ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ CYP3A5 И hOCT1 У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН

Введение

В настоящее время накоплено большое количество данных о распространенности, заболеваемости, прин­ципах диагностики и лечения больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) [1]. Успехи терапии позволили существенно изменить продолжительность и качество жизни больных ХМЛ и даже добиваться их излечения [2]. Однако существует проблема развития резистент­ности и прогрессии заболевания [3—6]. Проводятся исследования по изучению молекулярно-генетиче­ских основ ХМЛ, прогноза эффективности таргетной терапии на основании биологических характеристик ХМЛ и понимания молекулярно-биологических ме­ханизмов развития резистентности лечения [7—10]. По­казано, что при наличии мутаций у больных с ХМЛ в 20 % случаев могут встречаться дополнительные хромосомные аберрации или комплексные аномалии, что значимо ухудшает 10-летнюю выживаемость и ле­тальность у больных ХМЛ по сравнению с больными, не имеющими этих нарушений [11].

ХМЛ возникает в результате приобретенного по­вреждения хромосомного аппарата одной полипотентной стволовой клетки костного мозга. Причина такого повреждения хромосом у больных ХМЛ пока остается неизвестной [12—15]. Механизмом, обуслов­ливающим развитие заболевания, является реципрокная транслокация t(9,22), (q34;q11), объединяю­щая гены тирозинкиназы ABLl (хромосома 9) с геном BCR (хромосома 22) с образованием филадельфий­ской хромосомы (РҺ+) [16]. При этом химерный белок ВСК-АВЬ1 обладает выраженной тирозинкиназной активностью, блокирует апоптоз и стимулирует авто­номную пролиферацию клеток [14, 17, 18]. На долю ХМЛ приходится 20 % от всех лейкозов у больных в возрасте 30—70 лет [6]. Ежегодно в России регистри­руется около 2500 новых случаев ХМЛ (1—2 случая на 100 тыс. населения) [19]. Стандартизованная забо­леваемость по 6 регионам России составляет 0,7-0,8 случаев на 100 000 населения [20].

В исследованиях установлены очень хорошие резуль­таты лечения ингибиторами тирозинкиназ (ИТК), если к 12 месяцам терапии ИТК 1 линии достига­ется оптимальный ответ, то дальнейшая прогрессия исключается [15, 21]. Однако по мере накопления ко­личества наблюдений становится очевидным, что чи­сло больных с резистентностью к иматинибу увели­чивается с каждым годом [22]. Примерно у 15-30 % больных ХМЛ наблюдается первичная или вторич­ная резистентность к лечению иматинибом мезилатом [23-27]. Учитывая, что у больных ХМЛ, в зави­симости от наличия или отсутствия мутаций в гене BCR-ABL, а также от типа мутаций, наблюдается раз­личный терапевтический эффект на ИТК, актуаль­ным является ранняя идентификация мутаций гена BCR-ABL, что позволяет своевременно определить факторы риска неблагоприятного прогноза течения заболевания, ответ на проводимую терапию и назна­чить адекватное лечение с целью получения ее мак­симальной эффективности [11]. Резистентность к те­рапии может проявляться и при отсутствии мутаций киназного домена, следовательно, есть необходимость изучения новых механизмов образования резистент­ного к лечению фенотипа, например генов, участвую­щих в метаболизме ИТК, наличия аберрантной экс­прессии онкогенов и супрессоров опухолевого роста у больных ХМЛ [26, 28]. Поскольку в исследованиях, посвященных изучению однонуклеотидных полимор­физмов генов (SNR) при ХМЛ, чаще обнаруживалась ассоциация полиморфизма гена CYP3A5 (rs 7776746) и гена hOCTl M408V (rs628031) с ответом на лечение иматинибом, была изучена связь этих полиморфиз­мов с резистентностью к терапии и общей выживае­мостью больных в многонациональной Республике Башкортостан (РБ) [29-31]. Однако изучение влия­ния этногенетических особенностей больных на по­лученные результаты не проводилось в связи с ма­лочисленностью выборки. Все это свидетельствует о необходимости продолжения исследований в этой области для более полного понимания патогенетиче­ских механизмов развития заболевания и персонифи­цированного подхода к проводимому лечению в раз­личных регионах.

Цель настоящей работы — установить прогностиче­ское значение полиморфных вариантов генов, участ­вующих в метаболизме ИТК, CYP3A5 и hOCTl у боль­ных ХМЛ, и оценить их влияние на эффективность лечения и продолжительность жизни.

Материал и методы

В работе использованы образцы ДНК, выделенные из периферической крови 114 больных (55 мужчин и 59 женщин), проживающих в Республике Башкорто­стан, с клинически и цитогенетически установленным диагнозом ХМЛ. Все больные получали лечение пре­паратом ИТК согласно рекомендациям Европейского общества по лечению лейкозов European Leukemia Net (ELN) [15]. В группе больных, включенных в исследо­вание, медиана возраста на момент постановки диагноза составила 43 года (от 14 до 76 лет). На момент исследова­ния у 100 (87,7 %) больных была хроническая фаза ХМЛ, у 11 (9,6 %) больных — стадия акселерации и у 3 (2,6 %) больных — стадия бластного криза. Длительность тера­пии составила от 6 до 205 мес. (медиана — 65,5 мес.). 

Для сравнения больных с различной эффективно­стью лечения была сформирована группа из 64 боль­ных, резистентных к проводимой терапии. Отсутст­вие гематологического и цитогенетического ответов после 3, 6, 12 и 18 мес. лечения, а также субоптималь- ный ответ и потеря уже достигнутого гематологиче­ского и цитогенетического ответов рассматривались как проявления резистентности. В эту группу входили 30 (47%) мужчин и 34 (53%) женщины, средний воз­раст — 46 лет. Сравниваемые группы были сопостави­мы по полу и возрасту.

Исследование было одобрено этическим комитетом. Больные дали информированное согласие на участие в исследовании.

Анализ полиморфных ДНК-локусов генов hOCTl и CYP3A5 осуществляли методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и ПДРФ-анализом с последую­щим электрофорезом в 7-8 % полиакриламидном геле.

Для определения полиморфных вариантов в генах hOCTl и CYP3A5, использовали метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Для ам­плификации использовали реакционную смесь объе­мом 25 мкл, которая содержала 2,5 мкл 10 хTaq- буфера (67 мМ трис-HCl (pH 8,8), 16,6 мМ (NH4)2 SO4, 2,5мМ MgCl2, 0,01% Тween-20), 0,1 мкг геномной ДНК, смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP по 200 мкМ каждого), 1 ед. ДНК-полимеразы Termus aquaticus (производства фирмы «Силекс», г. Москва) и 5-10 пМ локусспецифич- ных олигонуклеотидных праймеров. Результаты ампли­фикации анализировали в 7 % полиакриламидном геле с последующей окраской в растворе бромистого этидия (конечная концентрация 0,1 мкг/мл) и визуализацией в проходящем УФ-свете при длине волны 312 нм.

После амплификации 10 мкл амплификата обраба­тывали 5 единицами соответствующей рестриктазы согласно рекомендациям производителя. Результаты рестрикционного анализа оценивали при проведении электрофореза в 7 % ПААГ с последующим окрашива­нием бромистым этидием и визуализации под ультра­фиолетовыми лучами. Данные о полиморфных вариан­тах и названия рестриктаз представлены в таблице 1.

Статистическая обработка полученных данных про­водились на персональном компьютере с использовани­ем программы Microsoft Office Excel и пакета приклад­ных программ статистической программы Statistica 6.0 for Windows, SAS v.9.3. Для оценки продолжительности жизни в зависимости от генотипа полиморфных локусов генов CYP3A5 и hOCTl был проведен анализ выжи­ваемости методом Каплана — Мейера.

Результаты

При установлении диагнозау всех больных ХМЛ в РБ проведен анализ по критериям риска J. Sokal, Euro [2], с классификацией риска на низкий, промежуточный и высокий (табл. 2).

Таким образом, у больных ХМЛ в РБ выявлялся пре­имущественно низкий и промежуточный риск прогрес­сии заболевания. Наблюдение и лечение больных ХМЛ в РБ не выявило каких-либо региональных особенно­стей заболевания и соответствовало критериям ELN, что позволило организовать диагностику и лечение этой категории больных по общемировым стандартам.

Ранее было показано, что у некоторых больных ХМЛ в РБ мутации киназного домена гена BCR-ABL являются одной из основных причин резистентности к терапии иматинибом [10]. Больные с выявленными мутациями исключались из дальнейшего исследования полиморфных вариантов генов.

С целью изучения BCR-ABL независимых механизмов резистентности к лечению ИТК у больных ХМЛ в РБ проведен анализ распределения частот аллелей и гено­типов полиморфного локуса rs776746, локализованно­го в интроне 3 (chr7:99108475) гена изофермента P3A5 цитохрома p450 (CYP3A5) участвующего в фармакоки­нетике ИТК. Между больными с разной эффективно­стью лечения ИТК не было обнаружено выраженных различий в распределении частот аллелей и генотипов данного полиморфного локуса (p > 0,05) (табл. 3).

Анализ распределения у больных ХМЛ частот генотипов полиморфного локуса rs776746 в гене CYP3A5 показал, что с наиболее высокой частотой (71,68 %) встречался гомозиготный генотип *G*G, гетерозиготный генотип *A*G определялся в 28,32 % случаев, гомозиготный генотип *А*А выявлен не был.

Для оценки продолжительности жизни в зависимо­сти от генотипа полиморфного локуса rs776746 гена CYP3A5 был проведен анализ выживаемости с помощью метода Каплана — Мейера (рис. 1). Средняя продолжи­тельность жизни у больных с генотипом GA составила 190,3 ± 15,1 мес., с генотипом GG — 154,9 ± 7,2 мес. Раз­личия в продолжительности жизни не достигли уровня статистической значимости (лонг-ранг тест, р = 0,755).

Распределение частот аллелей и генотипов поли­морфного варианта rs683369 в гене переносчике ор­ганических катионов (hOCTl) между группами боль­ных с разной эффективностью лечения ИТК показало, что генотип *C*C достоверно чаще выявлялся у больных ХМЛ с оптимальным ответом на лечение — в 75,00 % случаев по сравнению с больными, рези­стентными к лечению — 53,57 % (χ2 = 3,94, p = 0,04, отношение шансов (ОШ) = 0,38; 95 % доверительный интервал (ДИ) 0,14—1,00) (рис. 2).

При сравнении распределения частоты встречаемости генотипа *C*G, она оказалась почти в два раза выше у больных ХМЛ, резистентных к терапии, — 42,86 % по сравнению с группой больных с оптимальным ответом на лечение ИТК — 21,88 % (χ2 = 3,92, p = 0,04, ОШ = 2,67 (95 % ДИ 0,99-7,21).

При анализе выживаемости в зависимости от гено­типа полиморфного локуса rs683369 гена hOCTI по­казаны статистически значимые различия (лонг-ранг тест, р = 0,018) (рис. 3).

Неблагоприятным для продолжительности жизни являлся генотип GG, средняя продолжительность жизни при его наличии составила 96,3 ± 46,3 мес. Продолжительность жизни у больных с генотипом GC занимала промежуточное значение 139,0 ± 9,2 мес. Наиболее благоприятным для прогноза являлся генотип СС, средняя длительность жизни при его наличии составляла 197,7 ± 11,0 мес.

Обсуждение

Проведенный анализ эпидемиологических данных в РБ за период 2000-2016 гг. показал, что зарегистри­рованная первичная заболеваемость ХМЛ в 2016 г. составила 0,44 на 100 000 всего населения и 1,01 на 100 000 взрослого населения. Средний показатель в РБ за последние 5 лет составил 0,62 ± 0,10 (по дан­ным ВОЗ — 0,7). Заболеваемость имеет тенденцию к росту, распространенность за последние 8 лет выро­сла в 4 раза, что связано с возможностью выявления Ph-хромосомы и/или гена BCR-ABL, созданием и ве­дением регистра больных ХМЛ с 2008 г., внедрением терапии ИТК и, как следствие, увеличением продол­жительности жизни больных. Показатели смертности имеют лишь тенденцию к снижению за исследуемый период времени [32]. Данные результаты свидетель­ствуют о том, что существует группа больных, рези­стентных к терапии ИТК, и прогрессия заболевания даже при проведении терапии приводит к их гибели. Авторы из Вьетнама показали, что применение ИТК нивелирует влияние классических прогностиче­ских факторов и требует разработки новых подходов к оценке риска для больных ХМЛ [33]. Поэтому по­иск причин неудачи лечения и преодоления резистент­ности терапии ИТК остается актуальной проблемой рутинной практики не только в целом, но и в различ­ных регионах. Примерно у 20-30 % больных выявля­ется резистентность к иматинибу [25]. Возникновение устойчивости к ИТК является следствием взаимо­действия многих факторов. Эти факторы включают в себя схему лечения, фармакодинамику ИТК, гене­тические изменения, мутации BCR-ABL киназного домена или комбинацию из этих факторов [25]. Уста новление частоты встречаемости мутаций и их ком­бинаций позволяет на ранних этапах переключаться на новые схемы лечения [6-8, 11]. Проведенные ранее исследования 50 больных ХМЛ в РБ, резистентных к иматинибу, подтвердили, что мутации киназного до­мена гена BCR-ABL являются одной из основных при­чин резистентности. У 32 % больных, резистентных к терапии ИТК, с высоким уровнем экспрессии гена BCR-ABL в РБ выявлялись такие мутации киназного домена гена BCR-ABL, как: M244V — 2 %, T315I — 17 %,

M351T — 20 % и H396R — 2 %. Наиболее высокий (ме­диана экспрессии 442,3 %) средний уровень экспрес­сии химерного гена наблюдался у больных с компа­унд-мутацией T315I + M351T — 9 %, а также больных с мутацией M351T (медиана экспрессии 94,6 %). При­чем мутация M351T являлась самой распространенной мутацией [9]. По данным литературы [18], частота мутации M351T у больных ХМЛ в Германии состав­ляет только 6 %, в Италии и Австралии — до 11 %. В обзоре, посвященном BCR-ABL зависимым и незави­симым механизмам резистентности к лечению ИТК, E.J. Jabbour и соавт. [34] ставят задачи по разработке стратегии лечения при первичной и вторичной устой­чивости к современным методам лечения.

Межиндивидуальная вариабельность ответа на лече­ние среди больных ХМЛ привела к поиску механизмов, ответственных за такую вариабельность. Изучают­ся BCR-ABL независимые механизмы резистентности к лечению ИТК. D. Kim и соавт. [29] показали, что, ис­пользуя новый подход с оценкой нескольких ген-кан­дидатов, основываясь на фармакогенетике иматиниба, можно предсказать результаты лечения. В этом ис­следовании проведен скрининг 16 однонуклеотидных полиморфизмов (SNR) в 5 генах у 229 больных ХМЛ. Установлено, что генотип GG в ABCG2 (rs2231137), ге­нотип AA в CYP3A5 (rs 7776746) были в значительной степени ассоциированы с неэффективным лечением иматинибом, а генотип GG в SLC22A2 (rs683369) в позд­ней стадии коррелировал с высоким уровнем потери ответа или неудачей терапии [30]. У больных из Ма­лайзии, у которых был выявлен гетерозиготный AG и гомозиготный вариант GG генотипа CYP3A5, был зна­чительно меньше риск развития резистентности к иматинибу [35]. Другие авторы [31] в когорте 106 больных ХМЛ показали, что два полиморфизма гена CYP3A5 (rs 7776746) и гена hOCT1 M408V (rs628031) были до­стоверно связаны с полным цитогенетическим ответом (ПЦГО) через 6 месяцев и полным молекулярным от­ветом (ПМО) через 12 месяцев лечения. N.A. Hamed и соавт. [32] не нашли ассоциации полиморфизма гена hOCT1 С480G с ответом на лечение у больных из Егип­та. В следующем исследовании генотип *G*G (480C>G (F160L), rs683369) в гене hOCT1 при прогрессии ХМЛ коррелировал с высокой вероятностью появления ре­зистентности к терапии [29]. М. Gromicho и соавт. [23] обнаружили, что в большинстве изученных ими рези­стентных клеточных линий были сверхэкспрессирова- ны несколько белков переносчиков, а именно ABCB1, ABCG2, MVP и hOCT-1.

Несмотря на большое число опубликованных ста­тей, посвященных исследованию полиморфизма генов, участвующих в фармакогенетике и фармакодинамике ИТК, неоптимальным ответом больных ХМЛ на таргетную терапию ИТК, до сих пор точно не известно, какой из них является самым решающим для приобретения резистентности клетками ХМЛ к иматинибу. В насто­ящем исследовании, в отличие от литературных дан­ных, в выборке больных из РБ не встречался генотип AA в CYP3A5 (rs 7776746), ассоциированный с резистент­ностью к ИТК, а между больными с разной эффектив­ностью лечения ИТК не было обнаружено достоверных изменений в распределении частот аллелей и генотипов CYP3A5. Распределение частот генотипов полиморфного варианта rs683369 в гене переносчике органических ка­тионов (hOCT1) между группами больных с разной эф­фективностью лечения ИТК показало, что генотип G*G* встречался редко и также был ассоциирован с наимень­шей продолжительностью жизни больных, генотип *C*C достоверно чаще выявлялся у больных ХМЛ с оптималь­ным ответом на лечение по сравнению с больными, ре­зистентными к лечению. Частота встречаемости геноти­па *C*G была почти в два раза выше у больных ХМЛ, резистентных к терапии ИТК. Изучение клинико-гене­тических ассоциаций при ХМЛ позволяет уточнить не­которые механизмы развития резистентности к терапии в разных регионах, совершенствовать индивидуализиро­ванный подход при выборе лечебной тактики и в общем прогнозе заболевания.

Таким образом, исследование полиморфного локуса rs683369 гена hOCT1 в отличие от rs776746 гена CYP3A5 имеет прогностическое значение в оценке эффективно­сти лечения ИТК больных ХМЛ в РБ. Частота встре­чаемости генотипа *С*G была значимо выше у боль­ных ХМЛ, резистентных к терапии ИТК, генотип G*G* встречался реже и был ассоциирован с наимень­шей продолжительностью жизни, а наличие генотипа С*С* оказалось благоприятным для общей выживае­мости больных.