Применение кондиционированной среды от мезенхимальных стромальных клеток в протоколе по получению мегакариоцитов и тромбоцитов ex vivo

Введение

Одной из важнейших функций тромбоцитов является поддержание целостности стенок сосудов и запуск механизма первичного гемостаза в случае их повреждений. Тромбоциты также принимают участие в антимикробных защитных иммунных реакциях, секреции цитокинов, индуцирующих воспаление, и ростовых факторов, необходимых для восстановления тканей [1]. Нарушение функций тромбоцитов и взаимодействия между тромбоцитами и другими иммунными клетками может быть причиной целого ряда заболеваний [2]. Концентраты тромбоцитов используют для трансфузий больным при тромбоцитопении, вызванной массивной кровопотерей и онкологическими заболеваниями, а также при наследственных нарушениях функции тромбоцитов [3],[4],[5]. В настоящее время тромбоциты для клинического применения могут быть получены только от доноров. Альтернативой донорским тромбоцитам могут стать тромбоциты, полученные из стволовых клеток в условиях ex vivo. Тромбоциты, полученные ex vivo, обладают преимуществами перед донорскими в связи с их доступностью и инфекционной безопасностью. Контаминация донорских тромбоцитов бактериальными и вирусными патогенами является одной из причиной осложнений при трансфузиях тромбоцитов [6]. Протоколы и технологии получения мегакариоцитов и тромбоцитов in vitro могут использоваться для изучения заболеваний тромбоцитопоэза, а изучение тромбоцитопоэза in vitro позволит глубже понять его механизмы, оценить влияние факторов регуляции [7].

Первые работы, доказывающие возможность получения тромбоцитов ex vivo, были проведены более 25 лет назад [8]. В настоящее время разработано множество протоколов по получению мегакариоцитов и тромбоцитов из различных источников: индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК), эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) костного мозга, ГСК пуповинной крови и ГСК периферической крови. Однако, несмотря на все прилагаемые усилия, не разработано ни одной технологии получения тромбоцитов, в полной мере удовлетворяющей клинические потребности [9],[10],[11]. Во-первых, эффективность образования тромбоцитов ex vivo гораздо меньше, чем in vivo, и получение ex vivo клинически значимого количества тромбоцитов затруднительно [12],[13]. Во-вторых, тромбоциты, полученные ex vivo, в ранее предложенных протоколах несколько отличаются от тромбоцитов, полученных из крови доноров [14]. Кроме этого, важным фактором является и уменьшение стоимости производственных затрат на получение тромбоцитов ex vivo [15].

Преимуществом получения мегакариоцитов и тромбоцитов из иПСК и ЭСК является их способность к самообновлению. С использованием иПСК получены два типа мегакариоцитарных линий [16],[17] и разработан единственный протокол по получению мегакариоцитов с применением одобренных фармакологических препаратов и без использования каких-либо ксеногенных агентов, однако его эффективность также остается невысокой [18]. Использование иПСК позволяет получать мегакариоциты и тромбоциты, не экспрессирующие белки главного комплекса гистосовместимости (HLA-ABC^–/–), применение которых позволит избежать рефрактерности при лечении аллоимунизированных больных [19],[20]. Однако количество и качество тромбоцитов, полученных при использовании иПСК, остаются очень низкими (< 10 тромбоцитов на 1 мегакариоцит), а также плюрипотентные клетки потенциально туморогенны, что ограничивает их применение в клинической практике [21],[22]. Высокая стоимость основанных на использовании иПСК технологий ограничивает их масштабное применение [13]. Мегакариоциты, полученные из иПСК меньшего размера, в сравнении с мегакариоцитами костного мозга имеют меньшую плоидность, чем полученные из CD34+ ГСК [23].

Получение ГСК из костного мозга, периферической или пуповинной крови является гораздо более простой и менее дорогостоящей процедурой, чем получение плюрипотентных клеток. Протоколы получения тромбоцитов ex vivo с их использованием имели относительно высокую эффективность [13]. ГСК, в отличие от иПСК, используются в клинической практике. Кроме этого, CD34+ ГСК пуповинной крови обладают большим потенциалом к пролиферации, чем CD34+ ГСК костного мозга или мобилизованной периферической крови [24]. Использование ГСК позволяет получать мегакариоциты и тромбоциты однократно, и поэтому требуется получение новых ГСК для повторения протокола.

Поскольку эффективность образования тромбоцитов из мегакариоцитов in vivo гораздо выше, чем в экспериментах ex vivo [7], разрабатываются также подходы по использованию полученных ex vivo мегакариоцитов в качестве продукта для трансфузий [25]. В клинических целях коммитированные мегакариоцитарные предшественники и мегакариоциты могут использоваться при трансплантации ГСК пуповинной крови для сокращения длительности периода тромбоцитопении у онкогематологических больных. Есть данные, свидетельствующие о возможности и безопасности инфузий мегакариоцитарных предшественников, полученных ex vivo, для лечения больных с тромбоцитопенией [26],[27].

Интерес представляет использование кондиционированной среды от мезенхимальных стромальных клеток (МСК) с целью увеличения экспансии CD34+ ГСК. Такое действие обусловлено содержанием в кондиционированной среде (секретоме МСК) человека ростовых факторов и других компонентов, экспрессируемых МСК и играющих ключевую роль в регуляции взаимодействия между клетками и нишей для обеспечения их биологических функций [28]. Ростовые факторы, содержащиеся в кондиционированной МСК среде, увеличивают пролиферацию клеток [29]. Секретом МСК также стимулирует ex vivo экспансию CD34+ клеток [30],[31],[32],[33], что влияет на эффективность получения мегакариоцитов ex vivo.

Целью настоящей работы являлась разработка и анализ протокола по получению мегакариоцитов и тромбоцитов человека из CD34+ ГСК пуповинной крови с использованием кондиционированной МСК среды и оценка его эффективности по сравнению со средой IMDM.

Методы

Выделение фракции мононуклеарных клеток (МНК) из пуповинной крови. В качестве источника клеток использовали пуповинную кровь рожениц, давших свое добровольное письменное согласие на использование крови в научных целях. Пуповинную кровь не подвергали криоконсервации, время от момента родов до момента начала выделения клеток составляло не более 24 ч. Для выделения МНК из цельной пуповинной крови использовали среду Lymphoprep (Lymphoprep™, Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells, STEMCELL Technologies Inc., Канада) согласно протоколу производителя. Собранные на этапе выделения МНК, полученные от 3–5 единиц пуповинной крови, пулировали для увеличения общего количества клеток и сглаживания междонорской вариабельности.

Выделение CD34+ клеток из пула МНК. Выделение CD34+ клеток проводили из пула полученной ранее фракции МНК пуповинной крови с помощью метода позитивной иммуномагнитной селекции с использованием набора Human CD34 Selection Kit (EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II, Immunomagnetic positive selection kit, STEMCELL Technologies Inc., Канада) и магнита Purple EasySep® (EasySep™ Magnet, Magnet for column-free immunomagnetic separation, STEMCELL Technologies Inc., Канада) согласно инструкции производителя.

Подсчет CD34+ ГСК. Подсчет CD34+ ГСК и их жизнеспособности проводили методом проточной цитометрии на проточном цитометре FACSCanto (Becton Dickinson, США) с использованием антител против CD34 и CD45 (Anti-Human CD45 FITC/CD34 PE, Clone 2D1 8G12, Becton Dickinson, США), а также пробирок Trucount (BD Trucount™, Absolute Counting Tubes, Becton Dickinson, США) для абсолютного подсчета клеток согласно инструкции производителя.

Подготовка кондиционированной МСК среды. Для подготовки кондиционированной среды использовали культуру МСК человека, полученную из ткани пуповины. Клетки 2-го пассажа вносили в среду αMEM с 200 мМ L-глутамина (Альфа-МЕМ с L-глутамином, ООО «БиолоТ», Россия), содержащую 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Research Grade Fetal Bovine Serum, HyClone, США) в количестве 1 × 10 ³ кл/см² площади культуральной посуды. Спустя 2 суток среду заменяли на свежую среду того же состава, а на 5-е сутки среды собирали в центрифужные пробирки объемом 50 мл и центрифугировали при ускорении 400 g в течение 10 мин для удаления клеток. Отсутствие контаминации клетками среды подтверждали позже в процессе культивирования CD34+ ГСК с помощью световой микроскопии. Общее количество клеток на см² пластика составляло 1 × 10 ⁵, а время инкубирования (экспозиции) на среде — 3 суток.

Культивирование CD34+ ГСК. Использовалось два варианта культуральных сред: кондиционированная МСК среда (среда на основе αMEM) и среда IMDM с добавлением GlutaMAX (Iscove’s Medium w/GlutaMAX–I, STEMCELL Technologies Inc., Канада). В каждую из вариантов были внесены рекомбинантные цитокины: тромбопоэтин (ТПО) — 30 нг/мл (Thrombopoietin, Recombinant Human Protein, 100 мкг, Life Technologies, США), фактор стволовых клеток (ФСК) (Stem Cell Factor, SCF) — 2 нг/мл (SCF/C-Kit Ligand CTS™, Recombinant Human Protein, 100 μg, Life Technologies, США), интерлейкин (ИЛ)-6 — 7,5 нг/мл (IL6 Recombinant Human Protein, 10 μg, Life Technologies, США), ИЛ-9– 13,5 нг/мл (IL9 Recombinant Human Protein, 10 μg, Life Technologies, США). Вместо сыворотки использовался сывороточный заменитель BIT 9500 (BIT 9500 Serum Substitute, Supplement for serum-free cell culture media, STEMCELL Technologies Inc., Канада). Состав используемых сред приведен в таблице 1.

Протокол был разбит на 2 этапа, первый из которых проводили в условиях температуры 39 °C и CO₂ 10 % в течение первых 7 сут. Второй этап проводили в условиях температуры 37 °C и CO₂ 5 % c 7-х до 14-х сут. При этом на первом этапе до 7-х сут. CD34+ ГСК культивировались на кондиционированной МСК среде и на среде IMDM с добавлением GlutaMAX (Iscove’s Medium w/GlutaMAX–I, StemCell Technologies Inc., Канада) (рис. 1).

Культивирование проводили в 24-луночных планшетах (Cell Culture Plate, SPL Life Sciences Co., Ltd., Республика Корея) с рабочим объемом 1 мл в каждой лунке. CD34+ клетки вносили в количестве 1 × 10 ⁴ кл/мл культуральной среды. На 4-е сутки проводили замену половины среды, а на 7-е сутки общую концентрацию клеток доводили до 3–3,4 × 10 ⁵ кл/мл.

Световую микроскопию культуры клеток проводили ежедневно с помощью систем Zeiss AxioObserver на ПО AxioVision v.4.6.3 и Zeiss AxioStar Plus (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия). Абсолютный подсчет количества клеток проводили с помощью гемоцитометра (Metallized Hemacytometer Reicherr BrightLine, Hausser Scientifi c Company, США) на 4-е, 7-е, 10-е и 14-е сутки культивирования. Количество тромбоцитов венозной крови донора и тромбоцитоподобных частиц, полученных ex vivo, определяли на гематологическом анализаторе BC 5300 Mindray (Mindray Medical International Limited, КНР).

Проточную цитометрию проводили на проточном цитофлуориметре FACSCanto (Becton Dickinson, США) с использованием антител против CD34, CD41a, CD42b. Для определения тромбоцитов, полученных ex vivo, экспрессирующих CD41a и CD42b, предварительно проводили настройку области для проточной цитометрии с использованием контрольных тромбоцитов венозной крови взрослого донора. Для этого 6 мл венозной крови взрослого донора собирали в 2 пробирки по 3,6 мл с 3,2 % цитратом натрия (BODYWIN, PN0542S, КНР). Кровь центрифугировали при 330 g 10 мин без торможения. Плазму, содержащую тромбоциты, собирали пипетированием верхней фазы образца и центрифугировали еще раз при 1500 g в течение 15 мин. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в буфере для отмывки клеток (CellWASH, Becton Dickinson, США). Подсчет количества мегакариоцитов проводили умножением абсолютного количества клеток на процентное соотношение CD41a+ CD42b+ клеток в культуре. Тромбоциты определяли как CD41a+ /CD42b+ события в регионе дебриса при проточной цитометрии.

Статистический анализ. Статистическую обработку данных и построение графиков проводили с использованием языка R version 3.6.1 [34]. Для анализа и сравнения независимых групп применяли W-критерий Вилкоксона. Различия признавали как статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

Экспансия ядросодержащих клеток. При культивировании CD34+ ГСК с применением кондиционированной среды на 13-е сут. наблюдалась более чем 300-кратная экспансия ядросодержащих клеток. Выявлены достоверные отличия в степени экспансии ядросодержащих клеток с использованием кондиционированной МСК среды и IMDM (рис. 2).

На 4-е сутки культивирования с применением кондиционированной МСК среды среднее количество ядросодержащих клеток составляло 18,35 ± 2,13 × 10 ⁴ кл/мл, с применением среды на основе IMDM — 8,98 ± 1,18 × 10 ⁴ кл/мл; на 7-е сутки — 49,57 ± 4,38 × 10 ⁴ и 29,77 ± 3,6 × 10 ⁴ кл/мл; на 9-е сутки — 160,91 ± 11,37 × 10 ⁴ и 106,33 ± 6,04 × 10 ⁴ кл/мл; на 11-е сутки — 326,02 ± 11,86 × 10 ⁴ и 197,26 ± 10,55 × 10 ⁴ кл/мл соответственно (рис. 2).

Созревание мегакариоцитов. Появление мегакариоцитов наблюдалось уже с 7-х суток культивирования и на кондиционированной МСК среде, и на IMDM (рис. 3).

Анализ экспрессии CD41a маркера показал, что с 4-х по 13-е сутки соотношение CD41a+ клеток увеличилось с 1,65 ± 0,26 % клеток общей популяции на кондиционированной среде до 42,05 ± 1,71 % и с 2,08 ± 0,43 % на среде IMDM до 61,78 ± 1,71 % (рис. 4).

Выявлены значимые отличия в экспрессии CD42b антигена между полученными ex vivo CD41a+ мегакариоцитами (рис. 5).

На 11-е сутки культивирования 83,73 ± 5,3 % CD41a+ клеток экспрессировали CD42b на кондиционированной среде и 95,6 ± 0,99 % — на IMDM, а на 13-е сутки 96,85 ± 1,06 % на кондиционированной среде и 88,7 ± 0,56 % на IMDM соответственно.

Образование протромбоцитов и высвобождение тромбоцитов. Образование протромбоцитов и высвобождение тромбоцитов наблюдалось, начиная с 12-х сут. культивирования (рис. 6).

Отмечены различия в экспрессии маркеров клеточной дифференцировки CD41a и C42b на тромбоцитоподобных частицах (ТПЧ), полученных в протоколе с применениемкондиционированнойсреды, итромбоцитами, полученными в протоколе с использованием только IMDM среды, а также их отличия от контрольных тромбоцитов венозной крови взрослого донора. В среднем, только 68,98 ± 6,1 % ТПЧ, полученных с использованием кондиционированной МСК среды, экспрессировали CD41a+, против 68,98 ± 6,1 % с использованием IMDM. В контроле 98,16 ± 0,19 % тромбоцитов венозной крови экспрессировали CD41a. Количество ТПЧ, коэкспрессирующих характерные CD41a и CD42b, также отличалось между ТПЧ, полученными с использованием кондиционированной среды, IMDM и контрольными тромбоцитами венозной крови. В среднем, только 59,51 ± 3,86 % ТПЧ, полученных с использованием кондиционированной среды, экспрессировали CD41a и CD42b, 65,88 ± 8,73 % — с использованием IMDM, и 97,95 ± 0,23 % контрольных тромбоцитов (рис. 7).

Таким образом, соотношение тромбоцитов, экспрессирующих CD41a и CD42b, достоверно отличалось, и средние значения составляли 48,27 ± 5,22 % для кондиционированной среды и 54,53 ± 8,01 % для IMDM. Среднее процентное отношение живых CD41a+ /CD42b+ тромбоцитов в контроле составляло 96,11 ± 0,89 %. При пересчете на абсолютное количество средние значения CD41a+ /CD42b+ тромбоцитов, полученных с использованием кондиционированной среды, составили 117 ± 7,42 × 10 ⁴ кл/мл, с использованием IMDM — 115,3 ± 32,06 × 10 ⁴ кл/мл (рис. 8).

Эффективность протокола. Образование мегакариоцитов на кондиционированной МСК среде было достоверно ниже, чем на IMDM, и составило 73,25 ± 6,01 × 10 ⁴ кл/мл на кондиционированной среде и 105,87 ± 7,15 × 10 ⁴ кл/мл на IMDM на 11-е сутки. Кроме этого отмечено, что количество зрелых мегакариоцитов также было достоверно ниже на кондиционированной среде, чем на среде на основе IMDM и составило 61,33 ± 5,03 × 10 ⁴ кл/мл (SD; SE 1,59) против 101,21 ± 6,83 × 10 ⁴ кл/мл (рис. 8).

Проведенныйанализпоказал, чтоприиспользовании кондиционированной среды средний выход CD41a+ мегакариоцитов составил 73,25 ± 6,01 на 1 инициальную CD34+ ГСК, зрелых CD41a+ /CD42b+ мегакариоцитов — 61,33 ± 5,03 на 1 инициальную CD34+ ГСК; при использовании среды IMDM средний выход CD41a+ мегакариоцитов составил 105,87 ± 7,15 на 1 инициальную CD34+ ГСК, зрелых CD41a+ /CD42b+ мегакариоцитов — 101,21 ± 6,83 на 1 инициальную CD34+ ГСК. При этом один зрелый CD41a+ /CD42b+ мегакариоцит в среднем образовывал 117 ± 27,42 CD41a+ /CD42b+ тромбоцитов на кондиционированной среде и 115,3 ± 32,06 — на IMDM.

Теоретический кумулятивный выход мегакариоцитов при использовании кондиционированной МСК среды и среды на основе IMDM также достоверно отличался. На 4-е сут. была проведена замена половины среды (фактор разведения 1–2), а на 7-е сут. в лунках с IMDM культура была разведена в 1,93 раза (фактор разведения 2–1,93), в культуре с кондиционированной средой в 2,89 раза (фактор разведения 2–2,89). Факторы разведения для расчета для культуры с IMDM составили 3,86, а для кондиционированной среды — 5,78. Таким образом, при применении кондиционированной среды среднее значение теоретического кумулятивного выхода CD41a+ мегакариоцитов составило 423,39 ± 34,73, а при применении среды на основе IMDM — 408,64 ± 27,58. Теоретический кумулятивный выход зрелых CD41a+ /CD42b+ мегакариоцитов при применении кондиционированной среды составил 354,5 ± 29,08, а при применении среды на основе IMDM — 390,66 ± 26,37. Теоретический кумулятивный выход живых CD41a+ /CD42b+ тромбоцитов при применении кондиционированной среды составил 676,26 ± 58,5, а при применении IMDM — 445,06 ± 123,75. Данные по теоретическому кумулятивному выходу на 1 инициальную CD34+ ГСК представлены на рисунке 9.

Обсуждение

Использование кондиционированной среды приводило к достоверному увеличению пролиферации ядросодержащих клеток в процессе культивирования (на 11-е сутки — 326,02 ± 11,86 × 10 ⁴ кл/мл). Предположительно, такое действие обусловлено содержанием в кондиционированной среде секретома МСК человека, состоящего из цитокинов, хемокинов, молекул клеточной адгезии, ростовых факторов, гормонов, микровезикул и экзосом, и играющих ключевую роль в регуляции взаимодействия между клетками и нишей для обеспечения их биологических функций [35]. Ростовые факторы, содержащиеся в кондиционированной МСК среде (секретоме МСК), увеличивают пролиферацию клеток [29]. Секрет МСК также стимулирует ex vivo экспансию CD34+ клеток [30],[31],[32],[33], влияя тем самым на общую эффективность получения мегакариоцитов.

С другой стороны, использование кондиционированной МСК среды ведет к значительному уменьшению степени дифференцировки в мегакариоцитарную линию. К 11-м суткам при использовании кондиционированной среды процент зрелых мегакариоцитов, коэкспрессирующих CD41a и CD42b в культуре клеток, составил всего 19,2 ± 1,77 %. Предполагается, что это происходит по той причине, что в секретоме МСК содержатся и ростовые факторы (ФСК, SDF-1), способствующие самообновлению ГСК. В костном мозге CD34+ ГСК взаимодействуют со стромальными клетками, и SDF-1, конститутивно экспрессируемый МСК, участвует в адгезии клеток для того, чтобы они оставались в нише. Сам процесс созревания мегакариоцитов пространственно разобщен в разных нишах костного мозга. ГСК локализуются в эндостальных нишах, тогда как созревание мегакариоцитов происходит в периваскулярных нишах. Условия микроокружения в эндостальных и периваскулярных нишах отличаются [36]. В секретоме МСК могут содержаться факторы, способствующие экспансии клеток и сохранению их в незрелом состоянии.

Для увеличения эффективности протоколов по получению мегакариоцитов ex vivo необходимо разделять этапы экспансии и созревания. Сам по себе процесс созревания в культуре клеток происходит асинхронно, поэтому разделить процесс по времени и клетки — технически очень сложная задача. Кроме этого, в культуре клеток мегакариоциты начинают образовывать протромбоциты, не достигнув своего «физиологического» размера (~50 мкм) [37]. Начиная с 10-х сут. часть клеток размером порядка 20 мкм начинает образовывать протромбоциты. Показано, что размеры мегакариоцитов коррелируют с количеством образуемых ими тромбоцитов [38]. В этом может быть причина образования гораздо меньшего количества тромбоцитов в экспериментах ex vivo в сравнении количеством тромбоцитов, образующихся из одного мегакариоцита в костном мозге in vivo. Предположительно это может быть связано с отсутствием в эксперименте фактора ниши, либо дефицитом отдельных ростовых факторов.

Не менее интересен и вопрос, отличается ли экспрессия CD41a и CD42b на полученных ex vivo тромбоцитах от экспрессии на тромбоцитах, полученных из венозной крови взрослого донора. Возможно, не все ТПЧ являются тромбоцитами, а часть из них являются клеточным дебрисом, фрагментами клеточных структур. Данный вопрос требует дополнительных исследований. Использование кондиционированной МСК среды позволяет увеличить экспансию клеток в процессе культивирования, однако уменьшает степень дифференцировки ГСК в мегакариоцитарную линию. Тромбоциты человека, полученные в протоколе с использованием кондиционированной МСК среды по степени экспрессии CD41a и CD42b достоверно не отличаются от тромбоцитов, полученных в протоколе с использованием IMDM.