Микробиологическая безопасность компонентов крови и эффективность мер по ее совершенствованию

Введение

Инфекционная безопасность донорской крови и ее компонентов за последние десятилетия значительно повысилась прежде всего за счет улучшения качест­ва диагностики возбудителей вирусных инфекций, передающихся с переливанием крови и ее компонен­тов. На этом фоне успехи по снижению риска бакте­риальной контаминации компонентов крови, ведущей к развитию сепсиса у реципиентов, незначительны, что делает эту проблему актуальной [1][2][3][4]. В период с 2012 по 2016 г. в США отмечено 18 случаев трансфу­зий компонентов крови, которые были контаминированы бактериями, что привело к развитию у реципи­ентов сепсиса и смертельным исходам. Они включали 7 случаев, связанных с переливанием эритроцитсо­держащих компонентов (ЭСК), 8 случаев, связанных с переливанием аферезных концентратов тромбоци­тов (КТ), 2 случая, связанных с переливанием пулированных КТ, полученных из дозы крови, и 1 слу­чай, связанный с переливанием свежезамороженной плазмы (СЗП). Среди доказанных причин смерти реципиентов, связанных с переливанием компонен­тов крови, бактериальная контаминация занимает 4-е место (10 % случаев) после обусловленного транс­фузией острого повреждения легких (30 % случаев), трансфузионной циркуляторной перегрузки (18 % случаев) и трансфузионных гемолитических реакций (18 % случаев) [5]. Анализ причин гемотрансмиссивных инфекций за период 2010—2016 гг. в США пока­зал, что 69 % (37 из 54 случаев) были бактериального происхождения, 30 % (16 из 54 случаев) — паразитар­ного, 2 % (1 из 54) — вирусного [6]. Это потребовало разработки стратегии снижения риска бактериальной контаминации донорской крови и ее компонентов [2][7][8][9]. Первоначально исходили из того, что микроб­ная контаминация компонентов может происходить с кожи донора, с оборудования для заготовки крови, из донорской крови, попадать в кровь в процессе обра­ботки и хранения. На основании этого мероприятия, снижающие риск микробной контаминации, вклю­чали совершенствование рецептуры (использование хлоргексидина) и двукратную обработку кожи лок­тевого сгиба, наличие дополнительного контейнера для заготовки первой порции (40—50 мл) донорской крови, проведение бактериологического тестирования компонентов крови в сроки через 24 ч после заготовки. Это позволило снизить риск микробной контаминации на 50—75 % [7][8][10]. Внедрение системы гемонадзора (hemovigilance) также способствовало снижению ри­ска микробной контаминации компонентов крови [11]. Широкое применение для микробиологического ана­лиза получили системы ускоренного бактериального контроля типа BacT/ALERT [7][10][12], позволившие снизить риски на 2/3 от предыдущего уровня [12]. Тем не менее считается, что только 20—40 % контаминированных доз компонентов крови выявляются при таком тестировании [9]. Поэтому совершенствование страте­гии снижения риска микробной контаминации ком­понентов крови включало следующие основные меро­приятия: применение патогенредукции для СЗП и КТ, повторное тестирование на бактериальные продукты методами иммуноанализа, повторное бактериологиче­ское тестирование [10][12][13].

Считается, что наибольший риск бактериальной кон­таминации имеют КТ, которые хранятся при комнат­ной температуре [11]. Помимо КТ, опасность микроб­ной контаминации высока для ЭСК, имеющих более длительные (до 28—45 дней) сроки хранения до кли­нического использования, что увеличивает риск вы­явления положительных результатов бактериальной контаминации [14][15].

Цель настоящего исследования — оценить динами­ку обнаружения микробной контаминации компонен­тов крови и меры по ее снижению.

Материалы и методы

Микробиологический анализ проводили в соответ­ствии с требованиями приказа Министерства здра­воохранения Республики Беларусь № 325 от 6 апре­ля 2018 года «Об утверждении Перечня требований по безопасности и качеству крови, ее компонентов, заготавливаемых от доноров или производимых раз­личными методами из крови доноров и предназначен­ных для оказания медицинской помощи и иных целей». Микробиологическому анализу подвергали 1 % от всех заготовленных доз компонентов крови, но не менее 4 доз в месяц. Для микробиологического анализа отбирали дозы компонентов крови через 24 часа от момента заго­товки (ЭСК, КТ, СЗП), а также ежеквартально к кон­цу карантинного 3-месячного хранения дополнительно отбирались для исследования 10 доз СЗП. Проведение микробиологического анализа осуществляли работни­ки лаборатории бактериологического контроля отдела управления качеством и внутреннего аудита РНПЦ ТМБ. Был использован автоматический анализатор гемокультур BacT/ALERT 3D, использующий колори­метрический метод детекции роста бактерий за счет изменения цвета красителя при изменении рН среды флакона при размножении бактерий во время куль­тивирования. Питательные среды BacT/ALERT могут определить 98 % изолятов бактерий, грибов и дрожжей в течение 24—48 часов инкубации. При получении пер­вично положительного результата выполняли пересев из всех подозрительных флаконов на мясо-пептонный агар (МПА) (с последующей инкубацией в течение 24— 48 часов при температуре 32,5 ± 2,5 °C) и приготавлива­ли мазки с окраской по Граму для микроскопического подтверждения микробного роста.

Исследования содержания аэрозольных частиц в воздухе проводили 1 раз в неделю с использова­нием счетчика аэрозольных частиц AEROTRACK 9306 (TSI Inc., США) в соответствии с инструкцией по использованию аппарата. Минимальное количе­ство точек отбора и объем пробы воздуха для оцен­ки концентрации аэрозольных частиц определял­ся в соответствии с требованиями ТКП 435—2017 (33050) «Производство лекарственных средств. Квалификация чистых помещений».

Микробиологические испытания воздуха выполня­ли во время работ по заготовке крови в помещениях от­деления заготовки крови РНПЦ ТМБ. Кратность от­бора проб воздуха колебалась от 1 раза в день до 1 раза в неделю в зависимости от класса чистоты помещения и критичности выполняемой процедуры. Количество контрольных точек зависело от площади и категорийности помещения. В каждой контрольной точке пробы отбирали седиментационным методом на две чашки Петри (диаметр 90 мм) с питательной средой для выращивания бактерий (среда № 1) и на две чаш­ки Петри со средой для выращивания грибов (среда № 2). Время экспозиции чашек с питательными среда­ми — не менее времени выполнения критических опе­раций, но не более 4-х часов. После отбора проб воз­духа чашки помещали в термостат для последующего культивирования в течение 5 суток при температуре 32,5 ± 2,5 °C (среда № 1) и 22,5 ± 2,5 °C (среда № 2).

После окончания инкубации проводился подсчет ко­личества колоний микроорганизмов, образовавшихся в каждой чашке Петри. Результаты учитывали как ко­личество колониеобразующих единиц за 4 часа бакте­рий или грибов на чашку Петри.

На основании результатов оценки ключевых эле­ментов (воздух, персонал, поверхности) программы мониторинга производственной среды отделения заготовки крови при получении первично положи­тельных результатов оценки риска микробной кон­таминации компонентов крови проводилось эпи­демиологическое расследование каждого случая бактериальной контаминации с целью установле­ния источника контаминации. Анализ результатов микробиологического мониторинга позволил уста­новить источники контаминации в 13 случаях рас­следования причин бактериальной контаминации компонентов крови (в одном случае источник конта­минации установлен не был).

Статистическая обработка данных. Данные представ­лены в количественном выражении по годам исследо­вания. При расчете интенсивности контроля и случаев положительных проб принимался во внимание пуассоновский характер распределения редких событий. Расчеты проводились в специализированном пакете Join Point версия 4.5. Использовалась пуассоновская модель трендов интенсивности событий во времени. Ежегодные частоты рассчитывались на 100 доз. Уровень статистической значимости в исследовании (α) принимался равным α = 0,05.

Результаты

Микробиологическая контаминация компонентов крови и профиль выделенных микроорганизмов

Микробиологический анализ компонентов крови, отобранных при их заготовке в РНПЦ ТМБ, дал еди­ничные положительные результаты (от 1 до 5 случаев в год) в течение 2012—2015 гг. (табл. 1). В 2017 и 2018 гг. положительные результаты отсутствовали. Наиболь­шее количество положительных результатов было выявлено при микробиологическом анализе ЭСК, и наименьшее — при анализе аферезных КТ и ком­понентов плазмы. Анализ выросших культур ми­кроорганизмов показал, что компоненты крови были контаминированы грамположительными кокками — представителями семейства Staphylococcus spp. (п = 12) и в единичных случаях — грамположительными палочками Propionibacterium spp. (п = 1) и грамотрицательными палочками Escherichia coli (п = 1). Среди грамположительных кокков Staphylococcus spp. выяв­лены S. epidermidis (п = 8), а также S. saprophyticus (п = 4). ЭСК были контаминированы как грамположитель­ными кокками (S. epidermidis, п = 5, S. saprophyticus, п = 2), так и грамположительной палочкой (Propionibacte- rium spp., п = 1).

Из бактериально контаминированных КТ были выделены Escherichia coli (n = 1), S. saprophyticus (n = 1), S. epidermidis (n = 1). Компоненты плазмы были конта­минированы S. epidermidis (n = 2), S. saprophyticus (n = 1).

Расследование причин положительных результатов микробиологического анализа позволило установить источники контаминации (n = 13). Медицинский пер­сонал (n = 12) чаще всего выступал источником конта­минации грамположительными кокками (Staphylococcus spp.). Аэрозольные частицы размером 5,0 мкм рассма­тривались как возможный источник грамположительных палочек (Propionibacterium) в 1 случае на основании идентичных фенотипических характеристик бакте­рий, выделенных при микробиологическом исследо­вании воздуха и компонента крови (ЭСК). При этом учитывали тот факт, что количество частиц размером 0,5 мкм в контрольных точках соответствовало требо­ваниям, а количество частиц размером 5,0 мкм превы­шало допустимые значения более чем в 3,1 раза. Один источник контаминации не был установлен (для КТ — Escherichia coli (n = 1)).

Связь микробиологической контаминации с объемом заготовки и отбора доз компонентов крови для анализа

Оценка связи частоты положительных результатов микробиологического контроля отдельных компонен­тов крови (в первую очередь — ЭСК и КТ) с объемами заготовки и количеством отобранных проб для конт­роля показала, что в течение 2012—2018 гг. прирост объема заготовки доз ЭСК составил в среднем 13,83 % (табл. 2). За это время наблюдался статистически зна­чимый прирост количества доз ЭСК, отобранных для микробиологического контроля (р = 0,043), кото­рый составил 1,01 (95 % доверительный интервал (ДИ) 0,91-1,13) в 2012 г. и 1,53 (95 % ДИ 1,41-1,65) в 2018 г.

в пересчете на 100 заготовленных доз компонента кро­ви. Это сопровождалось статистически значимым сни­жением частоты выявления положительных резуль­татов микробиологического анализа ЭСК (р < 0,001) с 1,21 (95 % ДИ 0,39-3,28) в 2012 г. до 0 (95 % ДИ 0-0,8) в 2018 г. на 100 доз ЭСК, отобранных для микробиоло­гического анализа. Ежегодное уменьшение количест­ва положительных результатов микробиологического контроля за этот период составило 38,3 % (95 % ДИ 28,2-47,0 %).

При микробиологическом контроле доз КТ, заготов­ленных аферезным способом, не было выявлено поло­жительных проб за все указанные годы наблюдения (2012-2018 гг.). Среднее количество доз КТ, отобран­ных для микробиологического исследования, состави­ло 1,07 на 100 заготовленных доз аферезных тромбоци­тов (95 % ДИ 1,01-1,13) (табл. 3). Микробиологический контроль доз КТ, заготовленных из цельной крови, пе­риодически давал положительные результаты без вы­раженной тенденции к изменению за наблюдаемый период (наблюдалось незначительное нарастание час­тоты количества положительных результатов на 0,17 % в год). При этом в период с 2012 по 2015 г. наблюдалась тенденция к увеличению частоты отбора проб для ми­кробиологического анализа (р = 0,064) с 6,05 (95 % ДИ 5,45-6,72) в 2012 г. до 13,39 (95 % ДИ 12,36-14,49) в 2015 г. на 100 заготовленных доз КТ из цельной кро­ви. В период с 2015 по 2018 гг. наблюдалось статисти­чески значимое уменьшение частоты отбора доз КТ, полученных из цельной крови (р = 0,031) с 13,39 (95 % ДИ 12,36-14,49) в 2015 г. до 3,4 (95 % ДИ 2,85-4,05) в 2018 г. на заготовленных 100 доз. В целом за весь пери­од исследования 2012-2018 гг. частота отбора образцов для микробиологического анализа по вышеназванным компонентам не изменялась и составила 1,16 (95 % ДИ 1,11-1,12) на 100 заготовленных доз КТ из дозы кро­ви. За весь исследуемый период сохранялась высокая частота отбора проб КТ из дозы крови для проведе­ния микробиологического анализа, которая составила в среднем 7,9 (95 % ДИ 7,61-8,21) на 100 заготовленных доз в год. При этом за период 2012-2018 гг. не выяв­лено статистически значимых тенденций изменения частоты положительных результатов микробиологиче­ских посевов КТ, полученных из дозы крови (р = 0,171), за период исследования изучаемый показатель соста­вил 0,12 (95 % ДИ 0,03-0,33) на 100 доз, отобранных для микробиологического анализа.

Сопоставление объемов заготовки, обследования и выявления положительных результатов микро­биологического контроля заготовленных доз ком­понентов плазмы представлены в таблице 4. Только в 2013 и 2015 гг. были выявлены положительные ре­зультаты микробиологического контроля доз компо­нентов плазмы вне зависимости от объема заготовки и объема отбора проб для микробиологического обсле­дования, составлявшего 0,4-0,9 % от заготовленных.

Как видно из приведенных таблиц, наиболее часто проводился отбор гемоконтейнеров для микробиоло­гического анализа КТ, полученных из дозы крови, на­именее часто — СЗП (рис. 1). При этом до 2015 г. коли­чество отобранных для микробиологического анализа доз КТ из цельной крови увеличивалось на 26,2 % в год (р = 0,064), далее статистически значимо уменьшалось на 38,7 % в год (р = 0,031). В течение 2012-2018 гг. на­блюдался устойчивый рост количества доз ЭСК, от­бираемых для микробиологического анализа (в сред­нем на 13,8 % в год, р = 0,042). При этом в 2012-2015 гг. количество отобранных для микробиологического контроля доз КТ из дозы крови и ЭСК было сопоста­вимо (р = 0,194). После 2015 г. отмечено уменьшение количества отобранных для проведения микробиоло­гического анализа доз КТ, заготовленных из цельной крови, в то время как количество доз ЭСК, отобран­ных для микробиологического контроля, сохраняло тенденцию к увеличению (р < 0,001). Количество доз СЗП, отбираемых для микробиологического конт­роля, не изменялось на протяжении всего времени на­блюдения (р = 0,446).

Такой же сравнительный подход был использован для оценки частоты положительных результатов ми­кробиологического контроля доз компонентов крови, отобранных для анализа (рис. 2). Количество случаев микробной контаминации ЭСК в пересчете на 100 ото­бранных доз для микробиологического анализа в те­чение 2012-2018 гг. уменьшалось в среднем на 38,3 % в год (р < 0,001). Количество положительных результа­тов микробиологического контроля КТ из дозы крови и СЗП не изменялось на протяжении времени наблю­дения (р = 0,171 и р = 0,662 соответственно).

В целом по всем компонентам донорской крови ча­стота положительных результатов микробиологи­ческого контроля имела тенденцию к снижению (р = 0,086), в том числе в 2012 г. составила 0,31 (95 % ДИ 0,1-0,86), а в 2018 г. — 0 (95 % ДИ 0-0,39) на 100 доз, отобранных для микробиологического анализа.

Мероприятия по снижению микробной контаминации донорской крови

Были проведены разнообразные мероприятия по по­вышению микробиологической безопасности реали­зуемых компонентов крови (табл. 5). При этом ори­ентировались на требования специализированного комитета Совета Европы по переливанию крови [17] в связи с отсутствием аналогичных регламентирую­щих актов в Республике Беларусь, которые в настоя­щее время разрабатываются.

Обсуждение

Вопросы микробиологической безопасности явля­ются постоянными для организаций, заготавливаю­щих и распределяющих компоненты крови. При суще­ствующих технологиях заготовки в донорскую кровь попадает 10—100 жизнеспособных микробных частиц [18], что, несмотря на микробицидные свойства кро­ви, создает риск ее инфицирования. Поэтому акту­альна проблема микробиологического контроля за­готавливаемых компонентов крови с целью снижения риска их бактериальной контаминации. Проблема эта многогранна и включает различные подходы (табл. 5). Один из подходов — повышение чувстви­тельности микробиологического анализа, предпо­лагающее внедрение нескольких систем скрининга, включая систему отсроченного, повторного и отдален­ного тестирования, в том числе к концу сроков хра­нения, использование достаточного объема материала для анализа [11][16][19][20]. В то же время остается недостаточно реализованной стратегия ускоренного бактериологического контроля компонентов крови непосредственно перед реализацией (point of release), основанная на тестировании в реализуемом компо­ненте крови микробных пептидогликанов, бактери­альных липополисахаридов или липотейховой кис­лоты методами иммуноанализа [21]. Такая стратегия, рекомендованная Управлением по контролю за про­дуктами питания и лекарственными препаратами (Food and Drug Administration), пока не является ру­тинной и общепринятой [12]. Также актуальны меры по селекции безопасного контингента доноров кро­ви, внедрение системы гемонадзора (haemovigilance) [11]. Общепринятыми остаются использование кон­струкций системы для забора крови с добавлением бактивама, а также преимущественного использова­ния методов автоматического афереза для получения компонентов крови [3][7][15]. По оценочным данным [15], это позволяет снизить количество переливаний бактериально контаминированных компонентов кро­ви и на 60—83 % — количество смертельных случаев, связанных с ними. В РНПЦ ТМБ внедрен и исполь­зуется метод патогенредукции СЗП и КТ, в то же время широкое внедрение этих методов ограничи­вается достаточно благоприятной эпидемиологиче­ской обстановкой среди доноров крови Республики Беларусь и затратностью метода патогенредукции [9]. Проведенный в РНПЦ ТМБ комплекс мер в те­чение 2012—2018 гг. был связан с улучшением условий производства, налаживанием системы контроля аэро­зольных частиц, аттестацией помещений по классам чистоты. В 2015 г. была переоснащена система возду­хоподготовки и проведена аттестация рабочих поме­щений по классу чистоты в отделении заготовки крови и ее компонентов в РНПЦ ТМБ. Фракционирование цельной крови стали осуществлять в помещении класса чистоты В. Учитывая, что в 93,3 % случаев ос­новной причиной контаминации компонентов крови было несоблюдение персоналом требований санитар­но-гигиенического контроля и нарушение требований условий заготовки, была проведена внеочередная ат­тестация медицинского персонала. С декабря 2015 г. была внедрена система мероприятий по микробио­логическому мониторингу производственной среды в соответствии с требованиями ТКП 030—2017 (33050) «Надлежащая производственная практика». Начиная с марта 2016 г., была внедрена система мониторинга аэрозольных частиц размером 0,5 и 5,0 мкм в произ­водственных помещениях. С учетом площади произ­водственных помещений дополнительно к ультрафи­олетовым облучателям были установлены проточные рециркуляторы. Проведенный комплекс профилакти­ческих мероприятий в производственных помещени­ях отделения заготовки крови реализовался в улуч­шении как микробиологических показателей воздуха рабочих помещений, так и микробиологической об- семененности компонентов крови [16]. Учитывая, что заготовка ЭСК требует значительного объема ручного труда сотрудников, был проведен анализ ак­тивности персонала в рабочей зоне, оценены эффек­тивность процедуры подготовки рабочих помещений и правильность выполнения персоналом стандартных операционных процедур по производимым работам.

Наконец, в соответствии с международными ре­комендациями [12][13] было начато проведение от­сроченного тестирования микробной контаминации компонентов крови к концу сроков хранения (ЭСК — 28 дней, КТ — 7 дней), что является предметом даль­нейшего рассмотрения. Не всегда результаты микро­биологического анализа компонента крови прямо ассоциируются с риском инфицирования реципиента при переливании компонента крови. Бактериальную контаминацию КТ чаще выявляют при их хранении в плазме, а не в добавочном (PAS) растворе. В то же время доказанные случаи трансмиссивных инфекций при переливании КТ чаще выявлялись при их хране­нии в FAS-растворе [22].

Таким образом, в настоящей работе выявлена ста­тистически значимая тенденция к уменьшению коли­чества положительных результатов микробиологиче­ского контроля ЭСК донорской крови, заготовленных в 2012—2018 гг. в РНПЦ ТМБ. При этом результаты микробиологического контроля КТ, полученных ме­тодом автоматического афереза, были отрицательны­ми, а для КТ, полученных из цельной крови, и СЗП — редкими случаями бактериальной контаминации (по 3 случая в течение 7 лет). Увеличение количества доз ЭСК, отбираемых для микробиологического анализа, сопровождалось уменьшением частоты выявления по­ложительных результатов микробной контаминации заготовленных ЭСК. Своевременное проведение атте­стации на соответствие классу чистоты рабочих поме­щений отделения заготовки крови, внедрение с 2015 г. системы микробиологического мониторинга чистых производственных помещений (воздух, поверхности, персонал) оказали влияние на снижение риска бакте­риальной контаминации компонентов крови, связан­ного с факторами внешней среды. Достигнутое сниже­ние рисков бактериальной контаминации компонентов крови требует продолжения системной работы, в том числе внедрения новых подходов профилактики и ми­кробиологического анализа.