NanoLuc/h-целентеразин: эффективная пара для детекции биолюминесценции in vivo и in vivo

Введение. Биолюминесцентное мечение опухолевых клеток становится стандартом при проведении доклинических исследований новых противораковых препаратов. Несмотря на разнообразие люцифераз, многие из них не подходят для прижизненной визуализации.

Цель: сравнить различные субстраты NanoLucinvitro, атакже показать возможность использования пары NLuc/h-целентеразин для прижизненной визуализации диссеминированных опухолевых клеток с помощью системы IVIS Spectrum.

Материалы и методы. Получение целевой клеточной линии и Т-клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы (Chimeric antigen receptor, CAR), осуществляли методом лентивирусной трансдукции клеток, измерение люминесценции производили планшетным люминометром «Luminoskan™ Microplate Luminometer», для in vivo визуализации в экспериментальной модели CAR T-клеточной терапии на мышах линии NSG использовалась система прижизненной визуализации IVIS Spectrum.

Результаты. Проведено сравнение различных субстратов в тестах in vitro по сопоставлению яркости и стабильности люминесценции, а также показана возможность использования h-целентеразина в паре с люциферазой Nluc для прижизненной визуализации клеток в мышах. Получена генетически модифицированная клеточная линия Nalm6-NLuc-copGFP.

Заключение. Полученные результаты сравнения различных субстратов для люциферазы Nluc в тестах in vitro и in vivo позволили определить оптимальную пару фермент/субстрат, которая может быть востребована в качестве инструмента для исследований эффективности, безопасности и токсичности соединений и клеточных продуктов, разрабатываемых для противоопухолевой терапии. Плазмидная конструкция, кодирующая Nluc, может быть использована для модификации других клеточных линий, необходимых для разработки и характеризации новых генно-терапевтических подходов.

1. Emami-Shahri N., Foster J., Kashani R., et al. Clinically compliant spatial and temporal imaging of chimeric antigen receptor T-cells. Nat. Commun. 2018;9:1081. DOI: 10.1038/s41467-018-03524-1.

2. Sakemura R., Can I., Siegler E.L., Kenderian S.S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Mol Ther Oncolytics. 2021;20:625–33. DOI: 10.1016/j.omto.2021.03.003.

3. Skovgard M.S., Hocine H.R., Saini J.K., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Mol Ther Oncolytics. 2021;22:355–67. DOI: 10.1016/j.omto.2021.06.006.

4. Mitra A., Barua A., Huang L., et al. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 2023;14:1188049. DOI: 10.3389/fimmu.2023.1188049.

5. Joy R., Phair K., O’Hara R., Brady D. Recent advances and current challenges in CAR-T cell therapy. Biotechnol Lett. 2024;46:115–26. DOI: 10.1007/s10529023-03461-0.

6. Müller F., Boeltz S., Knitza J., et al. CD19-targeted CAR T cells in refractory antisynthetase syndrome. Lancet. 2023;401:815–8. DOI: 10.1016/S01406736(23)00023-5.

7. Bergmann C., Müller F., Distler J.H.W., et al. Treatment of a patient with severe systemic sclerosis (SSc) using CD19-targeted CAR T cells. Ann Rheum Dis. 2023;82:1117–20. DOI: 10.1136/ard-2023-223952.

8. Uslu U., June C.H. Beyond the blood: expanding CAR T cell therapy to solid tumors. Nat Biotechnol. 2025; 43:506-515. DOI:10.1038/s41587-024-02446-2.

9. Li Y., Liu M., Cui J., et al. Hepa1-6-FLuc cell line with the stable expression of firefly luciferase retains its primary properties with promising bioluminescence imaging ability. Oncol Lett. 2018;15:6203–10. DOI: 10.3892/ol.2018.8132.

10. Shimomura O. Bioluminescence: chemical principles and methods; WORLD SCIENTIFIC, 2006., ISBN 978-981-256-801-4.

11. Martini S., Haddock S.H.D. Quantification of bioluminescence from the surface to the deep sea demonstrates its predominance as an ecological trait. Sci Rep. 2017;7:45750. DOI: 10.1038/srep45750.

12. Frank L.A., Krasitskaya V.V. Coelenterazine-Dependent Luciferases: Properties and Application in Molecular Analysis. Moscow Univ Chem Bull. 2024;79:203– 10. DOI: 10.3103/S0027131424700184.

13. Tannous B.A., Kim D.-E., Fernandez J.L., et al. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Mol Ther. 2005;11:435–43. DOI: 10.1016/j.ymthe.2004.10.016.

14. Contag P.R., Olomu I.N., Stevenson D.K., Contag C.H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nat. Med. 1998;4:245–7. DOI: 10.1038/nm0298-245.

15. Germain-Genevois C., Garandeau O., Couillaud F. Detection of brain tumors and systemic metastases using nanoluc and fluc for dual reporter imaging. Mol Imaging Biol. 2016;18:62–9. DOI: 10.1007/s11307-015-0864-2.

16. Markova S.V., Golz S., Frank L.A., et al. Cloning and expression of cDNA for a luciferase from the marine copepod Metridia longa. A novel secreted bioluminescent reporter enzyme. J. Biol. Chem. 2004;279:3212–7. DOI: 10.1074/jbc.M309639200.

17. Nakajima Y., Kobayashi K., Yamagishi K., et al. cDNA cloning and characterization of a secreted luciferase from the luminous Japanese ostracod, Cypridina noctiluca. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004;68:565–70. DOI: 10.1271/bbb.68.565.

18. Thompson E.M., Nagata S., Tsuji F.I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc Natl Acad Sci USA. 1989;86:6567–71. DOI: 10.1073/pnas.86.17.6567.

19. Suzuki C., Nakajima Y., Akimoto H., et al. A new additional reporter enzyme, dinoflagellate luciferase, for monitoring of gene expression in mammalian cells. Gene. 2005;344:61–6, DOI: 10.1016/j.gene.2004.09.028.

20. Shimomura, O. Masugi T., Johnson F.H., Haneda Y. Properties and reaction mechanism of the bioluminescence system of the deep-sea shrimp Oplophorus gracilorostris. Biochemistry. 1978;17:994–8. DOI: 10.1021/bi00599a008.

21. Hall M.P., Unch J., Binkowski B.F., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem. Biol. 2012;7:1848–57. DOI: 10.1021/cb3002478.

22. Stacer A.C., Nyati S., Moudgil P., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Mol. Imaging. 2013;12:1–13. DOI: 10.2310/7290.2013.00062.

23. Gaspar N., Walker J.R., Zambito G., et al. Evaluation of NanoLuc substrates for bioluminescence imaging of transferred cells in mice. J Photochem Photobiol B. 2021;216:112128. DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2021.112128.

24. Chu J., Oh Y., Sens A., et al. A bright cyan-excitable orange fluorescent protein facilitates dual-emission microscopy and enhances bioluminescence imaging in vivo. Nat Biotechnol. 2016;34:760–7. DOI: 10.1038/nbt.3550.

25. Kutner R.H., Zhang X.-Y., Reiser J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc. 2009;4:495–505. DOI: 10.1038/nprot.2009.22.

26. Brentjens R.J., Rivière I., Park J.H., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 2011;118:4817–28. DOI: 10.1182/blood-2011-04-348540.

27. Belovezhets T., Kulemzin S., Volkova O., et al. Comparative Pre-Clinical Analysis of CD20-Specific CAR T Cells Encompassing 1F5-, Leu16-, and 2F2-Based AntigenRecognition Moieties Int J Mol. Sci. 2023;24:3698. DOI: 10.3390/ijms24043698.

28. Shipunova V.O., Shilova O.N., Shramova E.I., et al. A Highly Specific Substrate for NanoLUC Luciferase Furimazine Is Toxic in vitro and in vivo. Russ J Bioorg Chem. 2018;44:225–8. DOI: 10.1134/S1068162018020085.

29. Taylor A., Sharkey J., Plagge A., et al. Multicolour In Vivo Bioluminescence Imaging Using a NanoLuc-Based BRET Reporter in Combination with Firefly Luciferase. Contrast Media Mol Imaging. 2018;2018:2514796. DOI: 10.1155/2018/2514796.

30. Inouye S., Sahara-Miura Y., Sato J., et al. Expression, purification and luminescence properties of coelenterazine-utilizing luciferases from Renilla, Oplophorus and Gaussia: comparison of substrate specificity for C2-modified coelenterazines. Protein Expr Purif. 2013;88:150–6. DOI:10.1016/j.pep.2012.12.006.

31. Inouye S., Sasaki S. Blue fluorescent protein from the calcium-sensitive photoprotein aequorin: catalytic properties for the oxidation of coelenterazine as an oxygenase. FEBS Lett. 2006;580:1977–82. DOI: 10.1016/j.febslet.2006.02.065.