МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ БОРТЕЗОМИБ-ИНДУЦИРОВАННОЙ ПОЛИНЕЙРОПАТИИ У БОЛЬНЫХ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМОЙ

Введение

Появившиеся в последнее десятилетие новые варианты лекарственной терапии множественной миеломы (ММ), в частности применение ингибиторов протеасом и им­муномодулирующих препаратов, изменили парадигму лечения этого заболевания, улучшив ее эффективность в долгосрочной перспективе [1—3]. Бортезомиб — первый препарат из группы ингибиторов протеасом, одобрен­ный для клинического применения в 2003 г. для лечения

ММ [2, 4]. Периферическая полинейропатия (ПП) яв­ляется серьезным осложнением как самого заболевания, так и терапии бортезомибом [3, 5]. Она существенно влияет на качество жизни больных и зачастую требует снижения дозы препарата, изменения сроков или даже преждевременного прекращения потенциально успеш­ного лечения [2, 6]. Частота развития ПП, индуцирован - ной применением ингибиторов протеасом, колеблется от 15 до 45 % [7, 8]. Она возникает на протяжении первых пяти циклов лечения, достигая плато к 8-му циклу бортезомиб-содержащей терапии [9]. Подкожное введение бортезомиба снижает вероятность возникновения ПП, но полностью не отменяет его нейротоксичность [7]. К причинам развития ПП при применении бортезомиба относят непосредственное повреждение ганглиев дорзальных корней спинного мозга, митохондриального и эндоплазматического ретикулума, нарушение регуля­ции гомеостаза Ca²+ [6], ингибирование транскрипции фактора роста нервов, стабилизацию микротрубочек, аутоиммунные или воспалительные процессы [2, 6, 10, 11]. Бортезомиб, взаимодействуя с ядерным фактором kappa B (nuclear factor-κΒ — NF-κΒ), приводит к измене­нию внутриклеточной передачи сигнала, опосредуемого митоген-активируемыми протеинкиназами, регуляции клеточного цикла, препятствует восстановлению ДНК, развитию и функционированию нервной системы, бло­кирует транскрипцию и апоптоз нервных и опухолевых клеток [2, 9, 12—14].

NF-κΒ относится к семейству факторов транскрип­ции, который обнаруживается при ММ в конститутив - но активированной форме. Его присутствие является важным условием роста и прогрессии опухолей, включая гемобластозы [15]. Это связано с тем, что активированный NF-κΒ транслоцируется из цитоплазмы в ядро и взаимодействует со специфическими сайтами в области промоторов и энхансеров генов иммунного ответа, ответственных за синтез белков и пептидов, вовлечен­ных в той или иной степени в реализацию иммун­ных реакций организма [16]. Белок NF-κΒ является дистальным отделом путей сигнальной трансдукции, получающим стимулирующие сигналы через различ­ные адаптеры от паттерн-распознающих рецепторов [15]. Паттерн-распознающие рецепторы — первое звено в сложном механизме распознавания «своего» и «чужого» генетического материала, где в качестве последнего могут выступать опухолевые клетки и мо­лекулы, образующиеся в процессе их деградации [16]. Мутации в генах, кодирующих компоненты сигналь­ного пути NF-κΒ, участвующих в развитии иммунных реакций, повышают риск развития ММ, способствуют возникновению резистентности к проводимому лече­нию, прогрессированию опухолевого роста, появле­нию осложнений этого заболевания и терапии [15—17].

Цель исследования — выявить группу риска раз­вития бортезомиб-индуцированной ПП на основа­нии анализа полиморфизма генов иммунного ответа у больных с впервые диагностированной ММ.

Материалы и методы

Материалом для исследования послужила ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической венозной крови 46 больных ММ (28 женщин и 18 мужчин) с ме­дианой возраста 60 лет, ранее не получавших лечения лекарственными препаратами, обладающими нейро- токсическим э фф ектом. Из них у 3 (6,5 %) больных заболевание находилось в I стадии, у 19 (41,3 %) — во II стадии, у 24 (52,2 %) — в III стадии (по Durie- Salmon [18]). Моноклональный тип секреции IgA на­блюдался у 10 (21,7 %) человек, IgG — у 28 (60,9 %) обследованных. Преобладание свободных легких цепей κ-типа выявлено у 22 (47,8 %) больных, у 11 (23,9 %) — λ-типа. У остальных тип продукции иммуноглобулинов и свободных легких цепей был неизве­стен. Все больные получили лечение с использованием режима VCD (бортезомиб + циклофосфамид + декса- метазон). Бортезомиб вводили в дозе 1,3 мг/м² подкож­но в 1, 4, 8 и 11-й дни каждого курса. До получения ча­стичной и/или полной ремиссии в 1-й группе больным проведено от 2 до 12 курсов VCD (медиана — 6 кур­сов), во 2-й группе — от 2 до 17 (медиана — 5,5) кур­сов терапии. Информированное добровольное согла­сие на проведение исследований было получено у всех больных. Все случаи ПП оценены в соответствии с об­щими терминологическими критериями неблагопри­ятных событий Национального института рака (версия 3.0) после окончания индукционной терапии. Боль­ных в зависимости от наличия ПП разделили на две группы. В 1-ю группу вошли 12 (26,1 %) больных ММ с ПП. Среди них наблюдались 9 женщин и 3 мужчин в возрасте от 34 до 72 лет (медиана возраста 59 лет). У 2 (16,7 %) больных характер выраженности симптомов был незначителен и отнесен к 1-й степени токсичности, у 8 (66,6 %) — ко 2-й степени, у 2 (16,7 %) — к 3-й сте­пени, что потребовало редукции дозы бортезомиба. Во 2-ю группу включили 34 (73,9 %) больных ММ (19 женщин и 15 мужчин) без клинических призна­ков бортезомиб-индуцированной ПП в возрасте от 33 до 76 лет (медиана возраста 61 год) (табл. 1).

Генотипирование 20 полиморфных участков 14 генов иммунного ответа TLR2 (rs5743708) TLR3 (rs3775291) TLR4 (rs4986790, rs4986791) TLR6 (rs5743810) TLR9 (rs5743836, rs352140) ILlfi (rs2856841,   rs1143623, rs1143634, rs16944) IL2 (rs2069762) IL4 (rs2243250), IL6 (rs1800795) IL10 (rs1800871, rs1800896) IL17A (rs2275913) CD14 (rs34424920) TNFa (rs1800629) FCGR2A (rs1801274) осуществляли методом полимеразной цепной реакции с аллель-специфичными прайме­рами и с электрофоретической детекцией продуктов реакции в агарозном геле («Литех», Россия) в момент постановки диагноза.

Статистические методы. Распределение генотипов по каждому полиморфному локусу проверяли на соот­ветствие равновесию Харди — Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для сравнения частот аллелей между различными группами использовали χ² -крите­рий Пирсона с поправкой Йейтса на непрерывность. Дополнительно оценивали показатель отношения шансов — odds ratio (OR) с вычислением границ 95 %-го доверительного интервала (95 % CI). Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты

Генотепирование полиморфных локусов избранных генов иммунного ответа выявило различия в частоте обнаружения гаплотипов генов TLR6 (Ser249Pro), ILlft (G-1473C), IL2 (T-330G), IL4 (C-589T) и IL10 (G-1082A) у больных 1-й и 2-й групп (табл. 2). Исследование полиморфизма остальных генов: TLR2 (Arg753Gln), TLR3 (Phe421Leu) TLR4 (Asp299Gln, Thr399Ile), ILlft (T-31C, T-511C, C-3953T) IL6 (G-174C), IL10 (C-819T) IL17A (G-197A) CD14 (C-159T), TNFa (G-308A), FCGR2A (His166Arg) не обнаружило их участия в возникнове­нии бортезомиб-индуцированной ПП.

При анализе полученных данных отмечено, что груп - пу больных ММ с развитием ПП на фоне использова­ния режима VCD отличало гомозиготное носите льство аллеля «дикого» типа гена TLR6-249, гена ILlft-1473, гена IL4-589, гомозиготное носительство мутантного аллеля гена IL2-330 и присутствие мутантного аллеля в гомо- и гетерозиготном состоянии в локусе G-1082 гена IL10. Найденные различия повышали риск воз­никновения бортезомиб-индуцированной ПП у боль­ных ММ в 7, 3, 2, 7 и 4 раза соответственно.

Для поиска возможных гендерных различий прове­дено сравнение частот носительства аллелей и гапло- типов исследуемых генов среди мужчин и женщин в обеих группах. В группе больных ММ с наличием бортезомиб-индуцированной ПП не обнаружено до­стоверно значимых отклонений в частоте распреде­ления аллелей во всех 20 полиморфных локусах ге­нов иммунного ответа у мужчин и у женщин, также как и у мужчин 1-й и 2-й групп. Однако среди женщин обеих групп (в зависимости от наличия и отсутствия клинических признаков ПП) выявлены отличия, за­трагивающие полиморфные локусы генов TLR6, IL10- 819, IL2 (табл. 3).

Отмечено, что гомозиготное носительство аллеля «дикого» типа гена TLR6 (Ser249Pro), мутантного ал­леля гена IL2 (T-330G) и присутствие гетерозигот IL10 (G-1082A), повышало риск обнаружения бортезомиб-ассоциированной ПП у женщин с ММ более чем в 10 (р = 0,01), 14 (р = 0,01) и в 5 раз (р = 0,04) соответ­ственно. Найденные гендерные различия среди боль­ных ММ рекомендуется учитывать при проведении исследований дизайна «случай-контроль».

Обсуждение

Развитие токсичности лекарственных препаратов, применяемых при лечении онкогематологических за­болеваний, в ряде случаев ограничивает достижение полного и устойчивого терапевтического эффекта. Многочисленные генетические исследования при ММ в основном касались выявления генов-кандидатов, прогнозирующих характер течения заболевания, од­нако ни одной группе генетических маркеров не уда­лось завоевать первенство в качестве показателей эф­фективности и безопасности специфической терапии [9, 17, 19-21].

Лекарственно-индуцированной ПП, с точки зрения фармакогеномики, в последние годы также уделяет­ся большое внимание. В связи с растущим интересом к персонализированной медицине считается, что этот подход позволит выявить больных, у которых имеются вариации отдельных генов, увеличивающих риск раз­вития ПП, связанной с терапией, и при необходимости модифицировать лечение. Недавно опубликован крат­кий обзор генов и точечных мутаций в них, которые могут выступать в качестве прогностических маркеров развития ПП [3]. К сожалению, результаты таких ис­следований зачастую противоречивы. Тем не менее это направление исследований является весьма перспек­тивным, хотя и требует анализа значительного числа наблюдений, поскольку в большинстве работ основное внимание уделяется генам, участвующим в развитии неопластических процессов, а не генам, которые непо­средственно способствуют возникновению ПП с во­влечением иммунных механизмов [3, 6, 22, 23].

В представленном исследовании была проанали­зирована частота распределения гаплотипов 14 ге­нов иммунного ответа в 20 полиморфных локусах у 46 больных ММ, получивших лечение по схеме VCD, и оценена связь мутационного статуса исследованных генов с развитием лекарственно-индуцированной ПП. Данный подход позволил идентифицировать пять гаплотипов в генах TLR6, IL1β (G-1473C), IL2, IL4 и IL10 (G-1082A), носительство которых увеличивает риск развития ПП, что подтверждается выявлением стати­стически значимых различий.

В проведенных ранее работах, в которых изучалась роль полиморфизма генов иммунного ответа в возник­новении ПП при ММ, лишь C. Campo и соавт. [3] опи­сали связь между возникновением этого осложнения и мутационным статусом генов двух цитокинов IL10 и IL17. В целом мутации в этих генах влияют на конеч­ный уровень их транскрипции и приводят к изменению продукции кодируемых ими белков [24]. При гемобла- стозах опухолевые клетки, с одной стороны, способны самостоятельно продуцировать цитокины, снижая эф­фективность лекарственных препаратов, способствуя выживанию и росту опухолевых клеток. С другой — рост опухолевого клона регулируется цитокинами, ин­дуцирующими или ингибирующими пролиферацию трансформированных клеток [25].

Описано примерно 49 полиморфизмов гена IL10 [26]. Один из них — IL10-1082A>G локализован в прокси­мальной области промотора [24], который может иг­рать важную роль в развитии ММ [27], так как IL-10 является фактором роста, в том числе для трансфор­мированных плазматических клеток, аутокринно индуцируя продукцию онкостатина М. К тому же найдено, что высокие сывороточные концентрации ин­терлейкина-10 у больных ММ сопровождают прогрес­сирование заболевания. M. Rudzianskiene и соавт. [28] установили, что больные ММ, несущие гетерозигот­ный гаплотип гена IL10-1082, имели более выраженный ответ на проводимую радиотерапию очагов миеломного поражения костной ткани, чем больные с другими генотипами. Больные с гомозиготным гаплотипом гена IL-1082 с присутствием аллеля «дикого» типа гена IL10 были склонны к более быстрому облегчению болево­го синдрома (в первые 4 недели проведения лучевой терапии). Нами ранее найдено, что присутствие гено­типов с мутантным аллелем гена IL10 (G-1082A) уве­личивало риск возникновения ММ в 14 раз [29], чего, однако, не наблюдалось в исследованиях C. Zheng и соавт. и G. Mazur и соавт. [30, 31]. В представленном здесь исследовании тот же «прогностически неблагоприят­ный» мутантный статус гена IL10-1082 ассоциировал­ся с повышенной частотой обнаружения ПП (в 4 раза) у больных ММ при использовании бортезомиб-содер- жащего режима терапии VCD.

В группу повышенного риска развития ПП также вошли носители гомозиготного гаплотипа с аллелем «дикого» типа гена IL4. Интерлейкин-4 подавляет про- воспалительную активность макрофагов и секрецию ими интерлейкинов -1, -6 и фактора некроза опухоли, то есть так же, как и интерлейкин-10, оказывает про­тивовоспалительный эффект. С учетом того, что ин­терлейкин-4 поляризует иммунный ответ, патологи­ческий процесс может носить различный характер. При снижении выработки интерлейкина-4 моноци­тами и макрофагами продукция провоспалительных цитокинов не блокируется и происходит переклю­чение иммунного ответа на Тһ1-тип реагирования. Полиморфизм гена IL4 в большинстве случаев ассо­циирован с повышенной промоторной активностью гена и увеличением продукции интерлейкина-4. Это приводит к ингибированию функции макрофагов/ моноцитов, к снижению экспрессии FcR всех трех ти­пов, к угнетению антителозависимых цитотоксично­сти и фагоцитоза, к переключению иммунного ответа с Th1- на Тһ2-тип реагирования, для которого харак­терна стимуляция поликлональной активации В-лим- фоцитов [2]. Вероятно, обнаруженное в настоящем исследовании гомозиготное носительство аллеля «ди­кого» типа гена IL4 не способно блокировать реализа­цию провоспалительного иммунного ответа при раз­витии ПП у больных ММ.

Среди провоспалительных цитокинов у больных ММ с бортезомиб-индуцированной полинейропа­тией в настоящей работе выявлена высокая частота обнаружения «диких» гомозигот гена IL1fi (G-1473C) (р = 0,04) и мутантных гомозигот гена IL2 (T-330G) (р = 0,01). Показано, что опухолевые клетки при ММ высоко экспрессируют интерлейкин-1р [32], что мо­жет быть связно с наличием мутаций в гене. Однако в представленном здесь исследовании видно, что раз­витие ПП у больных ММ, леченных при помощи бор- тезомиба, напротив, наблюдалось чаще у носителей только аллеля «дикого» типа IL1fi (G-1473C). Струк­тура гена IL1fi весьма сложна. Он содержит 22 экзона и 9 интронов, подавляющее число которых являются альтернативными. Для этого гена характерна высокая степень гомологии интронных последовательностей, что, как предполагается, играет важную регулятор­ную роль в экспрессии этого гена [33].

Изменения в области промотора гена IL2 приводят к модификации его транскрипционной активности. Результаты исследования T. Watanabe и соавт. [34] продемонстрировали менее чем 3-кратное повышение уровня фитогемагглютинин индуцированной экспрес­сии мРНК IL2 у больных с бортезомиб-индуцирован­ной ПП. Тогда как у большинства больных без кли­нических симптомов данного осложнения уровень экспрессии мРНК IL2 после введения бортезомиба превышал более чем в 3 раза исходные значения. Та­ким образом, исследователи подтвердили гипотезу о том, что развитие ПП при лечении бортезомибом может быть связано с участием генов, регулирующих течение воспалительных процессов.

Экспрессия TLRs, как и рецепторов к цитокинам, обнаруживается и на неизмененных, и на опухоле­вых клетках. TLRs могут быть причастны к злокаче­ственной трансформации гемопоэтических клеток, прогрессии роста опухоли и к ее уклонению от им­мунного надзора [35]. В представленном исследова­нии найдено, что у гомозиготных носителей аллеля «дикого» типа гена TLR6 риск развития ПП на фоне применения бортезомиба был выше, чем в случаях вы­явления гаплотипов с мутантным аллелем (р = 0,006). Предполагается, что в данном случае аллель «дикого» типа выступал в качестве аллеля риска развития не­благоприятного осложнения лечения — ПП.

В результате поиска ассоциаций полиморфных за­мен в исследуемых генах с предполагаемым феноти­пическим эффектом были найдены гендерные особен­ности, затрагивающие гены TLR3 и TLR4 (Asp299Gln) у больных обоего пола, получивших терапию VCD без признаков ПП. Среди мужчин с ММ, в отличие от женщин, достоверно чаще встречались гомозигот­ные носители аллеля «дикого» типа гена TLR3 (р = 0,007) и мутантного аллеля гена TLR4 (Asp299Gln). TLR3 располагается в эндосомах клеток и может связываться с такими экзогенными патоген-ассоциированными паттернами, как двуспиральная РНК вирусов, а также с эндогенными веществами, образу­емыми в процессе повреждения тканей: двуспираль­ной и матричной РНК. Активация TLR3 индуциру­ет запуск NF-kB и продукцию интерферонов I типа. Установлено, что неизмененные и трансформиро­ванные клетки при ММ или вовсе не несут TLR3, или его экспрессия выявляется на очень низком уров­не, что, вероятно, может быть связано с особенностя­ми мутационного статуса гена, кодирующего данный рецептор [36]. Известно, что при ММ активация TLR4 способна усиливать пролиферацию и фор­мировать устойчивость опухолевых плазматических клеток к химиотерапии, а также увеличивать коли­чество регуляторных Т-клеток [37]. Таким образом, изучение особенностей формирования противоопу­холевого иммунитета играет важную роль в попыт­ках улучшить результаты лечения ММ.

В работе также установлено, что для женщин с ММ, получивших терапию VCD, характерными генетиче­скими маркерами риска развития ПП являлись: гомо­зиготное носительство аллеля «дикого» типа гена TLR6 (р = 0,01), мутантного аллеля гена IL2 (р = 0,01) и гаплотипы с мутантным аллелем гена IL10 в локусе -1082 (р = 0,04). Наряду с уже ранее описанными характеристи­ками полиморфного статуса генов IL2 и IL10, участие гена TLR6, вероятно, тесно ассоциировано с его ролью не только в установлении глубины ответа при лечении ММ, но и развитием осложнений этой терапии.

Возникновение ПП у больных ММ весьма трудно предупредить, поскольку на основании только кли­нических симптомов невозможно спрогнозировать, какие больные подвергаются более высокому риску развития данного осложнения. Попытки определить генетические факторы высокого риска развития ПП основаны на анализе ограниченного числа генов. Пло­хая прогностическая ценность таких классификаторов связана с отсутствием простых, широко признанных методов их обнаружения, которые могут использо­ваться при риск-адаптированной терапии больных. В настоящем исследовании использовали ассоциатив­ный подход для прогнозирования риска развития бор- тезомиб-индуцированной ПП с мутационным стату­сом ряда генов иммунного ответа с целью обнаружить ключевые из них.

Полученные результаты согласуются с гипотезой о том, что риск развития ПП на фоне лечения бортезомибом может быть опосредован мутациями в ге­нах, регулирующих механизмы развития иммунного ответа. Эти данные могут способствовать разработке будущих нейропротективных стратегий при терапии бортезомибом. Итоги цитогенетической/интерфаз­ной флуоресцентной in situ гибридизации уже ис­пользуются для принятия решений в аспекте выбора способа лечения ММ. Анализ профилей риска ток­сичности на основании оценки полиморфного ста­туса генов в перспективе будет включен в алгоритмы лечения. Идентификация рисков неблагоприятного воздействия бортезомиба приведет не только к более широкому применению нейропротективных препара­тов и с профилактической целью — противовоспали­тельных средств, но и позволит индивидуализировать схемы и дозы применения бортезомиба. Однако осто­рожно необходимо подходить к переносу результатов генетического определения риска токсичности в кли­ническую практику, так как снижение дозы препа­рата уменьшит эффективность лечения, что окажет влияние на выживаемость и качество жизни больных при прогрессии заболевания.