НЕГАТИВНОЕ ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ ТР53 НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТЕРАПИИ ЛИМФОМЫ ИЗ КЛЕТОК МАНТИИ. ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОТОКОЛА «ЛКМ-2016»

Введение

Лимфома из клеток мантии (ЛКМ) составляет око­ло 7—9 % от всех неходжкинских лимфом (НХЛ), что соответствует примерно 8—10 новым случаям на 1 млн населения в год. Клинические характери­стики ЛКМ подробно описаны в литературе, но оста­ется много неясного в правильном выборе терапии и оценке прогноза [1—6]. По данным проведенных ис­следований [7—10], определяющими в прогнозе ЛКМ являются не только интенсификация первой линии терапии, но и биологические характеристики опухо­ли. Применяемые в повседневной практике между­народные прогностические индексы для ЛКМ (MIPI, MIPI_b MIPIJ), основанные на клинических и проли­феративных особенностях опухоли, позволяют толь­ко приблизительно оценить прогноз [11, 12]. Такие важные молекулярно-генетические характеристики, как комплексный кариотип, делеция локусов генов СДКМЛ/9р21 и TP57/17q32, перестройки гена c-Myc, мутации в генах Notch1/2 и TP53, в настоящее время не учитываются в большинстве работ, посвященных терапии ЛКМ [2, 3, 13-17].

Если обнаружение мутаций в гене ТР53 как факто­ра крайне неблагоприятного прогноза подробно опи­сано при В-клеточном хроническом лимфолейкозе и диффузной В-крупноклеточной лимфоме (ДВККЛ), то сведения о мутациях в гене TP53 при ЛКМ крайне ограничены [7, 8, 10, 18-20]. По данным ретроспек­тивного исследования, опубликованного в 2017 г. Скандинавской группой по изучению ЛКМ (Nordic MCL group) [7], у 19 из 183 больных выявлена мута­ция в гене ТР53 (mut p53+). Проведение интенсивной химиотерапии (ХТ) не повлияло на их крайне не­благоприятный прогноз. Медиана беспрогрессивной выживаемости (БПВ) и общей выживаемости (ОВ) в этой когорте больных не превышала 0,9 и 1,8 года соответственно. Для сравнения, в группе больных ЛКМ без мутации в гене ТР53 (mut р53—) БПВ и ОВ составили 8,2 и 12,5 года, соответственно [7]. При про­ведении многофакторного анализа достоверное про­гностическое значение имело только наличие мута­ций в гене ТР53 по отношению к другим традиционно применяемым факторам (MIPI, del17p, бластоидный вариант и т. д.). После дополнительного анализа дру­гих работ, связанных с исследованием мутаций в гене ТР53 при ЛКМ, также прослеживается аналогичная тенденция. От 10 до 20 % больных ЛКМ с мутациями в гене ТР53 при крайне агрессивном клиническом те­чении заболевания проявляли резистентность к про­водимой ХТ [7].

Целью настоящей работы явилось проведение про­спективной оценки влияния мутаций в гене ТР53 на результаты лечения ЛКМ, а также поиск эффектив­ной терапии данной прогностически неблагоприятной группы больных.

Материалы и методы

В ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России в период с января 2016 г. по декабрь 2018 г. в рамках проспективного исследования «ЛКМ-2016» 24 боль­ным ЛКМ было выполнено молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене ТР53 (секвенирование ДНК по Сэнгеру в 1(2)-11 экзонах).

Анализ мутаций гена TP53 проводили по протоко­лам IARC (International Agency for Research on Cancer) [21]. ПЦР-продукты секвенировали с использова­нием набора Big Dye Terminator v1.1 (Thermofisher Scientific, USA) на автоматическом анализаторе ну­клеиновых кислот Нанофор 05 (ФГБУН ИАП РАН, Россия). Полученные последовательности анали­зировали на наличие мутаций в онлайн-програм­ме GLASS [22]. Вероятную патогенность проверяли в онлайн-базах данных мутаций гена IARC, SESHAT [23] и COSMIC [24].

В НИЦ «Курчатовский институт» ДНК из пери­ферической крови и костного мозга выделяли с ис­пользованием наборов OIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, США) согласно рекомендациям произво­дителя. ДНК из тканей выделяли с помощью обра­ботки протеиназой К при 50 °С в течение 16—20 часов с последующей очисткой смесью фенолхлороформа. ДНК из парафиновых блоков выделяли с использова­нием набора Extract DNA FFPE (Евроген, РФ) соглас­но рекомендациям производителя. Амплификацию 1(2)-11 экзонов гена ТР53 проводили с использованием ранее опубликованных праймеров [8]. Выравнивание и анализ полученных последовательностей проводили с использованием программы BioEdit v.3. Вероятную патогенность проверяли в онлайн-базах данных мута­ций гена IARC [21].

Были проанализированы результаты обследова­ний больных, включенные в стандартный прото­кол [1]: клинико-лабораторные (активность сыворо­точной лактатдегидрогеназы (ЛДГ); концентрация β-микроглобулина; иммуногистохимическое исследо­вание биоптатов опухоли с антителами к CD5, CD20, CD23, cyclin D1, SOX11, Ki67, р53; 6-цветная проточ­ная цитофлуориметрия c использованием антител к CD45/CD19/CD5/CD20/K/A; иммунохимическое ис­следование сыворотки крови и мочи); инструменталь­ные (ультразвуковые исследования, компьютерная томография (КТ), магнитно-резонансная томография (МРТ), позитронно-эмиссионная томография, сов­мещенная с компьютерной томографией (ПЭТ/КТ), фиброгастродуоденоскопия, фиброколоноскопия); цитогенетические (стандартное цитогенетическое исследование, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) для детекции транслокации t(11;14)(q13;q32), делеции 17p, перестройки гена c-Myc) и другие моле­кулярно-генетические характеристики опухоли (В- клеточная клональность, мутационный статус генов вариабельных участков тяжелых цепей иммуноглобу­линов (IgHV)).

Нуклеотидные последовательности генов IgHV опре­деляли согласно методике, описанной ранее в статье [25]. ПЦР-продукты секвенировали с использованием набора Big Dye Terminator vl.1 (Thermofisher Scientific, USA) на автоматическом анализаторе нуклеиновых кислот «Нанофор 05» (ФГБУН ИАП РАН, Россия). Полученные последовательности сравнивали с име­ющимися в базе данных IMGT [26]. Если последова­тельность клонального IgHV-гена совпадала с после­довательностью одного из герминальных IgHV генов на 98 % и более, считали, что данный IgHV-ген сома­тической гипермутации не подвергался. При условии сходства последовательности клонального IgHV-гена менее 97,9 % считали, что опухолевая клетка — пред­шественница клона у данного больного подвергалась соматической гипермутации.

Больным ЛКМ (mut р53—) проведено лечение по протоколу «ЛКМ-2016» [1], который включал в себя 4 ротирующих курса R-BAC/R-HA, с последу­ющей высокодозной консолидацией по схеме СЕАМ с трансплантацией аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ауто-ТГСК) и дальнейшей поддер­живающей терапией ритуксимабом 1 раз в 3 месяца в стандартных дозах (375 мг/м²) в течение двух лет. Всем больным было показано проведение ХТ в со­ответствии с установленными критериями [27]. Все больные перед госпитализацией и началом ХТ под­писывали информированное согласие. Спленэктомия выполнена только 3 больным. В остальных случаях с целью нормализации размеров селезенки и показа­телей крови больным проводилась терапия ибрутини- бом в дозе 560 мг/сутки в среднем от 10 до 25 дней, с по­следующей ХТ по программе «ЛКМ-2016» [1].

В группе ЛКМ (mut p53+) проводили различные схемы ХТ (R-EPOCH, R-DHAP, R-BAC, R-BAC с ок- салиплатином, R-HMA, R-GIDIOX [1], непрограмм­ная ХТ с включением леналидомида, бортезомиба, обинутузумаба, ибрутиниба). Двум больным ЛКМ (mut p53+) выполнена трансплантация аллогенных ге- мопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) от не­родственных полностью идентичных доноров (одной больной после протокола «ЛКМ-2016» с ауто-ТГСК).

Оценку клинического ответа проводили с помощью стандартных лабораторных и инструментальных ме­тодов, а также ПЭТ/КТ-исследования.

Оценку минимальной остаточной болезни (МОБ) проводили с помощью морфологического и кариологического исследований костного мозга, полимераз­ной цепной реакции (ПЦР), исследования В-клеточной клональности и 6-цветной проточной цитометрии. Сбор CD34+-аутологичных стволовых клеток крови проводился после достижения МОБ-негативности в костном мозге по стандартному протоколу [1].

Контрольное обследование с оценкой МОБ проводи­ли каждые 3 месяца в течение первых 2 лет наблюде­ния, далее — 1 раз в полгода.

Статистический анализ данных проводили с ис­пользованием анализа выживаемости. Для расчетов использованы статистические программы StatView и 4 SAS 9.4. Для бессобытийной выживаемости со­бытием являлись прогрессия заболевания, рецидив или смерть от любой причины, время отсчитывалось от начала ХТ. Для общей выживаемости событием яв­лялась смерть от любой причины, время отсчитыва­лось от начала ХТ.

Результаты

Характеристика больных

В исследование включено 24 больных (15 мужчин и 9 женщин) в возрасте от 33 лет до 71 года (средний возраст 53 года). Клиническая характеристика и ре­зультаты проведенных исследований раздельно пред­ставлены в группе 1 (20 больных mut p53—) и в группе 2 (4 больных mut p53+) (табл. 1).

В группу 1 было включено 20 больных в возрасте от 33 до 68 лет (медиана 51 год): 13 (65 %) мужчин и 7 (35 %) женщин. В этой группе распределение боль­ных, согласно критериям MIPI [11], было следующим: 35 % больных были отнесены к группе низкого риска, 50 % — промежуточного риска и 15 % — высокого ри­ска. Оценка соматического статуса для всех больных не превышала 0—1 балла по шкале ECOG [28]. 19 боль­ным перед началом терапии было выполнено ПЭТ/ КТ-исследование с 18Р-фтордезоксиглюкозой: среднее значение максимального стандартизированного уров­ня захвата (SUV_max — standart uptake value) составило 5,0 (от 1,7 до 15,42). Наибольшее значение SUV_max было выявлено у больного с бластоидной морфологией опу­холи, наличием лейкоцитоза и комплексными наруше­ниями кариотипа.

Вовлечение костного мозга было выявлено в 100 % случаев, количество лейкоцитов свыше 20 х 10⁹/л было отмечено у 25 % больных. Из 20 больных у 9 (45 %) выявлено вовлечение экстранодальных органов: 4 — желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), 2 — ЖКТ и пе­чени, 1 — поражение ЖКТ, миндалин, почек и кожи, 1 — ЖКТ и миндалин, 1 — ЖКТ и орбиты.

У 85 % больных обнаружено повышение в сыворот­ке крови концентрации лактатдегидрогеназы (ЛДГ), в среднем до 650 (328—1953) ед/л.

Увеличение размеров селезенки наблюдалось у 10 больных, у 5 больных со спленомегалией более 25 см отмечалась тромбоцитопения. Одному больному была выполнена лечебно-диагностическая спленэкто- мия (размеры селезенки 290 х 170 х 60 мм).

Гистологическая картина в 16 (80 %) случаях была представлена классическим вариантом, и лишь у 4 (20 %) больных был выявлен бластоидный вариант опухоли. Иммуногистохимическое исследование вы­полнено всем больным, в 100 % случаев определялась экспрессия CD20+, CD5+, CyclinDP и отсутствие экс­прессии CD23^-. Оценка индекса пролиферативной ак­тивности Ki-67 была возможна только у 13 из 20 боль­ных. Индекс пролиферативной активности Ki-67 <30 % был отмечен у 11 больных и в 2 случаях — при бластоидном варианте — ЛКМ Ki-67 составлял >40 %.

В 100 % случаев диагноз ЛКМ был подтвержден обна­ружением транслокации t(11;14)(q13;q32) при стандарт­ном цитогенетическом исследовании или методом FISH.

Комплексные нарушения кариотипа, выявленные у 5 (25 %) больных, наблюдались как при бластоидной (2), так и при классической (3) морфологии ЛКМ.

17 больным было выполнено определение мутацион­ного статуса генов вариабельных участков тяжелых цепей иммуноглобулинов (IgHV). У 5 больных доля гомологии герминальным VH генам составила менее 98 % и была определена как мутированный вариант, у 12 больных составила более 98 % (от 98,3 до 100 %) и определена как немутированный вариант. У всех 5 больных ЛКМ с мутированным вариантом отмече­на низкая метаболическая активность (SUV_max от 1,9 до 4,3), отсутствие комплексных нарушений кариотипа, а бластоидная морфология — только в одном случае.

Моноклональная секреция была выявлена у 4 (20 %) больных. В одном случае в сыворотке была выявлена секреция парапротеина Mk 3,2 г/л и следовая секреция белка Бенс-Джонса К в моче. В трех случаях в моче определялась только следовая секреция белка Бенс-Джонса К. Средняя концентрация һ₂-микроглобулина составила 2,8 (2,27—4,78) мг/л.

Во вторую группу было включено 4 больных (2 муж­чин и 2 женщины), в возрасте от 44 лет до 71 года (ме­диана — 61 год). Все больные были отнесены в группу высокого риска. У 2 больных соматический статус со­ответствовал 3—4 баллам по шкале ECOG [28]. У всех больных при обследовании было выявлено вовлечение костного мозга, в 3 случаях — с лейкемизацией (сред­нее количество лейкоцитов крови составляло 66 х 10⁹/л (12,24—124,8 х 10⁹/л). У всех 4 больных было выявлено вовлечение экстранодальных органов: 1 — ЖКТ, 1 — инфильтрация склер и вовлечение печени, 1 — печени и почек, 1 — поражение ЖКТ, кожи, печени и плевры. Спленомегалия наблюдалась у 3 больных, двоим из ко­торых была выполнена лечебно-диагностическая спле- нэктомия (размеры селезенки составляли 328 х 117 х 90 и 208 х 100 х 89 мм). Повышение концентрации ЛДГ в сыворотке было выявлено у всех 4 больных, в сред­нем до 1752 (от 571 до 4329) ед./л.

Морфологическая картина у 3 больных была пред­ставлена бластоидным вариантом, с высоким уровнем пролиферативной активности по экспрессии Ki-67 (до 90 %), наличием комплексных нарушений карио- типа и del17p. У одной больной морфологически опре­делялся классический вариант ЛКМ, с индексом про­лиферативной активности Ki-67 25 %, комплексным кариотипом и делецией 13q и 17р хромосом.

У 2 больных в моче была обнаружена следовая се­креция белка Бенс-Джонса К и λ. У всех больных была отмечена высокая концентрация һ₂-микроглобулина, в среднем 9 (3,66—18,8) мг/л.

При анализе мутационного статуса у всех 4 больных доля гомологии VH генам составил более 98 %, что со­ответствует немутированному варианту.

При секвенировании гена ТР53 (1(2)-11 экзоны) у 4 больных были выявлены миссенс-мутации, распо­ложенные в ДНК-связывающем домене (экзон 5 и сайт сплайсинга 6 интрона по одному случаю и экзон 7 в 2 случаях). В 2 из 4 случаев мутации были выявле­ны не только в одном 7-м экзоне, но и в одной 248-й позиции, где наблюдалась замена аргинина на трип­тофан и на глутамин соответственно. Проанализиро­вана ассоциация мутаций в гене ТР53 с другими кли­нико-лабораторными данными. Выявление мутаций в гене ТР53 в 3 случаях соответствовало бластоидной морфологии и в 1 — классическому варианту ЛКМ. Комплексный кариотип и делеция 17р были выявле­ны у 3 из 4 больных ЛКМ с мутациями в гене ТР53. У 1 больного наличие мутации в сайте сплайсинга 6-го интрона сочеталось с выявлением дупликации гена c-Myc, бластоидным вариантом морфологии опухоли, комплексным кариотипом и отсутствием del17р.

Результаты лечения и оценка токсичности

Результаты лечения и характеристика гемато­логической и негематологической токсичности в группе 1 приведена в таблицах 2 и 3. Оценку ток­сичности проводили по шкале токсичности NCIC- CTC (National Cancer Institute — Common Toxicity Criteria) [29]. Полностью лечение по протоколу R-BAC/R-HA с последующей ауто-ТГСК проведено у 17 из 20 больных. Трое больных продолжают лече­ние. Всем больным из группы высокого риска были выполнены диагностические люмбальные пункции, признаков нейролейкемии выявлено не было. С про­филактической целью интратекально вводились 3 препарата (метотрексат 15 мг, цитарабин 30 мг, дексаметазон 4 мг ) [1].

После проведения курсов R-BAC развитие миелоток- сического агранулоцитоза наблюдалось в 95 % случа­ев, тромбоцитопении и анемии III-IV степени — в 100 и 40 % соответственно. Медиана длительности агранулоцитоза составила 5 дней (от 0 до 19 дней), тромбоцитопении — 8 дней (5-17 дней). Тяжелых геморрагиче­ских осложнений отмечено не было. 

Гематологическая токсичность после проведе­ния курсов по программе R-HA развивалась у всех больных. Миелотоксический агранулоцитоз был зарегистрирован в 100 % случаев, медиана длитель­ности — 8 дней (от 0 до 12 дней). Тромбоцитопения наблюдалась также у всех больных, длительность составила в среднем 8 дней (4-15 дней). Анемия III- IV степени отмечалась в 40 % случаев. Дозы цитара- бина уменьшали на 25-50 % на 4-м индукционном курсе у 4 больных в связи с развитием инфекционных осложнений (катетер-ассоциированный сепсис, пнев­мония) либо длительной лейкопении после предшест­вующего курса ХТ.

Из других осложнений было отмечено транзиторное повышение сывороточной концентрации аминотрансфераз у 35 % больных при проведении ХТ по схеме R-BAC и в 30 % случаев — по схеме R-HA, без клини­ческих проявлений гепатотоксичности.

Негематологическая токсичность при проведении ХТ по схеме R-BAC/R-HA была в основном представ­лена появлением тошноты при введении бендамусти- на, несмотря на проводимую терапию антиэметиками, и развитием «цитарабинового синдрома» — повышение температуры тела до фебрильных значений, купиро­вавшихся введением небольших доз глюкокортикосте­роидов. Инфузионные реакции, связанные с введени­ем ритуксимаба, в виде болей за грудиной, повышения температуры тела наблюдались у 1 больного.

Развитие хотя бы одного эпизода инфекционных осложнений во время миелотоксического агранулоци- тоза определялось у всех больных. Фебрильная лихо­радка отмечена у 18 и 30 % больных после ХТ по схе­ме R-BAC и высоких доз цитарабина соответственно. Пневмония была выявлена у одного больного на пер­вом курсе индукции, и у 2 больных — после курсов R-HA. У 2 больных развились септические осложне­ния грамотрицательной этиологии в период между курсами ХТ R-HA.

После каждого индукционного курса ХТ всем боль­ным проводили промежуточное стадирование с обяза­тельным исследованием МОБ (гистологическое и ци­тологическое исследования костного мозга, проточная цитометрия, цитогенетический анализ и определение В-клеточной клональности).

МОБ-негативность в костном мозге в 1-й группе боль­ных ЛКМ была достигнута после 1-го курса индукции у 7 больных, после 2-го курса — у 9 больных и только в одном случае — после 3-го курса ХТ. Мобилизация и сбор аутологичных стволовых кроветворных клеток выполнены всем больным. Среднее количество CD34+- клеток составило 8,6 х 10⁶/кг (2,6-17,5 х 10⁶/л). Для мо­билизации аутологичных стволовых кроветворных клеток использовали гранулоцитарный колониести­мулирующий фактор (Г-КСФ), и лишь в одном случае возникла необходимость применения плериксафора.

После 4 индукционных курсов для оценки клиниче­ской ремиссии всем больным 1-й группы было выпол­нено контрольное ПЭТ/КТ-исследование. Во всех слу­чаях удалось достичь полного метаболического ответа (1-2 балла по шкале Deaville) [30].

При анализе случаев с бластоидной морфологией, наличием комплексных нарушений кариотипа, деле- цией 17р и высокой пролиферативной активностью значимых отличий в эффективности терапии по про­грамме R-BAC/R-HA/СЕАМ не выявлено.

При достижении полной клинической и МОБ-нега- тивной ремиссии больным выполнялась ауто-ТГСК с кондиционированием в режиме СЕАМ. Гематологи­ческая токсичность III-IV степени развивалась у всех больных после ауто-ТГСК. Лейкопения III-IV степе­ни была зарегистрирована в 100 % случаев. Медиа­на длительности лейкопении составила 9 (от 7 до 15) дней. Всем больным, начиная с + 1-го дня после ау­то-ТГСК, проводили стимуляцию лейкопоэза Г-КСФ в стандартных дозах (5 мг/кг) [1]. Тромбоцитопения III-IV степени выявлялась у 100 % больных. Медиа­на длительности тромбоцитопении составила 14 дней (от 8 до 28). Тяжелых геморрагических осложнений на фоне тромбоцитопении зарегистрировано не было. Анемия III-IV степени наблюдалась у половины боль­ных. Несмотря на проводимую профилактическую терапию антибактериальными, противовирусными и противогрибковыми препаратами, инфекционные осложнения на фоне нейтропении после ауто-ТГСК развились в 100 % случаев. Из наиболее частых ослож­нений были стоматит (100 %), энтеропатия (60 %), фебрильная лихорадка наблюдалась в 70 % случаев. В 23 % в образцах крови, слюны и мочи методом по­лимеразной цепной реакции были обнаружены ДНК герпесвирусов (вирусов простого герпеса 1, 2 и 6-го типов, цитомегаловируса). Ни в одном случае ослож­нения не требовали перевода больных в отделение реа­нимации. При среднем сроке наблюдения 8 (1-20) ме­сяцев после ауто-ТГСК, у всех больных сохранялась МОБ-негативная ремиссия. Всем больным проводи­лась поддерживающая терапия ритуксимабом начи­ная с 3-го месяца после ауто-ТГСК. Кривые общей вы­живаемости представлены на рисунке 1.

Результаты лечения в группе 2 приведены в табли­це 4. Двум больным выполнена алло-ТГСК от неродст­венных полностью идентичных доноров.

Первой больной было проведено несколько различ­ных схем ХТ (R-EPOCH, R-BAC, платиносодержащие курсы) с кратковременным эффектом, были использо­ваны различные варианты таргетной терапии: ибру- тиниб, обинутузумаб в комбинации с бортезомибом и леналидомидом, что позволило достичь лишь стаби­лизации заболевания. За время лечения произведен поиск неродственного полностью идентичного донора. В октябре 2016 г. больной была выполнена алло-ТГСК в режиме кондиционирования пониженной интенсив­ности: флударабин 50 мг — с -9 по -4 дни, треосуль- фан 2500 мг — с -6 по -4 дни, мелфалан 150 мг — в -3 и -2 дни, антитимоцитарный глобулин 2500 мг — с -4 по -1 дни, циклофосфамид 3260 мг — в +3 и +4 дни. Суммарно было перелито 4,0 х 10⁶/кг CD34+-клеток. Восстановление показателей крови отмечено на +18-й день после алло-ТГСК. На +1,2 месяца после алло-ТГСК отмечалось развитие острой реакции «трансплантат против хозяина» (оРТПХ) 2-3-й степени с пораже­нием кожи и ЖКТ, проводилась терапия глюкокор­тикостероидами и, учитывая резистентное течение оРТПХ ЖКТ, терапия второй линии — метотрексатом. На +180-й день после алло-ТГСК больная была госпи­тализирована в отделение реанимации и интенсивной терапии в связи с развитием пневмококкового сепсиса и септического шока, сопровождавшихся полиорганной недостаточностью и пневмококк-индуцированным гемолитико-уремическим синдромом. Проводилась антибиотическая терапия, сеансы плазмообмена, заместительной почечной терапии, в результате которых от­мечался полный регресс инфекционных осложнений. В настоящее время больная остается в полной ремис­сии заболевания, срок наблюдения составляет 27 мес.

Второй больной алло-ТГСК была выполнена в пери­од частичной ремиссии заболевания, после полностью завершенного протокола «ЛКМ-2016». По данным ПЭТ/КТ-исследования, сохранялась лимфаденопа- тия в брюшной полости, по результатам исследования костного мозга у больной определялась МОБ, трансло­кация t(11;14)(q31;q32) и del 17p. В качестве «мостика» к алло-ТГСК в течение двух недель был применен ибру- тиниб в дозе 280 мг/сутки, в результате чего удалось достичь незначительной положительной динамики. В октябре 2018 г. больной была выполнена алло-ТГСК от неродственного полностью идентичного донора. Ре­жим кондиционирования пониженной интенсивности включал флударабин 180 мг/м² + бусульфан 8 мг/кг + антитимоцитарный глобулин 40 мг/кг. Суммарно было перелито 4 х 10⁸/кг миелокариоцитов. Восстановление показателей крови произошло на +18-й день. С целью профилактики оРТПХ была выполнена трансфузия мезенхимальных стромальных клеток донора в коли­честве 1,4 х 10⁶/кг. На сроке +2 месяца после алло-ТГСК на фоне 100 % донорского кроветворения достигнута МОБ-негативность. В настоящее время больной про­должается иммуносупрессивная терапия циклоспо­рином А и преднизолоном в дозе 1 мг/кг массы тела, лечение осложнений оРТПХ печени II степени.

Двое больных ЛКМ с мутациями в гене ТР53 умерли в результате прогрессии заболевания, несмотря на не­сколько линий ХТ и применение таргетных препаратов. У одного больного после завершения протокола «ЛКМ- 2016» была выявлена прогрессия заболевания, подтвер­жденная данными ПЭТ/КТ и исследованием костного мозга. Несмотря на попытку использования ибрутини- ба, у больного не удалось достичь даже стабилизации болезни, и он умер от резистентного течения основного заболевания. Второму больному в связи с быстрой про­грессией заболевания не удалось выполнить программу лечения по протоколу «ЛКМ-2016». После завершения всего лишь двух курсов ХТ у больного была выявлена резистентная нейролейкемия. Среди пяти имеющихся сиблингов при выполнении генотипирования не оказа­лось ни одного полностью идентичного донора. Выпол­нение люмбальных пункций, использование платиносо­держащих курсов, введений бортезомиба не позволило достичь даже незначительного эффекта, и больной умер от прогрессии болезни.

Обсуждение

Благодаря работам D. Weissenburger и соавт. [4, 5], которые описали характерный изолированный рост опухолевых клеток в мантийной зоне вторичных фол­ликулов, ЛКМ в дальнейшем и получила свое назва­ние, а в 1994 г. была выделена в отдельную нозологи­ческую форму. В основе опухолевого патогенеза лежит гиперпродукция В-клеткой белка cyclin D1, обычно в результате транслокации t(11;14)(q13;q32). Однако это не только не первое, но и не единственное событие в развитии ЛКМ. Клиническим проявлениям обычно предшествует многолетний период бессимптомного те­чения ЛКМ [31,32]. У больных ЛКМ, даже с клиниче­скими проявлениями, могут выявляться разные этапы эволюции опухоли. Точная оценка биологии опухоли в момент диагностики будет определять выбор такти­ки лечения и возможность проведения прогноза ЛКМ. Любая индолентно текущая ЛКМ (даже при использо­вании практики наблюдения) неизбежно прогрессиру­ет, приобретая негативные для прогноза «генетические изменения» [31, 32]. Это заложено в патогенезе ЛКМ. Возможно, приобретение таких «генетических анома­лий», как мутации в генах ТР53, Notch1/2, перестройка гена с-Myc в конечном счете не только разделит ЛКМ на две радикально разные по клиническому течению и ответу на терапию группы опухолей, но и сделает проведение ХТ абсолютно неэффективным [7-9]. Со­ответственно, потребуется поиск дифференцирован­ных подходов и в терапии этих двух групп ЛКМ.

В первой группе ЛКМ без мутаций в гене ТР53 был применен протокол лечения, который включает ос­новные принципы ХТ этих опухолей, разработанные в последние годы. Ранняя интенсификация ХТ с целью достижения клинической ПЭТ-негативной ремиссии и МОБ-негативности в костном мозге, высокодозная консолидация и проведение 2-3-летней поддерживаю­щей терапии ритуксимабом доказали свое преимуще­ство [33-37]. С целью повышения эффективности те­рапии, а, возможно, в дальнейшем и излечения ЛКМ необходимо включать в терапию все новые и новые компоненты.

В ряде исследований была доказана рациональность включения бендамустина в первую линию терапии ЛКМ [15, 38-39]. В 2005 г. M.J. Rummel и соавт. [15] показали увеличение медианы БРВ с 22 до 35 месяцев при применении схемы ритуксимаб + бендамустин (R-B), в сравнении с программой R-CHOP, длительное время считавшейся стандартом лечения ЛКМ.

Северно-западной онкологической группой (SWOG) в исследовании S1106 [38] при сравнении схемы R-B и R-hyperCVAD, не было выявлено отличий в ^эфф ек- тивности, оцененной по МОБ, при снижении токсич­ности при применении бендамустина. Кроме того, возможности заготовки аутологичных стволовых ге- мопоэтических клеток оказались существенно выше при использовании схемы RB [38].

Существенным вкладом в повышение эффективно­сти результатов терапии ЛКМ можно считать работу P. Armand и соавт. [17], которые в схеме лечения по­следовательно применили режимы R-B и R-HA (ци­тарабин в высоких дозах, максимально до 12 г/м²). По данным многочисленных проспективных и ран­домизированных исследований [13, 14, 16, 17, 33, 35, 39], при оценке МОБ терапия цитарабином в высо­ких дозах имела явные преимущества по сравнению с другими интенсивными режимами ХТ в лечении ЛКМ. Сочетание режимов R-B и R-HA (ритуксимаб + высокие дозы цитарабина) с последующей высоко- дозной ХТ у 23 больных в возрасте от 42 до 69 лет позволило добиться трехлетней БРВ 85 %, причем МОБ-негативность по костному мозгу была достиг­нута у 93 % больных при чувствительности метода 10^-6 (секвенирование высокого разрешения с детек­цией свободно циркулирующей опухолевой ДНК плазмы) [39]. Терапия была применена в основном у больных группы низкого риска без бластоидной морфологии ЛКМ. Недостатком работ, связанным с применением этого режима, являлось отсутствие информации о результатах терапии больных ЛКМ с мутацией в гене ТР53. Несмотря на это, в насто­ящее время режим R-B/R-HA является наиболее распространенной схемой индукционной терапии ЛКМ в США [39].

Синергический эффект бендамустина и цитарабина был сначала доказан в доклинических экспериментах на опухолевых линиях клеток ЛКМ, а потом успешно внедрен в клиническую практику [16, 17, 39]. С. Visco и соавт. [16] отметили высокую эффективность соче­танного применения ритуксимаба, бендамустина и ци­тарабина в средних дозах в режиме R-BAC (2-летняя БПВ в первой линии терапии достигала 95 %). Режим R-BAC сохранял свою эффективность даже у боль­ных ЛКМ с рецидивом после терапии R-hyperCVAD (2-летняя БПВ достигала 70 %), но оказался недоста­точно эффективным у больных в группе высокого ри­ска (2-летняя БПВ составила только 50 %) [16].

Проанализировав полученные данные, был разрабо­тан исследовательский протокол терапии, включающий в себя ротирующую терапию R-BAC/R-HA. С учетом интенсификации лечения (замены R-B на R-BAC) в дан­ном протоколе было уменьшено количество курсов до 4, что имеет преимущество для повседневной клинической практики, поскольку позволяет уменьшить отсроченную токсичность. По данным ПЭТ-контроля клиническо­го ответа и оценки МОБ-негативности в костном мозге удалось доказать отсутствие потери эффективности те­рапии при сравнении с историческими 6-8-курсовыми контролями ХТ. Аналогичные работы по сокращению индукционной терапии ЛКМ до 4 курсов уже проводи­лись французской группой по изучению лимфом LYSA без заметного снижения э фф ективности [40].

Программа, использованная в данной работе (роти­рование режимов R-BAC и в высоких дозах цитараби- на с последующей высокодозной и поддерживающей терапией), возможно, нивелирует недостатки описан­ных выше режимов и схем ХТ ЛКМ. По результатам лечения 17 больных (3 продолжают терапию), МОБ- негативность по костному мозгу достигнута после 1-го курса у 7 больных, после 2-го у 9 больных, и только у 1 после 3-го курса ХТ. Полные ПЭТ-негативные ре­миссии заболевания получены у всех 17 больных уже после окончания терапии R-BAC/R-HA. В дальнейшем им всем была успешно проведена ауто-ТГСК. По ре­зультатам ПЦР-исследования, В-клеточная клональ- ность не выявлена ни в одном из 17 исследованных лейкоконцентратов после сбора аутологичных стволо­вых гемопоэтических клеток.

Подробно дана оценка гематологической и негема­тологической токсичности режимов R-BAC, R-HA и СЕАМ. Смертность, связанная с лечением, равна 0. Кроме того, как «суррогатный» маркер костномозго­вой токсичности можно использовать показатель эф­фективности сбора аутологичных стволовых клеток крови при проведении терапии R-BAC/R-HA. Эффек­тивность адекватных сборов аутологичных стволовых клеток крови была 100 %, только в 1 случае был исполь­зован плериксафор. Проведенный анализ токсично­сти показал возможность проведения индукционного режима R-BAC/R-HA в большинстве гематологиче­ских клиник России. Снижение доз цитарабина было у 4 больных, выполняемость режима — 100 %.

Недостатками проведенного протокола являются не­большие сроки наблюдения и число больных. Если ори­ентироваться на данные Р. Armand и соавт. [17] и R.W. Merryman и соавт. [39] и воспользоваться критериями МОБ-негативности по костному мозгу, используемы­ми в данной работе, с чувствительностью 10^-4 степени, можно предположить 3-летнюю БРВ около 90 % в груп­пе больных ЛКМ без мутаций в гене ТР53.

Необходимо учитывать « топическую гетерогенность» ЛКМ. Например, отсутствие мутаций в гене ТР53, де­тектируемых с помощью молекулярных исследований низкого разрешения в образцах крови или костного мозга, не исключает их наличие в селезенке или лим­фатических узлах у одного и того же больного [8]. Перспективна разработка и внедрение в практику де­текции мутаций в гене ТР53 с помощью методов высо­кого разрешения (секвенирование нового поколения) на «универсально доступном материале» — свободной опухолевой ДНК плазмы [41, 42].

Во второй группе ЛКМ с мутациями в гене ТР53 ре­зультаты лечения хуже, но полученный опыт позволяет построить новую тактику лечения этих опухолей, ре­зистентных к обычной ХТ. Несмотря на интенсивную ХТ, ни у одного из 4 больных ЛКМ (mut p53+) не было получено не только МОБ-негативности, но даже кли­нической ремиссии заболевания. Низкий процент полных ремиссий и МОБ-негативности был отмечен и в исследовании Nordic MCL group даже после ин­тенсивной индукции и высокодозной консолидации [34, 36]. Поэтому отсутствие клинической ремиссии и МОБ-негативности у больных ЛКМ (mut p53+), является предвестником быстрого прогрессирования опухоли и маркером крайне неблагоприятного про­гноза [43]. В работе С. Eskelund и соавт. [7] несколь­ко больных ЛКМ с мутацией в гене ТР53 пережили 3 года без рецидива заболевания. Этот факт подробно не обсуждается в этом исследовании, но, по данным других работ, вероятно, на прогноз заболевания влия­ет не только обнаружение мутаций в гене ТР53, но и их расположение в определенных экзонах, отвечающих за контакт белка р53 с ДНК, а также приобретение му­тированным белком р53 онкогенных функций (gain of function) [20]. Преимущественное значение (77 % всех случаев) при ЛКМ имеют миссенс-мутации, обычно возникающие в области 5-го и 8-го экзонов, в 176, 248 и 273-й позициях [10, 18, 19]. Обнаружение 2 из 4 му­таций в одном 7-м экзоне и в одной 248-й позиции подтверждает важность не столько наличия мутации в гене ТР53, сколько ее «качества».

Если при хроническом лимфолейкозе ассоциация между del17p и мутацией в гене ТР53 встречается пример­но в 85 % случаев [44], то при ЛКМ эти данные ограни­ченны и противоречивы [10, 45]. По данным T.C. Greiner и соавт. [45], у 82 больных ЛКМ мутации в гене TP53 обнаружены в 19,5 % случаев (16/82), а делеция локуса 17р была выявлена только в 9,8 % (8/82) случаев. Только в 3,7 % случаев определялось сочетание мутации в гене TP53 и делеции 17р [45]. По данным A.M. Halldorsdottir и соавт. [10], только в 8 % случаев были выявлены однов­ременно делеция 17р и мутация в гене ТР53. Кроме того, ассоциации между вариантом морфологии и наличием мутации в гене ТР53 получено не было. Делеция 17р так­же была в равном проценте случаев как при бластоидной, так и при классической морфологии заболевания, но существенно не влияла на прогноз ЛКМ [11].

В настоящей работе только у троих из 4 больных с делецией 17р выявлена мутация в гене ТР53. Еще у 1 больного ЛКМ с мутацией в гене ТР53 делеции 17р не выявлено. Бластоидная морфология выявлена у 3 из 4 больных ЛКМ с мутацией в гене ТР53 и у 4 из 20 больных без мутаций. Таким образом, у больных с бластоидной морфологией ЛКМ и del17p необходимо выполнять молекулярно-генетическое исследование для детекции мутаций в гене ТР53, хотя последняя мо­жет быть обнаружена и при классической морфологии опухоли, и без del17p.

Двое больных ЛКМ с мутациями в гене ТР53 в ис­следовании умерли в ранние сроки после завершения ХТ, несмотря на применение интенсивной ХТ и «тар- гетной» терапии. Двум больным ЛКМ (mut p53+) уда­лось выполнить алло-ТГСК в первой линии терапии. По данным литературы [46—48], в большинстве слу­чаев алло-ТГСК используется уже при рецидиве забо­левания, при рефрактерном течении или неэффектив­ности нескольких линий терапии, однако при явных преимуществах ее проведения в первой линии [49, 50]. Проведение алло-ТГСК ЛКМ сопряжено с большим количеством трудностей: не решена проблема ранней летальности, осложнений РТПХ, а также остается высоким риск рецидива. Однако алло-ТГСК на сегод­няшний день — единственная возможность полного излечения ЛКМ, даже с мутацией в гене ТР53 [47, 48]. По данным R. Lin и соавт. [48], у 19 больных с реф­рактерными/рецидивными формами ЛКМ (3 c del17p, 7 с мутациями в гене ТР53, 9 с гиперэкспрессией бел­ка р53) после выполнения алло-ТГСК 2-летняя ОВ и БПВ выживаемость составила 78 и 61 % соответст­венно. Смертность, не связанная с рецидивом, соста­вила 20 % в течение двух лет. Острая РТПХ II-IV сте­пени была у 43 % больных на 180-й день, хроническая РТПХ — в 33 % на сроке 2 года [48].

Выявление неблагоприятных форм ЛКМ с мутацией в гене ТР53 в дебюте заболевания позволяет обеспечить своевременный поиск донора и провести алло-ТГСК в момент максимальной редукции опухоли, после проведения индукционной ХТ. Проведение таргетной (в виде «мостиков») или сочетанной с ней ХТ является достойной альтернативой интенсивной высокодозной ХТ с возможностями сохранения «биологического ре­зерва» для последующей алло-ТГСК.

Представляется перспективным применение таргет- ной терапии в первой линии терапии ЛКМ, позволяю­щей достичь уничтожения опухолевой В-клетки в об­ход сигнальных путей, ассоциированных с белком р53. Такие препараты, как ингибиторы сигнальных путей В-клеточного рецептора и циклин-зависимых киназ, индукторы апоптоза, иммуномодуляторы, ингибиторы контрольных точек иммунологического синапса, а так­же моноклональные антитела нового поколения, доказа­ли свою эффективность в группе больных с рецидивны­ми и резистентными формами ЛКМ, даже с мутациями в гене ТР53 [51-55]. Длительность ответа при примене­нии различных таргетных препаратов при рецидиве опухоли пока кратковременная, но это дает основание для использования этой терапии в первой линии у боль­ных ЛКМ с мутациями в гене ТР53. Перспективно соче­танное применение ибрутиниба и венетоклакса — пре­паратов, показавших свою эффективность в лечении В-клеточных лимфом с мутациями в гене ТР53, и ХТ в первой линии терапии ЛКМ с мутациями в гене ТР53 [53]. Возможно, это станет альтернативой проведению алло-ТГСК либо позволит более эффективно выпол­нить последнюю.

Высокая эффективность применения ибрутиниба в первой линии терапии была показана у 5 больных, у которых была спленомегалия, позволив достичь максимального уменьшения размеров селезенки, вос­становить количество тромбоцитов крови, провести биологический прайминг и в дальнейшем успешно вы­полнить программу «ЛКМ-2016». Аналогичные рабо­ты по применению таргетной терапии в первой линии больных ЛКМ уже проводятся в ряде клинических исследований, однако без указаний на анализ мута­ций в гене ТР53 [52].

Таким образом, по результатам проведенной работы можно сформулировать несколько выводов.

1. У больных из группы высокого риска, при на­личии бластоидной морфологии ЛКМ, комплексно­го кариотипа, гиперлейкоцитоза, del 17p необходимо проведение молекулярно-генетического исследования на детекцию мутаций в гене ТР53.
2. Перспективна разработка методов молекулярной диагностики высокого разрешения с использованием свободной опухолевой ДНК плазмы с целью более точной детекции мутаций в гене ТР53 при ЛКМ.
3. При обнаружении мутации в гене ТР53 необходимо проведение поиска совместимого донора костного моз- га/гемопоэтических стволовых кроветворных клеток.
4. При наличии совместимого донора, отсутствии клинической ремиссии и позитивности МОБ после проведенной ХТ показано выполнение алло-ТГСК.
5. У больных без мутации в гене ТР53 применение протокола «ЛКМ-2016» показало высокую эффектив­ность в достижении ремиссии, МОБ-негативности при приемлемой токсичности и возможности заго­товки аутологичных стволовых клеток, что диктует необходимость увеличения числа больных, включае­мых в исследование, и сроков наблюдения для фор­мирования окончательных выводов.
6. Необходима разработка альтернативных вариан­тов лечения больных ЛКМ с мутациями в гене ТР53 с применением сочетанной таргетной терапии и ХТ.