Preview

Гематология и трансфузиология

Расширенный поиск

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ ДЛЯ КОНТРОЛЯ СОДЕРЖАНИЯ ОСТАТОЧНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ

https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-1-66-72

Полный текст:

Аннотация

Введение. Иммунологическая и инфекционная безопасность компонентов крови является основным критерием качества трансфузионной терапии. Внедрение методов фильтрации крови способствует разработке методов валидации контроля остаточных лейкоцитов в продуктах крови. Необходим простой в исполнении и надежный метод подсчета остаточных лейкоцитов в продуктах крови.

Целью данного исследования была сравнительная характеристика использования проточного цитометра и гематологического анализатора для контроля содержания остаточных лейкоцитов в плазме крови.

Материалы и методы. В исследовании сравнили два метода подсчета остаточных лейкоцитов в 191 образце донорской плазмы, производимой в ФГБУ «НМИЦ им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России, при помощи проточного цитометра (Navios Beckman Coulter) с использованием коммерческого набора реагентов LeukoSure и гематологического анализатора Sysmex XT-4000i.

Результаты. Все проанализированные образцы плазмы соответствуют требованиям технического регламента. Большая часть образцов имела очень низкие количества остаточных лейкоцитов. Использование проточного цитометра Navios Beckman Coulter позволило определить в 83 % образцах количество лейкоцитов ≤15 кл в мкл, использование автоматического гематологического анализатора Sysmex XT-4000i для подсчета остаточных лейкоцитов в данном диапазоне ограничено чувствительностью прибора и отсутствием аттестованных контрольных материалов с низким содержанием лейкоцитов. Результаты текущего исследования показали, что подсчет остаточных лейкоцитов плазмы крови, оцененный с помощью проточного цитометра Navios Beckman Coulter, дает приемлемые результаты, он также наилучшим образом подходит для образцов с минимальным количеством клеток до 15 единиц в мкл.

Заключение. Значительная вариабельность содержания остаточных лейкоцитов в образцах плазмы крови свидетельствует о целесообразности проверки содержания лейкоцитов во всех компонентах крови.

Для цитирования:


Козырева В.С., Шилова А.Н., Шкода О.В. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ ДЛЯ КОНТРОЛЯ СОДЕРЖАНИЯ ОСТАТОЧНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ. Гематология и трансфузиология. 2019;64(1):66-72. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-1-66-72

For citation:


Kozyreva V.S., Shilova A.N., Shkoda O.S. FLOW CYTOMETRY FOR MEASURING RESIDUAL LEUKOCYTES IN BLOOD PLASMA. Russian journal of hematology and transfusiology. 2019;64(1):66-72. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-1-66-72

Введение

Потребление донорской крови и ее компонентов про - должает увеличиваться, что неизбежно ведет к росту посттрансфузионных осложнений. Развитие высоко­технологичной медицинской помощи обуславливает повышение требований к качеству компонентов крови. Предупреждение большинства нежелательных трансфузионных последствий заключается в повышении ка­чества трансфузионных сред [1]. Иммунологическая и инфекционная безопасность компонентов крови яв­ляется основным критерием качества трансфузионной терапии. Лейкоциты, их фрагменты и продуцируемые ими цитокины обуславливают посттрансфузионные осложнения. Переливание реципиенту свободных от лейкоцитов продуктов крови предотвращает HLA- аллоиммунизацию, фебрильную посттрансфузионную реакцию, реакцию «трансплантат против хозяина», острое трансфузионное поражение легких, передачу цитомегаловирусной инфекции, вируса Эпштейна — Барр, вируса Т-клеточного лейкоза человека, резко снижает вероятность передачи гепатотропных виру­сов, иммуномодуляцию и передачу прионов (возбуди­теля болезни Крейтцфельдта — Якоба) [2].

В соответствии с техническим регламентом, утвер­жденным постановлением правительства от 26 ян­варя 2010 года № 29 [3], определены приемлемые ха­рактеристики качества различных трансфузионных сред: в эритроцитсодержащих компонентах, получен­ных методом афереза, должно содержаться не более 1х106 лейкоцитов в одной дозе, для концентрата тром­боцитов — не более 0,05х109 лейкоцитов в одной дозе, для плазмы — не более 0,1х109 лейкоцитов в литре. В соответствии с требованиями Совета Европы [4] компонент крови для трансфузии после удаления лей­коцитов должен содержать менее 1х106 клеток для про­филактики посттрансфузионных реакций, обуслов­ленных «остаточными лейкоцитами» [5]. Фильтрация компонентов крови необходима, что, в свою очередь, стимулирует разработку методов валидации контроля остаточных лейкоцитов. Согласно требованиям стан­дарта качества [5], концентрации лейкоцитов долж­ны находиться в области значений, которые могут быть определены только на приборах с высокой раз­решающей способностью. Гемоцитометрия Nageotte была первым практическим методом для подсчета остаточных клеток в компонентах крови и считалась подходящей для рутинного контроля качества [6—8]. Описанный в 1990-х годах данный способ определе­ния с использованием метода световой микроскопии и гемоцитометра большого объема (счетной камеры Nageotte) не позволяет провести экспертную оценку качества фильтрации в силу недостаточной чувстви­тельности метода и характеризуется высокой вари­абельностью получаемых результатов [6—8]. Метод Nageotte слишком трудоемкий и неуместен в качестве метода выбора, когда нужно тестировать большое ко­личество образцов [9].

Для преодоления этих трудностей были разрабо­таны альтернативные методы подсчета: автоматизи­рованный объемный капиллярный цитометр [10], проточные цитометрические методы [11, 12] и мето­ды полимеразной цепной реакции [13]. В нескольких исследованиях [10, 14, 15] сравнили количество лей­коцитов, подсчитанных автоматическими методами, с результатами подсчета лейкоцитов, полученными с помощью гемоцитометрии Nageotte. Использование многократных разбавлений показало, что точность ге- моцитометра Nageotte была низкой при малых концен­трациях остаточных клеток, а результаты были ниже по сравнению с результатами, полученными с помо­щью автоматизированных методов [6, 16]. Большое количество исследований посвящено сравнению гемоцитометрии Nageotte с различными автоматизирован­ными методами подсчета, основанными на технологии проточной цитометрии [17]. Использование гематоло­гических анализаторов для подсчета остаточных лей­коцитов крайне ограничено в связи с недостаточной чувствительностью анализа и отсутствием контроль­ных материалов. А.И. Костин и соавт. [1] отмечают при подсчете лейкоцитов в эритроцитсодержащих компонентах сходство результатов подсчета лейкоци­тов до фильтрации обоими методами и допускают воз­можность использования обычного гематологическо­го анализатора, прошедшего процедуру валидации, при необходимости определения количества лейко­цитов в эритроцитсодержащих компонентах, не под­вергавшихся лейкоредукции. Авторы [1] отмечают, что количество остаточных лейкоцитов было выше ре­комендованного экспертами Совета Европы [4].

Целью данного исследования была сравнительная характеристика использования проточного цитометра и гематологического анализатора для контроля содер­жания остаточных лейкоцитов в плазме крови.

Материалы и методы

В качестве анализируемой трансфузионной среды была выбрана плазма крови. Выбор плазмы крови в ка­честве анализируемой трансфузионной среды был обу­словлен тем, что плазма крови — один из самых широко востребованных компонентов крови, при этом стан­дарты качества в отношении «остаточных лейкоцитов» для плазмы стали применяться относительно недавно по сравнению с эритроцитсодержащими компонентами крови и концентратами тромбоцитов [18].

Для исследования использован 191 образец донор­ской плазмы крови, произведенный в ФГБУ «НМИЦ им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России, г. Но­восибирск.

Для подсчета «остаточных лейкоцитов» в плазме кро - ви на проточном цитометре Navios Beckman Coulter (США) использовали набор реагентов Beckman Coul­ter LeukoSure (США). Образец плазмы крови лизиро- вали и проводили через процедуру повышения прони­цаемости мембран с использованием оригинального лизирующего реагента LeukoSure, Beckman Coulter (США). При помощи РНКазы удаляли РНК, и крася­щий реагент, содержащий йодид пропидия, связывал­ся только с ДНК. Ядросодержащие клетки в образце флуоресцировали с интенсивностью пропорциональ­ной содержанию ДНК. Зрелые эритроциты и тромбо­циты, не содержащие ДНК, не связывают краситель. Непосредственно перед анализом добавляли 100 мкл гомогенизированных флуоросфер LeukoSure, осто­рожно перемешивали, пробирки загружали в карусель для автоматического анализа. Для анализа использо­валось фиксированное количество — 10 000 клеток: после того как на проточном цитометре проанализи­ровали 10 000 клеток, протокол измерения останавли­вали. В регион обнаружения были включены только неповрежденные лейкоциты. При помощи проточного цитометра Navios Beckman Coulter измеряли флуорес­ценцию каждой помеченной клетки. Так как зрелые тромбоциты и «красные клетки» крови не содержат

ДНК, то помеченные клетки представляли собой лей­коцитарный компонент образца.

Процедура лизиса и окрашивания, настройка про­точного цитометра и создание протоколов измере­ния проходили согласно инструкции производителя к комплекту реагентов. Линейность измерения лейко­цитов, заявленная производителем, определена диапа­зоном от 0 до 400 клеток в 1 мкл образца. Контроль каче­ства измерений содержания лейкоцитов в плазме крови проводили с использованием двух уровней контроль­ных материалов, Leuko-Trol Platelet Control Cells Low/ High Beckman Coulter в каждой аналитической серии. Контрольные материалы для оценки качества измере­ния остаточных лейкоцитов соответствовали следу­ющим диапазонам измерений: 0,5-4,5 клетки в 1 мкл и 14,5-25,5 клетки в 1 мкл соответственно.

В этих же образцах плазмы крови содержание лей­коцитов определяли при помощи автоматическо­го гематологического анализатора Sysmex XT-4000i (Япония) согласно стандартному протоколу работы на автоматическом гематологическом анализаторе. В данном гематологическом анализаторе для подсче­та количества лейкоцитов используется также прин­цип флуоресцентной проточной цитометрии. Проба направляется в проточную кювету. Образец подсве­чивается лучом полупроводникового лазера, кото­рый может разделять клетки посредством трех раз­личных сигналов: прямо рассеянный свет (прямое рассеяние/FSC), боковой рассеянный свет (боковое рассеяние/SSC), боковой флуоресцентный свет (бо­ковая флуоресценция/SFL). Интенсивность прямо­го рассеяния указывает на объем клетки. Боковое рассеяние предоставляет информацию о содержи­мом клетки: о ядре и гранулах. Боковая флуоресцен­ция указывает на количество ДНК и РНК в клетке. Клетки со схожими физико-химическими свойствами формируют кластер на графическом изображении, из­вестном как диаграмма рассеивания.

Линейность измерения содержания лейкоцитов в режиме анализа биологической жидкости, заяв­ленная производителем, определена в диапазоне 0,05х103 до 10,000х103 клеток в 1 мкл образца. В свя­зи с тем что нет коммерческих контрольных мате­риалов, разработанных для контроля остаточных лейкоцитов и аттестованных для автоматическо­го гематологического анализатора Sysmex XT-400, контроль качества измерений содержания лейкоци­тов в образцах плазмы крови проводили с исполь­зованием трех уровней контрольных материалов: Liquichek Hematology Control (X) Levels 1, 2 and 3 Bio-Rad. Контрольные материалы для оценки ка­чества измерения остаточных лейкоцитов соответ­ствовали следующим диапазонам измерений: (3,0- 4,6)х103 клеток в 1 мкл, (6,3-8,3)х103 клеток в 1 мкл и (16,7-20,9)х103 клеток в 1 мкл соответственно.

Статистическая обработка результатов произве­дена с использованием статистических критериев в программе Statistica 6.0. Полученные результаты измерения количества остаточных лейкоцитов мето­дом проточной цитометрии проверены на нормаль­ность распределения при помощи метода Колмого­рова — Смирнова. Результаты представлены в виде медианы, межквартильного интервала (25 и 75 % квартили).

Результаты

Количество лейкоцитов в анализируемых образцах плазмы, определенных при помощи проточного цито­метра и гематологического анализатора, представлено в таблице 1.

Обращала на себя внимание неоднородность рас­пределения количества остаточных лейкоцитов в раз­личных образцах донорской плазмы (рис. 1). 98,95 % анализируемых образцов донорской плазмы имели количество остаточных лейкоцитов менее 100 кл/мкл. 2 образца донорской плазмы содержали лейкоци­ты 140 и 217 кл/мкл соответственно. Большая часть (83 %) анализируемых образцов плазмы имела коли­чество остаточных лейкоцитов меньше либо равное 15 кл/мкл, из них 20 % имело нулевое содержание остаточных лейкоцитов, определенное методом про­точной цитометрии.

Количество лейкоцитов 0,05х103 кл/мкл соответ­ствовало нижней границе линейности измерения анализатора в режиме биологической жидкости. Со­ответственно результаты измерения количества лейко­цитов, находящиеся ниже предела линейности (85 % образцов), не могли быть оценены достоверно.

При оценке остаточного количества лейкоци­тов повышенного внимания заслуживали образцы с малым количеством лейкоцитов, поскольку в свя­зи с повышающимися требованиями к компонентам крови приоритет должен быть отдан использованию образцов с наименьшим содержанием остаточных лейкоцитов.

Имелась значимая корреляция (r = 0,96718, p = 0,95) между количеством остаточных лейкоцитов, опреде­ленных при помощи проточного цитометра, и количе­ством лейкоцитов, определенных при помощи гемато­логического анализатора (рис. 2).

 

Таблица 1. Количество остаточных лейкоцитов в плазме донорской крови, определенное при помощи проточного цитометра и автомати­ческого гематологического анализатора

Table 1. Use of a flow cytometer and a hematology analyzer for counting residual leucocytes in donor plasma

Проточный цитометр, коли­чество лейкоцитов, кл/мкл Flow cytometer, WBC cells/μΙ

Гематологический анализатор, количество лейкоцитов, кл/мкл Hematology analyzer, WBC cells/μΙ

2,000 (1,00;5,00)

10,000 (0,00;10,00)

 

Рисунок 1. Содержание остаточных лейкоцитов в плазме донорской крови, опре­деленное при помощи проточного цитометра

Figure 1. Residual leucocytes content in donor plasma determined by a flow cytometer

 

 

Рисунок 2. Корреляция значений количества лейкоцитов, измеренных при помощи проточного цитометра и гематологического анализатора (г = 0,96718, p = 0,95)

Figure 2. Correlation between WBC estimated by a flow cytometer and a hematology analyser (r = 0,96718, p = 0,95)

 

Обсуждение

Развитие технологий афереза позволяет произво­дить плазму, практически не содержащую клеток крови, что, в свою очередь, требует наличия просто­го, объективного и точного метода подсчета остаточ­ных клеток крови. В данном исследовании сравнили использование автоматического гематологического анализатора Sysmex XT-4000i и проточной цитомет­рии (Navios) с коммерческим набором для подсчета остаточных лейкоцитов в плазме крови. В отсутствие метода «золотого стандарта», учитывая, что не прово­дили эксперименты по разбавлению, основной целью было выяснить соответствие между этими методами и преимущества использования в реальных условиях работы лаборатории.

Обнаружена сильная корреляция значений количе­ства лейкоцитов, измеренных при помощи проточно­го цитометра Navios и гематологического анализатора Sysmex XT-400 (г=0,96718, p=0,95), что свидетельствует о хорошей сопоставимости методов и, вероятно, воз­можной взаимозаменяемости в условиях работы лабо­ратории.

Согласно анализу на гематологическом анализаторе, все компоненты донорской плазмы соответствовали техническому регламенту, но пороговые значения при­бора не позволяли точно оценить низкие значения кон­центраций клеток после лейкоредукции.

Лейкоциты в плазме крови способны к активации во время хранения и секреции цитокинов и факторов роста, что, в свою очередь, может вызвать трансфузионные реакции у реципиента [19, 20]. Относительно большое количество остаточных лейкоцитов (до 100 кл в мкл) допускается согласно техническому регламенту [3], но адаптации Европейского совета [4] рекомен­дуют использовать продукты плазмы с наименее воз­можным содержанием остаточных клеток. С учетом того, что отдается предпочтение использованию образ­цов с минимальным содержанием остаточных клеток, предпочтительнее использовать проточную цитомет­рию с коммерческим набором реагентов для подсче­та остаточных лейкоцитов в продуктах крови. Кроме того, наличие аттестованных контрольных материалов с диапазонами значений низких концентраций лейко­цитов свидетельствует в пользу выбора метода про­точной цитометрии для рутинной оценки количества остаточных клеток в продуктах крови, так как позво­ляет сделать выводы о воспроизводимости и правиль­ности проводимых измерений. К недостаткам данного метода можно отнести высокую стоимость по сравне­нию с использованием гематологического анализатора и наличие технической подготовки оператора прибора при настраивании протоколов. Оба метода не являют­ся трудоемкими и могут использоваться для большого потока исследований.

Таким образом, для полноценного удаления лей­коцитов из трансфузионных сред с целью снижения риска трансфузионных осложнений необходим пра­вильный контроль качества компонентов крови в отношении количества остаточных лейкоцитов. Результа­ты настоящего исследования показали, что подсчет остаточных лейкоцитов плазмы крови для проверки на соответствие техническому регламенту возможен как при использовании технологии проточной цито­метрии, так и при использовании автоматического гематологического анализатора. Применение метода проточной цитометрии позволяет с высокой точно­стью производить подсчет остаточных лейкоцитов в компонентах крови за счет улавливания наимень­ших значений. Использование проточного цитометра с коммерческим анализом набора лучше подходит для образцов с минимальным количеством клеток до 15 клеток в мкл по сравнению с использованием гематологического анализатора.

Значительная вариабельность содержания остаточ­ных лейкоцитов в образцах плазмы крови свидетель­ствует о целесообразности проверки содержания лей­коцитов во всех компонентах крови.

Список литературы

1. Костин А.И., Майорова О.А., Ложкин А.В. и др. К вопросу о контроле качества эритроцитсодержащих компонентов крови, обедненных лейкоцитами. Трансфузиология. 2011; 12(2): 12–33.

2. Максимов В.А. Инфекционная безопасность донорской крови и ее компонентов. Санэпидемконтроль. Охрана труда. 2009; 3.

3. Постановление Правительства РФ от 26 января 2010 г. № 29 «Об утверждении технического регламента о требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии» (с изменениями и дополнениями).

4. Council of Europe Publishing. Strasbourg, France. Guide to the preparation use and quality assurance of blood components, 7th edition. 2001. 127–32.

5. Зарубин М.В., Саратова О.Е., Веревкина Л.Н., Жибурт Е.Б. Стратификация плазмы по содержанию лейкоцитов. Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины. 2015; 1: 67–70.

6. Dzik S., Moroff G., Dumont L. A multicenter study evaluating three methods for counting residual WBCs in WBC-reduced blood components: Nageotte haemocytometry, flow cytometry, and microfluorimetry. Transfusion. 2000; 40: 513–20.

7. Van Der Meer P.F., Gratama J.W., Van Delden C.J., et al. Comparison of five platforms for enumeration of residual leucocytes in leucoreduced blood components. Br J Haematol. 2001; 115: 953–62.

8. Dzik W.H., Ragosta A., Cusack W.F. Flow-cytometric method for counting very low numbers of leukocytes in platelet products. Vox Sang. 1990; 59: 153–9.

9. Palmer D.S., Birch P., O’Toole J., et al. Flow cytometric determination of residual white blood cell levels in preserved samples from leukoreduced blood products. Transfusion. 2008; 48(1): 118–28.

10. Adams M.R., Johnson D.K., Busch M.P., et al. Automated volumetric capillary cytometry for counting white cells in white cell-reduced plateletpheresis components. Transfusion. 1997; 37: 29–37.

11. Wenz B., Burns E.R., Lee V., Miller W.K. A rare-event analysis model for quantifying white cells in white cell-depleted blood. Transfusion. 1991; 31: 156–9.

12. Barclay R., Walker B., Allan R., et al. Flow cytometric determination of residual leucocytes in filter-depleted blood products: an evaluation of Becton-Dickinson’s Leuco COUNT system. Transfus Sci. 1998; 19: 399–403.

13. Lee T.H., Stromberg R.R, Heitman J., et al. Quantification of residual white cells in filtered blood components by polymerase chain reaction amplification of HLA DQ-A DNA. Transfusion 1994; 34: 986–94.

14. Dumont L.J., Dumont D.F. Enhanced flow cytometric method for counting very low numbers of white cells in platelet products. Cytometry. 1996; 26: 311–6.

15. Dzik W.H., Rebulla P. Multicenter evaluation of methods for counting residual white cells in leukocyte-depleted red blood cells. Vox Sang. 1994; 66: 25–32.

16. van der Meer P.F., Gratama J.W., van Delden C.J., et al. Comparison of five platforms for enumeration of residual leucocytes in leucoreduced blood components. Br. J. Haematol. 2001; 115: 953–62.

17. Kyriakou E., Nearchakos N., Bonovas S. Comparison between Nageotte and flow cytometric counting of residual leucocytes in freshly prepared leucocytereduced red blood cell components. Transfus Apher Sci. 2018. DOI: 10.1016/j. transci.2018.06.002 [Epub ahead of print]

18. Masse M. Universal leukoreduction of cellular and plasma components: process control and performance of the leukoreduction process. Tranfus Clin Biol. 2001; 8: 297–302.

19. Muylle L. The role of cytokines in blood transfusion reactions. Blood Rev. 1995; 9: 77–83.

20. Sedlmayr P., Blaschitz A., Wilders-Truschnig M., et al. Platelets contain interleukin-1 alpha and beta which are detectable on the cell surface after activation. Scand J Immunol. 1995; 42: 209–14.


Об авторах

В. С. Козырева
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени академика Е.Н. Мешалкина» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Козырева Виктория Сергеевна*, врач клинической лабораторной диагностики лаборатории клинической иммунологии отделения лабораторной диагностики 

тел.: +7 (913)757-64-03; 630050, г. Новосибирск, ул. Речкуновская, 15



А. Н. Шилова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени академика Е.Н. Мешалкина» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Шилова Анна Николаевна, доктор медицинских наук, заведующий отделением лабораторной диагностики


О. В. Шкода
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени академика Е.Н. Мешалкина» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Шкода Ольга Сергеевна, врач КЛД лаборатории клинической иммунологии отделения лабораторной диагностики


Для цитирования:


Козырева В.С., Шилова А.Н., Шкода О.В. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ ДЛЯ КОНТРОЛЯ СОДЕРЖАНИЯ ОСТАТОЧНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ. Гематология и трансфузиология. 2019;64(1):66-72. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-1-66-72

For citation:


Kozyreva V.S., Shilova A.N., Shkoda O.S. FLOW CYTOMETRY FOR MEASURING RESIDUAL LEUKOCYTES IN BLOOD PLASMA. Russian journal of hematology and transfusiology. 2019;64(1):66-72. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-1-66-72

Просмотров: 397


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0234-5730 (Print)
ISSN 2411-3042 (Online)