ПОЛУЧЕНИЕ ОЧИЩЕННОГО КОНЦЕНТРАТА ФИБРИНОГЕНА

Введение

На протяжении многих лет хирургия нуждалась в гемостатических препаратах, которые могли бы оста­новить кровотечение при минимальной инвазивности вмешательства и изменениях соединяемых тканей и улучшить процесс регенерации за счет биологиче­ского сродства используемых материалов. Использо­вание биологических адгезивных средств в качестве гемостатических препаратов открывает возможности в хирургической практике. Таким биологическим ад­гезивом может являться фибриновый клей, компонен­ты которого выделяются из плазмы крови человека.

Фибриноген (фактор свертывания I) представляет собой белок плазмы крови, растворимый гликопро­теин — комплекс трех пар полипептидных (α, β и γ) цепей [1], который под действием тромбина (фактора свертывания 11а) преобразуется в фибрин — нераство­римый биополимер, сеть волокон которого является основой кровяного сгустка, обеспечивающего гемостаз. Наряду с обеспечением гемостаза фибриноген участву­ет в заживлении ран, развитии опухолей и в метастазировании [2]. Недостаточность фибриногена проявляет­ся нарушением гемостаза и приводит к кровотечениям. Дефицит фибриногена может быть как врожденным, так и приобретенным. Наиболее распространенным является приобретенный дефицит в результате гемодилюции, кровопотери и диссеминированного внутрисо-судистого свертывания [3]. Основным методом лечения и профилактики гипофибриногенемии является заме­стительная терапия препаратами и компонентами кро­ви, содержащими фибриноген [4].

Добавление тромбина к раствору фибриногена ини­циирует процесс перехода растворимого фибриногена в фибрин с образованием плотного, вязкоэластичного, клейкого сгустка. Механизм, посредством которого мономеры фибрина полимеризуются с образовани­ем решетчатой трехмерной структуры, был объектом множества исследований. Наличие катионов Ca²+ и Zn²+ уменьшает время образования сгустка и увели­чивает как его вязкоэластичность, так и плотность [5]. Трансформация растворимого фибриногена в сгусток разделена на ряд последовательных этапов, а именно: образование фибрин-мономеров, их полимеризация с формированием линейных протофибрилл и образо­вание нерастворимого трехмерного геля (коагуляция, гелеобразование). Фактор ХШа вызывает полимеризацию и образование поперечных сшивок между фибри­ном и фибронектином, а также другими адгезивными белками, усиливая взаимодействие фибрина с тромбо­цитами и сосудистой стенкой, что обеспечивает повы­шение гемостатических свойств фибрина. Благодаря действию фактора ХШа аналогичным образом вовле­кается в сгусток а2-антиплазмин и тем самым увели­чивается его резистентность к плазмину [5].

В настоящее время существуют несколько методов вы - деления фибриногена. К ним относятся спирто-холодовое осаждение [6], высаливание и обработка раствора, содержащего фибриноген, хлоридом аммония [7]. Все эти способы характеризуются низким выходом целево­го продукта и делают процесс выделения трудоемким за счет приготовления сложных буферных растворов и необходимости их последующего отмывания. Дли­тельность этих процедур приводит к значительным по­терям продукта в ходе получения. Более того, часто ис­пользуемая стадия термической пастеризации раствора фибриногена с целью инактивации вирусов и дру­гих патогенов приводит к частичной полимеризации в конечном продукте, что, в свою очередь, сказывается на конечной концентрации фибриногена.

Целью данной работы является разработка способа получения лиофилизованной формы вирус-безопасного высокоочищенного концентрата фибриногена с оптимизацией технологических условий процесса выделения, который может конкурировать с существу­ющими в настоящее время методами выделения по чи­стоте конечного продукта.

Материалы и методы

В качестве исходного сырья использовали свеже­замороженную плазму (СЗП) человека, полученную в отделении заготовки крови и ее компонентов (ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, Москва) согласно «Инструкции по проведению донорского прерывистого плазмафереза», утвержденной Минздра­вом России 23.09.2002 [8]. Аттестацию СЗП проводили в соответствии с техническим регламентом «О требова­ниях безопасности крови, ее продуктов, кровезамеща­ющих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии», утвержден­ным постановлением Правительства Российской Феде­рации от 26 января 2010 года № 29 [9].

Концентрацию фибриногена (г/л) измеряли коагулологическим методом на анализаторе MC 4 PLUS (Merlin Medical, Германия). Для проведения коагулологических измерений использовали плазму-калибратор, аттестованную по содержанию фибриногена, и высо­коактивный тромбин. Для разведения исследуемых об­разцов использовали имидазоловый буфер. Контроль построения калибровочных прямых осуществляли с помощью контрольной плазмы (плазма крови челове­ка с нормальными и патологическими параметрами си­стемы гемостаза). Использовали реагенты производства МБООИ «Общество больных гемофилией» (Россия).

Содержание фибриногена в процессе выделения и по­лучения концентрата определяли, смешивая в кювете коагулометра по 100 мкл исследуемого раствора фибри­ногена и 50 мкл тромбина с активностью 50 МЕ/мл. Из­меряли время от момента добавления тромбина до мо­мента образования сгустка. Содержание фибриногена определяли по калибровочному графику, построенному заранее с использованием последовательных разведе­ний вторичного стандарта фибриногена (плазма-калиб­ратор) с известной концентрацией фибриногена.

Концентрацию общего белка определяли методом Бредфорда на спектрофотометре Ultrospec 2100 pro (GE HealthCare, США). В качестве калибратора ис­пользовали раствор бычьего сывороточного альбуми­на с концентрацией 60 г/л (ООО «Агат-Мед», Россия). Молекулярно-массовое распределение в полученных образцах концентрата фибриногена изучали методом SDS-электрофореза на полиакриламидном геле в гра­диенте 4—15 %. Использовали систему для электро­фореза Fast System (GE HealthCare, США).

Результаты

Основным сырьем для получения фибриногена явился криопреципитат (КП), полученный из СЗП че­ловека. В качестве метода получения КП использова­ли криофракционирование. Для этого СЗП подверга­ли медленному размораживанию при 0—2 ^оС для того, чтобы большая часть криоглобулиновых белков оста­лась в осадке, который затем отделяли центрифугиро­ванием. Содержание фибриногена в КП составляло ~90 % от общего белка. Полученный КП растворяли в трехкратном объеме дистиллированной воды в при­сутствии нефракционированного гепарина (2 МЕ/мл). После растворения КП его обрабатывали 3 % гелем гидроксида алюминия при интенсивном перемеши­вании. Сорбирующий гель отделяли от раствора цен­трифугированием, а полученный супернатант обраба­тывали полиэтиленгликолем (ПЭГ)-4000. Активность факторов протромбинового комплекса после сорб­ции значительно уменьшилась и составила не более 0,04 МЕ/мл (контроль активности вели по фактору II). Фибриноген из раствора выделяли, осаждая его ПЭГ- 4000 при интенсивном перемешивании. рН раствора при этом доводили до величины, близкой к изоэлек- трической точке фибриногена (6,6-6,8), 0,5 М раство­ром уксусной кислоты. Полученный супернатант передавали на производство очищенного фактора VIII, а преципитат использовали далее для получения кон­центрата фибриногена.

Содержащую фибриноген пасту растворяли при ин­тенсивном перемешивании в десятикратном объеме буфера, содержащего 10 мМ трехзамещенного цитрата натрия и 0,15 М хлорида натрия. рН корректировали 0,5 М раствором трис-основания до уровня 7,8-8,0. После растворения пасты раствор центрифугировали для осветления. Процесс растворения фибриногена зависел от температуры: концентрация фибриногена в растворе возрастала с 25 до 38 г/л при увеличении температуры растворения с 20 до 37 °С.

С целью обеспечения вирусной безопасности кон­центрата фибриногена была проведена сольвент/детер - гентная вирусная инактивация раствора, содержащего фибриноген. В качестве агентов вирусной инактива­ции были выбраны 1 % раствор Tween-80 (моноолеат полиоксиэтиленсорбитан) и 0,3 % TnBP (три-н-бутил- фосфат) [10]. Раствор, содержащий фибриноген, инку­бировали при комнатной температуре при непрерыв­ном перемешивании в течение 6-10 часов. Для очистки концентрата фибриногена от продуктов вирусной инактивации и инактивирующих агентов полученный раствор подвергали процедуре 3-кратной экстракции вазелиновым маслом при интенсивном перемешива­нии в течение 2 часов. Затем супернатант, содержащий фибриноген, центрифугировали и отделяли водный слой, содержащий раствор фибриногена. Отделе­ние фибриногена от балластных белков проводили методом переосаждения. В раствор при интенсивном перемешивании добавляли глицин. При этом образо­вывался осадок фибриногена, который затем отделяли центрифугированием. Осадок растворяли в буфере, содержащем 10 мМ трехзамещенный цитрат натрия и 0,15 М хлорид натрия. Процедуру осаждения прово­дили дважды, каждый раз отмывая осадок холодным раствором глицина. При добавлении глицина по мере его растворения наблюдалось образование белково­го осадка. После его отделения центрифугированием были взяты пробы надосадочной жидкости, в которой определяли концентрацию фибриногена (табл. 2).

При добавлении глицина до концентрации в раство­ре, равной 1 М, к концентрату фибриногена при ин­тенсивном перемешивании наблюдалось мгновенное образование белковых сгустков. После центрифуги­рования были взяты пробы надосадочной жидкости, при исследовании которых установлено, что в них содержится еще значительное количество (5,81 г/л) неосадившегося фибриногена. Увеличение концен­трации глицина в растворе до 1,5 М привело к тому, что в пробах надосадочной жидкости практически полностью перестал определяться растворенный фи­бриноген. При этом концентрация переосажденного фибриногена составила 20—23 г/л. Увеличение кон­центрации глицина в растворе до 2,0 и 2,8 М привело к обратному результату: концентрация переосажденного фибриногена в растворе после растворения осад­ка уменьшалась до 15 и 10 г/л соответственно. В по­следнем случае количество глицина было настолько высоким, что он не растворялся полностью.

Диапазон значений рН на стадии осаждения был вы­бран наиболее близким к физиологическим величи­нам (7,0-7,8). рН корректировали 0,5 М раствором трис-основания. Оптимальным для осаждения глици­ном являлся рН, равный 7,5 (табл. 3).

Осадок фибриногена растворяли в буфере, содер­жащем цитрат натрия и хлорид натрия, при рН 7,5­7,8 до концентрации 20-25 г/л и подвергали стерили­зующей фильтрации. Стерилизующую фильтрацию и розлив проводили в зоне с ламинарным воз­душным потоком, соответствующей по чистоте классу А. Все емкости и оборудование (флаконы, пробки, колпачки, фильтр) после стерилизации по­ступали в «чистую зону». Фильтрацию осуществля­ли через стерилизующий фильтр Millipac с диа­метром пор 0,22 мкм. Далее весь объем жидкости разливали по 2 мл во флаконы. Флаконы закрывали стерильными пробками и далее передавали на ста­дию лиофильной сушки. После розлива флаконы с препаратом помещали в поддоны лиофилизатора. Программу лиофилизации и термической инакти­вации задавали с помощью компьютера. Процесс со­стоял из трех стадий:

• заморозка раствора при температуре -50 °С и дав­лении 1 бар в течение 7,5 ч;
• лиофилизация при температуре от -20 до +30 °С и давлении 60 мкбар в течение 40,5 ч;
• термическая вирусная инактивация при темпера­туре 60 °С и давлении 60 мкбар в течение 72 ч.

Полученный лиофилизат укупоривали под вакуу­мом, флаконы обжимали алюминиевыми колпачками. Для дальнейшего исследования полученного концен­трата фибриногена флаконы вскрывали, растворя­ли концентрат до жидкого состояния дистиллиро­ванной водой c помощью легкого покачивания, затем выдерживали при комнатной температуре до полного растворения в течение 15 минут.

Чтобы охарактеризовать полученный концентрат фибриногена по количеству действующего вещества и наличию примесей, был проведен электрофорез в по - лиакриламидном геле в денатурирующих условиях на системе Phast System Pharmacia (рис. 1).

На рисунке 1 представлена пластина с полиакрил­амидным гелем с нанесенными образцами. Образцы 1 и 3 представляют собой маркеры для низкомолеку­лярных и высокомолекулярных соединений соответ­ственно. Образец 2 представляет собой разведенную пробу полученного фибриногена с концентрацией об­щего белка примерно 2 г/л. На рисунке видно, как α-, β- и γ-цепи человеческого фибриногена с массой 68, 56 и 46 кД соответственно разделяются при электрофоре­зе. Полученные данные проведенного электрофореза свидетельствуют о высокой чистоте целевого продукта.

Обсуждение

Использование плазмы крови человека в качестве основного сырья для производства КП обеспечивает наилучшую физиологическую совместимость компо­нентов биологического адгезива с организмом больного.

Для подавления активации факторов протромбинового комплекса полученный криопреципитат раство­ряли в присутствии нефракционированного гепари­на. Поскольку факторы протромбинового комплекса в физиологических условиях проявляют сильное сродство к отрицательно заряженным поверхностям, то, используя это свойство, была проведена обработка специфическими сорбентами, направленная на уда­ление предшественников сериновых протеаз. Одним из таких сорбентов является гидроксид алюминия.

Фибриноген, как и другие биологические молеку­лы (белки, аминокислоты), при достижении значения своей изоэлектрической точки чаще всего выпадает в осадок. Фибриноген-содержащую пасту в виде осад­ка после центрифугирования растворяли при интен­сивном перемешивании в буфере, содержащем анти­коагулирующий агент цитрат натрия. рН выводили из значения изоэлектрической точки фибриногена для ускорения процесса растворения.

Задачей настоящей работы являлось обеспечение оптимальных параметров в процессе выделения це­левого белка, поэтому были оптимизированы основ­ные параметры, такие как температура растворения фибриногена и pH растворов на различных стадиях процесса, а также концентрация глицина на стадии переосаждения фибриногена. Для очистки концен­трата фибриногена от продуктов вирусной инактива­ции и инактивирующих агентов полученный раствор подвергали процедуре экстракции вазелиновым мас­лом при интенсивном перемешивании с последующим центрифугированием. Температуру при осаждении понижали до 4 °С, поскольку известно, что фибрино­ген является криоглобулиновым белком и лучше оса­ждается при пониженной температуре.

В дальнейшем последовали процедуры стерильной фильтрации, розлива и лиофилизации. Фибриноген сохраняет значительное количество воды даже после лиофилизации. Фибриноген образует с водой комплекс, в котором участвуют 174 молекулы воды на одну моле­кулу фибриногена, причем молекулы воды являются структурно запертыми в каждой молекуле белка, имея возможность высвободить воду только в случае растя­жения или сжатия молекулы белка [11, 12]. Пр и лиофилизации фибриногена до полной обезвоженности следует учитывать, сколько воды сухой порошок фи­бриногена сможет впитать, чтобы восстановиться до применимого состояния за разумное время. С прак­тической точки зрения растворение порошка сухого фибриногена в водном буфере лучше проводить, просто позволяя порошку абсорбировать воду, таким образом позволяя белку медленно растворяться без перемеши­вания или встряхивания [11-13]. Полученные результаты SDS-PAGE электрофореза свидетельствуют о высо­кой чистоте полученного продукта.

Таким образом, в результате проведенных иссле­дований разработан лабораторный метод получения стабильного высокоочищенного вирус-безопасного концентрата фибриногена, применимый для малых и больших объемов исходного сырья для производства препарата фибриногена. Проведена оптимизация та­ких технологических показателей процесса выделе­ния, как температура растворения фибриногена, p^H, концентрация глицина. Разработанный метод ха­рактеризуется высоким выходом целевого продукта и снижением трудоемкости за счет исключения при­готовления необходимых в других методах сложных буферных растворов и их последующего отмывания, что обуславливает отсутствие значительных потерь целевого продукта в ходе выделения.