ХИМИОТЕРАПИЯ ПО ПРОГРАММЕ R-mNHL-BFM-90 В КОМБИНАЦИИ С ЛЕНАЛИДОМИДОМ КАК ТЕРАПИЯ ПЕРВОЙ ЛИНИИ У БОЛЬНЫХ MUM1-ПОЗИТИВНОЙ ДИФФУЗНОЙ В-КРУПНОКЛЕТОЧНОЙ ЛИМФОМОЙ И ФОЛЛИКУЛЯРНОЙ ЛИМФОМОЙ 3В ЦИТОЛОГИЧЕСКОГО ТИПА

Введение

В 2000 г. A.A. Alizadeh и соавт. [1] объяснили одну из главных причин гетерогенности ответа диффуз­ной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ) на стан­дартную химиотерапию (ХТ) по схеме R-CHOP (ритуксимаб, циклофосфан, винкристин, доксоруби- цин). Выделенные 2 молекулярных подтипа ДВККЛ герминального (GCB-ДВККЛ) и постгерминально- го происхождения (ABC-ДВККЛ) радикально от­личались по показателям беспрогрессивной (БПВ) и общей выживаемости (ОВ) [2]. В 2012 г. С. Visco и соавт. [3], проведя ретроспективный анализ ре­зультатов лечения 475 больных ДВККЛ, показали неэ фф ективность ХТ по схемам CHOP/R-CHOP у 40 % больных ДВККЛ. Кроме того, в зависимо­сти от группы риска по международному прогно­стическому индексу (IPI) [4] и выявленных молеку­лярных подтипов, у больных GCB-ДВККЛ низкой группы риска (0—1 балл) 5-летняя БПВ составила 86 % против 28 % у больных АВС-ДВККЛ из груп­пы высокого риска (4—5 баллов). Авторы [3] заклю­чили, что включение ритуксимаба в схему СНОР увеличивает БСВ и ОВ только на 10—15 % в общей группе больных ДВККЛ, при еще меньшем э фф екте в группах высокого риска.

Повышение эффективности терапии больных АВС-ДВККЛ в группе высокого риска — основная цель большинства исследований, посвященных те­рапии ДВККЛ. Интенсификация ХТ (R-CHOPE, R-CHOP-14, R-DA-EPOCH, NHL-BFM-90, mega-R- CHOP+Дтрансплантация аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ауто-ТГСК)), а также интег­рация новых таргетных препаратов в схему R-CHOP (эверолимус, бортезомиб, обинутузумаб, ибрутиниб) не повысили эфф ективность лечения больных АВС-ДВККЛ из группы высокого риска [5—8]. Поэто­му поиск эффективной терапии был продолжен.

В ряде работ показана высокая эффективность при­менения монотерапии леналидомидом у больных с ре­цидивом и прогрессией АВС-ДВККЛ [9, 10], а также в качестве первой линии в сочетании с ХТ по схеме R-CHOP [11-15].

Проведенные в дальнейшем молекулярно-генетиче­ские исследования [16, 17] позволили объяснить такое «селективное» действие леналидомида на опухолевые клетки АВС-ДВККЛ, в отличие от GCB-ДВККЛ. Было установлено, что активация сигнального пути В-клеточного рецептора и в последующем транскрип­ционного фактора NF-xB (nuclear factor kappa-light- chain-enhancer of activated B cells) приводит к стойкой экспрессии белка MUM1 (multiple myeloma 1), который является ведущим медиатором передачи активацион­ных сигналов на поздних этапах постгерминальной дифференцировки В-лимфоцитов АВС-ДВККЛ. Леналидомид является не только иммуномодулирующим препаратом. Он оказывает ингибирующее действие на экспрессию транскрипционного фактора MUM1, реализуя свое цитостатическое действие в В-клетках АВС-ДВККЛ [18]. Непосредственный механизм про­тивоопухолевого воздействия леналидомида основан на его способности связываться с цереблоном — основ­ным белком E3 убиквитин лигазного комплекса. В ре­зультате запускается механизм активной убиквитина- ции и протеосомной деградации транскрипционных факторов IKZF1/3 (непосредственных активаторов экспрессии MUM1) [19].

Подобно ДВККЛ, фолликулярная лимфома 3В цитологического типа (ФЛ3В) характеризуется зна­чительной гетерогенностью клинических и морфо­логических проявлений при схожем с АВС-ДВККЛ иммунофенотипе и профиле экспрессии генов. При отсутствии транслокации t(14;18) и негативности по CD10 для ФЛ3В характерна высокая экспрессия MUM1 [20, 21]. По сравнению с другими цитологиче­скими типами ФЛ прогноз при ФЛ3В хуже, а 5-летняя ОВ не превышает 45 % даже при применении антраци- клинсодержащих курсов ХТ [22, 23]. С целью повыше­ния эффективности терапии ФЛ3В, а также учитывая схожесть с АВС-ДВККЛ в экспрессии белка MUM1, обоснованно включение в схемы ХТ леналидомида.

Опубликованное описание успешного излечения больного АВС-ДВККЛ из группы высокого риска с применением комбинированной ХТ по программе R2-mNHL-BFM-90, что дает основания для интен­сификации «базовой» ХТ [24]. Это подтверждает­ся исследованием J. Godfrey и соавт. [25], в котором была показана высокая э фф ективность интенсифи­цированной ХТ по схеме R-DA-EPOCH с леналидо­мидом (R2-DA-EPOCH) у больных double-expressor lymphoma, которая была представлена преимущест­венно АВС-ДВККЛ. Все 10 больных, получивших терапию, достигли полной ремиссии при медиане на­блюдения 24 месяца [25].

В течение длительного времени в ФГБУ «НМИЦ гематологии» МЗ РФ для лечения агрессивных лимфом была адаптирована педиатрическая программа R-mNHL-BFM-90. Это позволило улучшить результа­ты лечения в общей группе, однако большинство неу­дач в терапии были связаны с АВС-подтипом ДВККЛ в группе высокого риска и ФЛ3В [26-28]. В настоящей статье представлены первые результаты применения интенсивной программы R2-mNHL-BFM-90 в лече­нии больных с АВС-ДВККЛ и ФЛ3В из группы высо­кого риска.

Цель работы — оценить эффективность и токсич­ность программы R-mNHL-BFM-90 с леналидомидом (R2-mNHL-BFM-90), а также проанализировать возможные причины резистентности к химиотерапии больных АВС-ДВККЛ и ФЛ3В.

Больные и методы

В протокол были включены все больные в возрасте от 18 до 70 лет с впервые установленным, по данным гистологического и иммуногистохимического иссле­дований биоптатов опухоли, диагнозом АВС-ДВККЛ (non-GCB-ДВККЛ — в иммуногистохимическом определении) и ФЛ3В цитологического типа, соглас­но критериям классификации всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [29], из группы промежуточ­но-высокого и высокого риска по IPI [4]. Не включа­лись больные с лимфатической опухолью в анамнезе, инфицированные вирусом иммунодефицита человека, а также с тяжелой сопутствующей патологией, пре­пятствующей проведению интенсивной ХТ. Помимо протокола обследования, принятого в ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава РФ [30], определяли стадию по Ann Arbor и группы риска по IPI [30], перед нача­лом ХТ проводили позитронно-эмиссионную томогра­фию (ПЭТ), совмещенную с компьютерной томогра­фией (КТ) (ПЭТ/КТ), выполняли диагностическую люмбальную пункцию, трепанобиопсию с определени­ем В-клеточной клональности методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в костном мозге [30]. Иммуногистохимическое исследование проводили с исполь­зованием антител к CD5, CD20, CD23, CD10, BCL2, BCL6, MUM1, Ki-67. Принадлежность к иммуногистохимическому варианту non-GCB-ДВККЛ опреде­лялась по алгоритму С. Hans [31].

Всем больным выполнялось стандартное цитогенети­ческое исследование (СЦИ) и флуоресцентная гибри­дизация in situ (fluorescence in situ hybridization — FISH) на интерфазных ядрах для выявления транслокаций с вовлечением локусов генов c-Myc/8q24, BCL2/18q21, BCL6/3q27 и делеции локуса гена TP53/17p13. Анализ мутаций в 1(2)-11 экзонах гена TP53 проводили в НИЦ «Курчатовский институт» (ДНК из периферической крови и костного мозга выделяли с использованием наборов OIAamp DNA Blood Mini Kit; ДНК из тканей выделяли с помощью обработки протеиназой К при 50° в течение 16-20 часов с последующей очисткой смесью фенолхлороформа; ДНК из парафиновых блоков вы­деляли с использованием набора Extract DNA FFPE; выравнивание и анализ полученных последовательно­стей проводили с использованием программы BioEdit v.3) и в ФГБУ «НМИЦ гематологии» МЗ РФ по про­токолам IARC (International Agency for Research on Cancer); ПЦР-продукты секвенировали с использо­ванием набора Big Dye Terminator v1.1 (Thermofisher Scientific, США) на автоматическом анализаторе ну­клеиновых кислот «Нанофор 05»; полученные после­довательности анализировали на наличие мутаций в онлайн-программе GLASS; вероятную патогенность проверяли в онлайн базах данных мутаций гена IARC, SESHAT и COSMIC) [32-35]. В НИЦ «Курчатовский институт» одному больному было выполнено полноэкзомное секвенирование на приборе NovаSeq 6000 по 150 нуклеотидов с каждого конца фрагмента. Далее полученные нуклеотидные чтения были картированы на геном человека GRCh38 из базы данных Ensenbl с помощью программного пакета bowtie2, функцио­нальный анализ значимости выявленных однонуклео­тидных полиморфизмов был проведен с помощью про­грамм SIFT и PolyPhen-2.

Все больные подписали информированное согласие перед проведением ХТ.

Протокол лечения включал проведение терапии блоками по программе R2-mNHL-BFM-90 (4-6 курсов, блоки А, В) [24]. Больные получали леналидомид в дозе 25 мг ежедневно с 1 по 10 день каждого цикла. Сопроводительная терапия проводилась согласно протоколам, принятым в ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава Росссии, при проведении интенсивной и высокодозной ХТ лимфатических опухолей [30].

Оценку эффективности терапии проводили с приме­нением лабораторных и инструментальных исследова­ний, ПЭТ/КТ, трепанобиопсии и определением В-кле- точной клональности методом ПЦР в костном мозге.

Статистический анализ данных проведен с исполь­зованием методов описательной статистики и ана­лиза выживаемости (по методу Каплана — Мейе­ра). Для бессобытийной выживаемости событием являлось развитие рецидива, прогрессии или смерти от любой причины, время отсчитывалось от начала ХТ. Для расчетов использовались статистические про­граммы StatView 4 и SAS 9.4.

Результаты

Терапия по протоколу R2-mNHL-BFM-90 была проведена у 8 больных. Диагноз non-GCB-ДВККЛ был установлен у 3 больных, ФЛ3В цитологического типа — у 5 больных. Средний возраст больных составил 52 года (от 36 до 69 лет). У всех больных определялась 3-4-я стадии заболевания по Ann Arbor (массивные конгломераты внутри- и забрюшинных лимфатических узлов, спленомегалия — 4 больных), экстранодальные очаги поражения (кости, мягкие ткани, миндалины, надпочечники, поджелудочная железа — 4 больных). Поражение костного мозга было выявлено у 1 больно­го. Повышение сывороточной активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) более чем в 2 раза от нормы (от 700 до 3700 ед/л при нормальных значениях 208-378 ед/л) отмечалось у всех 8 больных. Ни у одного больного по результатам исследования ликвора до начала лече­ния не выявлены патологические изменения клеточ­ного состава. В соответствии с International Prognostic Index (IPI) [36] все больные относились к промежуточ­но-высокой и высокой группе риска (табл. 1).

В соответствии с алгоритмом С. Hans и соавт. [31], у всех больных ДВККЛ определялся иммунофенотип В-клеток постгерминального этапа дифференцировки (non-GCB-ДВККЛ). У 3 из 5 больных ФЛ3В имелись признаки трансформации в ДВККЛ. У всех больных определялась мономорфная ядерная экспрессия белка MUM1 при отсутствии CD10. В 7 из 8 случаев опухоле­вые клетки были позитивны к BCL6. Экспрессия белка c-Myc определялась у 3 больных, у всех не выше 30 %. Маркер пролиферативной активности Ki67 составлял от 60 до 95 % опухолевых клеток.

СЦИ и/или FISH были проведены всем больным на клеточном субстрате и отпечатках опухолевых образ­цов. СЦИ исходно было выполнено 5 больным, из них комплексный кариотип с множественными хромосом­ными поломками был обнаружен у одного. При FISH исследовании у 5 больных выявлялись поломки в ло- кусе гена BCL6/3q27 (делеции, трисомии, дупликации), гена BCL2/18q21 (трисомии, дупликации), у 1 были вы­явлены дополнительные сигналы от гена c-Myc/8q24. Делеция 17р13 была обнаружена у 2 больных.

Патогенная мутация в гене TP53 в 7 экзоне, приводящая к замене аргинина в 249 позиции на серин (C.747G>T, p.Arg249Ser), была обнаружена только у одного больного (табл. 2).

Оценку токсичности терапии проводили по шкале ток­сичности National Cancer Institute — Common Toxicity Criteria (NCI-CTC) [37]. При проведении лечения ге­матологическая токсичность III/IV степени наблюда­лась у всех 8 больных. Однако время восстановления количества лейкоцитов крови после блока В составило не более 2 дней, после блока А максимальная продол­жительность нейтропении составила 15 дней. Продол­жительность тромбоцитопении составила от 0 до 6 дней после блока А и от 5 до 12 дней — после блока В.

Тяжелые инфекционные осложнения развились у 2 больных. У одного больного (№ 2) развилась тя­желая плевропневмония. У больной 69 лет (№ 3) по­сле 4 курса (блок А) в период миелотоксического агранулоцитоза развился сепсис смешанной этиологии (Pseudimonag aeruginosa, Staphylococcus epidermidis) и дву­сторонняя мультифокальная пневмония.

Всем больным для оценки эффективности тера­пии проводилось ПЭТ/КТ исследование. До начала терапии средний показатель SUVmax (стандартизи­рованный уровень захвата) составил 16 (от 12 до 30). Промежуточная ПЭТ/КТ выполнена 5 больным после 2 блоков: средний SUVmax составил 2,5 (от 1,48 до 3,1).

По окончании лечения средний SUVmax составил 1,78 (от 1,0 до 2,6).

Все больные завершили терапию по протоколу R2-mNHL-BFM-90. Шесть больных получили 4 блока, один больной — 6 блоков. У 1 больного в связи с нали­чием биохимических признаков почечной недостаточ­ности (повышение сывороточных концентраций креатинина до 0,247 ммоль/л и мочевины до 14 ммоль/л) из программы ХТ был исключен метотрексат. Одной больной в связи с тяжелой переносимостью ХТ (энте­ропатия, динамическая кишечная непроходимость) и достижением полной ремиссии после 2 блоков было проведено 2 курса R-EPOCH с леналидомидом.

Троим из 8 больных (все в возрасте до 55 лет) с кон­солидирующей целью была проведена трансплантация аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ау- то-ТГСК). В результате проведенной терапии у всех 8 больных была достигнута полная ремиссия (ПР) за­болевания, подтвержденная ПЭТ/КТ (табл. 3).

У одного больного (№ 2) через 2 месяца после завер­шения лечения развился рецидив. Несмотря на прове­дение противорецидивной ХТ, больной умер в резуль­тате прогрессии заболевания.

Учитывая единственную неудачу в лечении, был проведен кариологический и молекулярно-генетиче­ский анализ образцов опухоли до лечения и в момент развития рецидива. При СЦИ клеток биоптата лим­фоузла, взятого до лечения, не было выявлено хромо­сомных аберраций. Только методом FISH в 30 % ядер определялась транслокация с вовлечением локуса гена BCL6/3q27 и дополнительный сигнал от локуса гена BCL2/18q21. Делеция ТР53/17р13 и моносомия 17 не вы­являлись. Во время рецидива при СЦИ был выявлен клон с множеством субклонов, комплексными нару­шениями кариотипа (>20), включая дериваты хромо­сом 3, 14, 17, дицентрическими и маркерными хро­мосомами. Методом FISH выявлены транслокации с вовлечением локусов генов BCL6/3q27, IGH/14q32, два дополнительных сигнала от локусов гена IGH/14q32, до­полнительный сигнал от локуса гена BCL2/18q21 и де­леция ТР53/17р13.

Методом секвенирования по Сэнгеру была выявле­на патогенная мутация в 7-м экзоне гена ТР53. При ре­троспективной оценке материала, взятого до лечения, также была выявлена мутация в 7-м экзоне гена ТР53. В ходе дальнейшего исследования опухолевого образ­ца данного больного методом полноэкзомного секвенирования дополнительно были выявлены множест­венные мутации в генах MLL/KMT2A, ATM и CXCR5. У остальных 7 больных, у которых сохраняется ре­миссия заболевания, мутации в гене ТР53 выявлены не были. При среднем сроке наблюдения 11 месяцев (1—23) БСВ составила 87 % (рис. 1).

Обсуждение

В литературе нет информации относительно ком­бинации интенсивной ХТ и леналидомида у больных АВС-ДВККЛ и ФЛ3В. В настоящей работе впер­вые была оценена эффективность подобной комби­нации. Смертность, связанная с лечением, равна нулю, при максимальном возрасте больных 69 лет. У 7 из 8 больных достигнута ПР заболевания. Пока небольшие сроки наблюдения и число больных недо­статочны для окончательных выводов, но, учитывая прогностически неблагоприятную группу включен­ных в исследование больных, получение 87 % ПР дает основание для продолжения этого исследования.

Высокая экспрессия белка MUM1 при АВС-ДВККЛ и ФЛ3В, вероятнее всего, является «ахиллесовой пятой» для реализации таргетного воздействия леналидомида. При анализе данных литературы из многочисленных таргетных препаратов именно леналидомид оказал­ся наиболее успешно интегрирован в схему R-CHOP у больных АВС-ДВККЛ. По данным G.S. Nowakowski и соавт. [13], применение леналидомида в комбина­ции с R-CHOP (R2-CHOP) в первой линии терапии non-GCB-ДВККЛ позволило улучшить показатели 2- летней БПВ и ОВ по сравнению с больными, полу­чавшими лечение по программе R-CHOP (60 против 28 %, 83 против 46 % соответственно) и даже нивели­ровать разницу в ОВ в группах GCB-ДВККЛ и non- GCB-ДВККЛ. А. Castellino и соавт. [15] опубликовали отдаленные результаты, доказывающие преимущест­ва программы R2-CHOP, где в группе больных non- GCB-ДВККЛ 5-летняя БПВ и ОВ составили 64,5 и 74,1 %. В анализируемой группе у 88 % была диагно­стирована III-IV стадии заболевания, у 56 % IPI соста­вил 4-5 баллов. Несмотря на пожилой возраст боль­шинства больных (49 % больных были старше 70 лет), профиль гематологической и негематологической токсичности не отличался от таковых на программе R-CHOP. Таким образом, интеграция леналидомида в схему R-CHOP позволила нивелировать негативное влияние non-GCB подтипа ДВККЛ на прогноз. Од­нако, несмотря на полученное преимущество, от 20 до 30 % больных АВС-ДВККЛ остались резистентны к ХТ по схеме R2-CHOP [13].

Поэтому представляется рациональным не толь­ко применить леналидомид в первой линии терапии больных АВС-ДВККЛ, но и интенсифицировать ХТ. Была применена модифицированная программа R-mNHL-BFM-90, ввиду длительного и успешного опыта ее применения в терапии агрессивных лимфом [26, 27]. В отличие от схемы R-CHOP в данной про­грамме применяется принцип многокомпонентной блоковой терапии с применением сразу нескольких препаратов, различающихся по механизму действия (этопозид, цитарабин, метотрексат) (табл. 4). Влияние на разные фазы клеточного цикла и фракционирован­ный режим введения позволяют достичь максимально быстрой эрадикации опухолевого клона при лимфомах с высокой митотической активностью. В исследование были также включены больные ФЛ3В цитологиче­ского типа в связи со схожестью иммуноморфологических и молекулярно-генетических характеристик с АВС-ДВККЛ [38]. По профилю экспрессии генов, подобно АВС-ДВККЛ, для ФЛ3В также характерна активация генов сигнального пути NF-xB [39]. ФЛ3В, хотя и занимает «промежуточное» положение между ФЛ и ДВККЛ, клинически обычно имеет агрессивное течение. Даже несмотря на применение более агрес­сивных курсов ХТ, 5-летняя ОВ больных ФЛ3В неу­довлетворительна и не превышает 45 % [40]. Поэтому для лечения ФЛ3В было бы рационально руководство­ваться принципами лечения АВС-ДВККЛ.

В исследовании все больные относились к группе промежуточно-высокого или высокого риска по IPI: III-IV стадии, повышение активности сывороточной ЛДГ, ECOG > 2 [41], наличие экстранодальных оча­гов поражения. У всех выявлялась экспрессия MUM1 и отсутствие CD10, высокий индекс пролиферативной активности Ki67 (до 95 %). В отличие от ФЛ 1-2 ци­тологического типа, при которой частота поражения костного мозга составляет почти 90 %, ни у одного из больных ФЛ3В, включенных в исследование, пора­жение костного мозга выявлено не было (клиническая особенность, также характерная для ДВККЛ) [42].

Несмотря на имеющиеся в литературе данные о миелотоксическом воздействии леналидомида, гематологиче­ская токсичность у больных при выполнении данного протокола была приемлемой: максимальное время вос­становления нейтрофилов после блока В составило все­го 2 дня, после блока А — 5 дней. Только у 69-летней больной после 4 курса развился миелотоксический агранулоцитоз продолжительностью 15 дней.

В результате проведенной терапии у всех боль­ных удалось достичь ремиссии заболевания. Только у одного больного развился ранний рецидив, несмо­тря на то что в качестве консолидации ему была про­ведена ауто-ТГСК. В поисках возможных факторов прогноза такого резистентного течения заболевания были проанализированы клинико-лабораторные данные, полученные при первичном обследовании. Однако ни по одному из учитываемых параметров (распространенность, локализация, симптомы опухо­левой интоксикации, хромосомные поломки) различий по сравнению с другими больными выявлено не было. Единственным фактором неблагоприятного прогноза, выявленным только у данного больного, была мутация в гене ТР53. Вероятнее всего, клональная эволюция опухоли, с появлением нескольких субклонов, на фоне интенсивного цитостатического воздействия произош­ла именно при «выключенной» функции белка р53.

B. Chapuy и соавт. [43] в результате полногеномно­го секвенирования опухолевых образцов 304 больных ДВККЛ выделили в отдельный молекулярный кла­стер (С2) случаи с биаллельной мутацией в гене TP53. Вне зависимости от молекулярного подтипа эти слу­чаи часто сочетались с делецией 17р, генетической не­стабильностью и крайне неблагоприятным прогнозом.

При ДВККЛ мутации в гене ТР53 выявляются при­мерно в четверти случаев, являясь мощным негатив­ным фактором прогноза у больных как GCB-, так и ABC-ДВККЛ [44-49]. Однако при АВС-ДВККЛ они встречаются чаще [50]. Анализ, проведенный сре­ди 506 больных ДВККЛ в MD Anderson Cancer Center [46], показал статистически достоверное снижение ОВ и БРВ (р = 0,0005 и р = 0,0004) при наличии мутаций в гене ТР53. Однако важно отметить, что все исследо­вания касались больных, которые получали терапию по программе R-CHOP. Данные о прогностическом влиянии мутаций в гене TP53 на результаты интенсив­ной ХТ в комбинации с леналидомидом в мировой ли­тературе отсутствуют.

Таким образом, полученные положительные результаты дают основания для продолжения работы, увеличения чи­сла больных, сроков наблюдения, а также лабораторных данных по детекции мутаций в гене ТР53. В перспективе рационально проведение рандомизированного исследова­ния в группах больных с леналидомидом и без. Для боль­ных ДВККЛ и ФЛ3В с ранней идентификацией мутаций в гене ТР53, а также в случае резистентности к ХТ по про­грамме R2-mNHL-BFM-90, необходимо рассмотреть воз­можность проведения трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток или продолжить поиск других альтернативных схем ХТ.