в растворе до 1,5 М привело к тому, что в пробах надосадочной жидкости практически полностью перестал определяться растворенный фи­бриноген. При этом концентрация переосажденного фибриногена составила 20—23 г/л. Увеличение кон­центрации глицина в растворе до 2,0 и 2,8 М привело к обратному результату: концентрация переосажденного фибриногена в растворе после растворения осад­ка уменьшалась до 15 и 10 г/л соответственно. В по­следнем случае количество глицина было настолько высоким, что он не растворялся полностью.

 

Таблица 2. Влияние концентрация глицина на растворимость фибриногена при избавлении концентрата фибриногена от балластных белков

Table 2. Effect of glycine concentration on the fibrinogen solubility during purification of the fibrinogen concentrate from ballast proteins

Концентрация глицина, М

Glycine concentration, М

1

1,5

2

2,8

Образец

Sample

Надосадоч- ная жид­кость

Supernatant

Переосажденный фибриноген

Precipitated fibrinogen

Надосадочная жид­кость

Supernatant

Переосажденный фибриноген

Precipitated fibrinogen

Надосадочная жид­кость Supernatant

Переосажденный фибриноген

Precipitated fibrinogen

Надосадочная жид­кость

Supernatant

Переосажденный фибриноген

Precipitated fibrinogen

Концентрация фибриногена в растворе, г/л

Fibrinogen concentration in solution, g/l

5-7

8-10

0-0,2

20-23

0-0,5

13-16

0

7-9,5

 

Таблица 3. Влияние рН на концентрацию фибриногена при растворении преципитата фибриногена

Table 3. Effect of pH on the fibrinogen concentration during the process of precipitated fibrinogen dissolution

РН

7,00

7,50

8,00

Концентрация фибриногена в растворе, г/л

Fibrinogen concentration in solution, g/l

30-31

34-36

30-32

Диапазон значений рН на стадии осаждения был вы­бран наиболее близким к физиологическим величи­нам (7,0-7,8). рН корректировали 0,5 М раствором трис-основания. Оптимальным для осаждения глици­ном являлся рН, равный 7,5 (табл. 3).

Осадок фибриногена растворяли в буфере, содер­жащем цитрат натрия и хлорид натрия, при рН 7,5­7,8 до концентрации 20-25 г/л и подвергали стерили­зующей фильтрации. Стерилизующую фильтрацию и розлив проводили в зоне с ламинарным воз­душным потоком, соответствующей по чистоте классу А. Все емкости и оборудование (флаконы, пробки, колпачки, фильтр) после стерилизации по­ступали в «чистую зону». Фильтрацию осуществля­ли через стерилизующий фильтр Millipac с диа­метром пор 0,22 мкм. Далее весь объем жидкости разливали по 2 мл во флаконы. Флаконы закрывали стерильными пробками и далее передавали на ста­дию лиофильной сушки. После розлива флаконы с препаратом помещали в поддоны лиофилизатора. Программу лиофилизации и термической инакти­вации задавали с помощью компьютера. Процесс со­стоял из трех стадий:

  • заморозка раствора при температуре -50 °С и дав­лении 1 бар в течение 7,5 ч;
  • лиофилизация при температуре от -20 до +30 °С и давлении 60 мкбар в течение 40,5 ч;
  • термическая вирусная инактивация при темпера­туре 60 °С и давлении 60 мкбар в течение 72 ч.

Полученный лиофилизат укупоривали под вакуу­мом, флаконы обжимали алюминиевыми колпачками. Для дальнейшего исследования полученного концен­трата фибриногена флаконы вскрывали, растворя­ли концентрат до жидкого состояния дистиллиро­ванной водой c помощью легкого покачивания, затем выдерживали при комнатной температуре до полного растворения в течение 15 минут.

Чтобы охарактеризовать полученный концентрат фибриногена по количеству действующего вещества и наличию примесей, был проведен электрофорез в по - лиакриламидном геле в денатурирующих условиях на системе Phast System Pharmacia (рис. 1).

На рисунке 1 представлена пластина с полиакрил­амидным гелем с нанесенными образцами. Образцы 1 и 3 представляют собой маркеры для низкомолеку­лярных и высокомолекулярных соединений соответ­ственно. Образец 2 представляет собой разведенную пробу полученного фибриногена с концентрацией об­щего белка примерно 2 г/л. На рисунке видно, как α-, β- и γ-цепи человеческого фибриногена с массой 68, 56 и 46 кД соответственно разделяются при электрофоре­зе. Полученные данные проведенного электрофореза свидетельствуют о высокой чистоте целевого продукта.

Обсуждение

Использование плазмы крови человека в качестве основного сырья для производства КП обеспечивает наилучшую физиологическую совместимость компо­нентов биологического адгезива с организмом больного.

Для подавления активации факторов протромбинового комплекса полученный криопреципитат раство­ряли в присутствии нефракционированного гепари­на. Поскольку факторы протромбинового комплекса в физиологических условиях проявляют сильное сродство к отрицательно заряженным поверхностям, то, используя это свойство, была проведена обработка специфическими сорбентами, направленная на уда­ление предшественников сериновых протеаз. Одним из таких сорбентов является гидроксид алюминия.

Фибриноген, как и другие биологические молеку­лы (белки, аминокислоты), при достижении значения своей изоэлектрической точки чаще всего выпадает в осадок. Фибриноген-содержащую пасту в виде осад­ка после центрифугирования растворяли при интен­сивном перемешивании в буфере, содержащем анти­коагулирующий агент цитрат натрия. рН выводили из значения изоэлектрической точки фибриногена для ускорения процесса растворения.

 

Рисунок 1. Электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях

Figure 1. Polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions

 

Задачей настоящей работы являлось обеспечение оптимальных параметров в процессе выделения це­левого белка, поэтому были оптимизированы основ­ные параметры, такие как температура растворения фибриногена и pH растворов на различных стадиях процесса, а также концентрация глицина на стадии переосаждения фибриногена. Для очистки концен­трата фибриногена от продуктов вирусной инактива­ции и инактивирующих агентов полученный раствор подвергали процедуре экстракции вазелиновым мас­лом при интенсивном перемешивании с последующим центрифугированием. Температуру при осаждении понижали до 4 °С, поскольку известно, что фибрино­ген является криоглобулиновым белком и лучше оса­ждается при пониженной температуре.

В дальнейшем последовали процедуры стерильной фильтрации, розлива и лиофилизации. Фибриноген сохраняет значительное количество воды даже после лиофилизации. Фибриноген образует с водой комплекс, в котором участвуют 174 молекулы воды на одну моле­кулу фибриногена, причем молекулы воды являются структурно запертыми в каждой молекуле белка, имея возможность высвободить воду только в случае растя­жения или сжатия молекулы белка [11, 12]. Пр и лиофилизации фибриногена до полной обезвоженности следует учитывать, сколько воды сухой порошок фи­бриногена сможет впитать, чтобы восстановиться до применимого состояния за разумное время. С прак­тической точки зрения растворение порошка сухого фибриногена в водном буфере лучше проводить, просто позволяя порошку абсорбировать воду, таким образом позволяя белку медленно растворяться без перемеши­вания или встряхивания [11-13]. Полученные результаты SDS-PAGE электрофореза свидетельствуют о высо­кой чистоте полученного продукта.

Таким образом, в результате проведенных иссле­дований разработан лабораторный метод получения стабильного высокоочищенного вирус-безопасного концентрата фибриногена, применимый для малых и больших объемов исходного сырья для производства препарата фибриногена. Проведена оптимизация та­ких технологических показателей процесса выделе­ния, как температура растворения фибриногена, pH, концентрация глицина. Разработанный метод ха­рактеризуется высоким выходом целевого продукта и снижением трудоемкости за счет исключения при­готовления необходимых в других методах сложных буферных растворов и их последующего отмывания, что обуславливает отсутствие значительных потерь целевого продукта в ходе выделения.

Список литературы

1. Redman C., Xia H. Fibrinogen biosynthesis. Ann N Y Acad Sci. 2001; 936: 480–95.

2. Козлов А.А., Берковский А.Л., Качалова Н.Д. и др. Пособие для врачейлаборантов по методам исследования плазменного гемостаза. Факторы свертывания крови. М.: Ренам; 2008.

3. Братчик А.М. Клинические проблемы фибринолиза. Киев; 1993.

4. Зубаиров Д.М. Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования. Казань; 2000.

5. Mosesson M.W. Fibrnogen and fibrin structure and functions. J Thromb Haemost. 2005; 3: 1894–904.

6. Крайнова Т.А., Пискарева Ю.К., Анастасиев В.В. Препараты крови. Инструктивно-методические материалы по контролю и производству. М.; 1976.

7. Инструкция по проведению донорского прерывистого плазмафереза. Утверждена Министерством здравоохранения России 23.09.2002.

8. Технический Регламент «О требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии». Утвержден Постановлением Правительства Российской Федерации от 26 января 2010 г. № 29.

9. Billy D., Speijer H., Zwaal R.F.A., et al. Anticoagulant and membrane-degrading effects of secretory (non-pancreatic) phospholipase A2, are inhibited in plasma. Thromb. Haemost. 2002; 87: 978–84.

10. Yermolenko I.S., Lishko V.K., Ugarova T.P., Magonov S.N. High-resolution visualization of fibrinogen molecules and fibrin fibers with atomic force microscopy. Biomacromolecules. 2011; 12: 70–9.

11. Brown J.H., Volkmann N., Jun G., et al. The crystal structure of modified bovine fibrinogen. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97, 85–90.

12. Brown A.E., Litvinov R.I., Discher D.E., Weisel J.W. Forced unfolding of coiledcoils in fibrinogen by single-molecule AFM. Biophys J. 2007; 92: 39–41.

13. Brown A.E., Litvinov R.I., Discher D.E., et al. Multi-scale mechanics of fibrin polymer: gel stretching with protein unfolding and loss of water. Science. 2009; 325: 741–4.


Об авторах

В. В. Хурдин
ФГБОУ ВО «МИРЭА — Российский технологический университет»
Россия
Хурдин Вячеслав Викторович, аспирант


А. Л. Берковский
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Берковский Арон Леонидович, кандидат биологических наук, консультант


Е. В. Сергеева
НПО «Ренам» МБООИ «Общество больных гемофилией»
Россия
Сергеева Елена Владимировна, заведующая производством


А. В. Суворов
НПО «Ренам» МБООИ «Общество больных гемофилией»
Россия
Суворов Александр Владимирович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник


Для цитирования:


Хурдин В.В., Берковский А.Л., Сергеева Е.В., Суворов А.В. ПОЛУЧЕНИЕ ОЧИЩЕННОГО КОНЦЕНТРАТА ФИБРИНОГЕНА. Гематология и трансфузиология. 2019;64(1):73-78. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-1-73-78

For citation:


Khurdin V.V., Berkovskiy A.L., Sergeeva E.V., Suvorov A.V. PRODUCTION OF PURIFIED FIBRINOGEN CONCENTRATE. Russian journal of hematology and transfusiology. 2019;64(1):73-78. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-1-73-78

Просмотров: 918


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0234-5730 (Print)
ISSN 2411-3042 (Online)