Preview

Гематология и трансфузиология

Расширенный поиск

ИЗМЕНЕНИЯ В КЛЕТКАХ-ПРЕДШЕСТВЕННИЦАХ СТРОМАЛЬНОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ КОСТНОГО МОЗГА БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ В ДЕБЮТЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ И В ХОДЕ ЛЕЧЕНИЯ

https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-424-435

Полный текст:

Аннотация

Введение. У больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) изменены свойства клеток-предшественниц стромального микроокружения — мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) и колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕф).

Цель — сравнительное изучение клеток-предшественниц стромального микроокружения ММСК и КОЕф, полученных из костного мозга больных ХМЛ в дебюте заболевания, через год после начала лечения и на длительных сроках лечения ингибиторами тирозиновых киназ (ИТК).

Материалы и методы. Были проанализированы характеристики ММСК и концентрация КОЕф в костном мозге больных ХМЛ, а также относительный уровень экспрессии генов (REL), связанных с дифференцировкой и участвующих в регуляции кроветворения. Анализ проводили в дебюте заболевания, через год после начала лечения, через 3–8 лет и через 9–16 лет терапии ИТК. В качестве контроля использовали ММСК и КОЕф здоровых доноров.

Результаты. Концентрация КОЕф в дебюте заболевания не отличалась от таковой у доноров, однако в колониях из КОЕф был увеличен относительный уровень экспрессии генов, относящихся к дифференцировке. Через год после начала лечения ИТК концентрация КОЕф снижалась в 4 раза, а затем увеличивалась и достигала нормальных значений через 8 лет приема ИТК. Суммарная клеточная продукция ММСК не была изменена в дебюте заболевания, но снижалась через год приема ИТК с последующим восстановлением. В ММСК больных была изменена экспрессия многих генов: экспрессия REL LIF была увеличена в 10, а JAG1 — в 2 раза, экспрессия REL LIF снижалась по мере лечения, но всегда оставалась выше, чем в ММСК доноров, а экспрессия JAG1 нормализовывалась. В ММСК больных, достигших глубокого молекулярного ответа (ГМО) в течение 17 месяцев лечения, экспрессия REL LIF в дебюте заболевания была в три раза ниже, чем у тех, кто не достиг ГМО за 50 месяцев, а JAG1 не отличался от доноров.

Заключение. Изменения в стромальных клетках предшественницах связаны не только с влиянием опухолевых клеток, но и с лечением ИТК. Нормальный уровень экспрессии JAG1 и сниженный уровень экспрессии LIF в ММСК больных ХМЛ в дебюте заболевания могут быть предикторами достижения ГМО.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование: исследование не имело спонсорской поддержки.

Для цитирования:


Петинати Н.А., Шипунова И.Н., Бигильдеев А.Е., Сац Н.В., Челышева Е.Ю., Шухов О.А., Петрова А.Н., Туркина А.Г., Дризе Н.И. ИЗМЕНЕНИЯ В КЛЕТКАХ-ПРЕДШЕСТВЕННИЦАХ СТРОМАЛЬНОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ КОСТНОГО МОЗГА БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ В ДЕБЮТЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ И В ХОДЕ ЛЕЧЕНИЯ. Гематология и трансфузиология. 2019;64(4):424–435. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-424-435

For citation:


Petinati N.A., Shipunova I.N., Bigildeev A.E., Sats N.V., Chelysheva E.Y., Shukhov O.A., Petrova A.N., Turkina A.G., Drize N.I. CHANGES IN STROMAL PROGENITOR CELLS DERIVED FROM BONE MARROW IN PATIENTS WITH CHRONIC MYELOGENOUS LEUKAEMIA AT THE ONSET OF THE DISEASE AND DURING TREATMENT. Russian journal of hematology and transfusiology. 2019;64(4):424–435. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-424-435

Введение

Кроветворение обеспечивается стволовыми кровет­ворными клетками (СКК). СКК локализуются в кост­номозговых нишах, где происходит их регуляция [1]. Костномозговая ниша состоит из множества компо­нентов: остеобласты, остеокласты, адипоциты, эндоте­лиальные клетки, обильные хемокиновыми рецептора­ми 12-го типа ретикулярные клетки (C-X-C chemokine receptor type 12-abundant reticular cells — CAR cells), швановские клетки, мезенхимальные стволовые клет­ки [2]. В состав кроветворного микроокружения также входят потомки мезенхимальных стволовых клеток — мультипотентные мезенхимальные стромальные клет­ки (ММСК) и их производные колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕ-Ф) [3]. Клеточные эле­менты ниши регулируют кроветворение, в свою оче­редь, качественные изменения в кроветворении влия­ют на компоненты кроветворного микроокружения. Показано, что у больных острыми лейкозами проис­ходят значительные изменения в компонентах ниши. В костном мозге больных острыми лейкозами концент­рация КОЕ-Ф некоторые свойства ММСК, экспрессия генов в этих стромальных клетках-предшественниках изменены [4—7]. У больных хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ) уменьшена частота встречаемости ММСК в костном мозге [8] и увеличена экспрессия некоторых генов [9].

В настоящее время более 90 % больных ХМЛ бла­годаря клинической эффективности ингибиторов тирозинкиназ (ИТК) выживают, имея хорошее качест­во жизни [10]. Наличие лейкозных стволовых клеток (ЛСК) обуславливает развитие лейкоза. ЛСК имеют очень много таких же свойств, как у СКК: они рези­стентны к действию цитостатиков за счет повышенной способности удалять из клетки чужеродные вещества, т.е. обладают множественной лекарственной устойчи­востью [11]. Повышенная лекарственная устойчивость ЛСК определяет резистентность их к терапии [12]. Немногие ЛСК, оставшиеся после терапии, вызывают рецидив заболевания примерно у 50 % больных ХМЛ после отмены ИТК [13]. Функционирование и устой­чивость ЛСК связаны со стромальным микроокруже­нием костного мозга, поддерживающим и защищаю­щим ЛСК [14] Опухолевые клетки-предшественницы при ХМЛ измененно взаимодействуют с микроокру­жением костного мозга, и их состояние непрерывной пролиферации может происходить из-за разрегулированных функций важных молекул межклеточной ад­гезии на поверхности ЛСК [15, 16]. В работе W.A. Sands и соавт. [17] было показано, что ЛСК могут изменять нишу, секретирующую различные костимулирующие молекулы и супрессирующие цитокины, которые нацелены на метаболические пути и облегчают уход от иммунного надзора и индукцию резистентности к химиотерапевтическим препаратам. Эти цитокины включают CXCL12, фактор роста стволовых клеток 1 (stem cell factor-1, SCF-1), интерлейкин-6 (ИЛ-6), несколько факторов роста, таких как фактор роста опухоли бета (transforming growth factor beta, TGF-β), основной фактор роста фибробластов (basic fibroblast growth factor, bFGF) и фактор роста эндотелия сосу­дов (vascular endothelial growth factor, VEGF). Во время лейкогенеза злокачественные клоны постепенно стано­вятся независимыми от физиологического контроля ниши [10]. Более того, ММСК экспрессируют раз­личные факторы, участвующие в поддержании ЛСК как в хронической фазе заболевания, так и при нали­чии глубокого молекулярного ответа (ГМО) [9].

Цель работы — сравнительное изучение клеток- предшественниц стромального микроокружения ММСК и КОЕф, полученных из костного мозга боль­ных ХМЛ в дебюте заболевания, через год после нача­ла лечения и на длительных сроках лечения ИТК.

Материалы и методы

Больные и доноры костного мозга

В исследование были включены 73 больных: 18 боль­ных в дебюте ХМЛ (12 из них также были обследова­ны через год), 32 — через 3—8 лет и 23 — через 9—16 лет после начала лечения ИТК. Данные больных пред­ставлены в таблице 1.

 

Таблица 1. Характеристики больных, включенных в исследование

Table 1. Characteristics of CML patients included in the study

Группы

Groups

Мужчины/ Медиана возраста, женщины (разброс), лет

Males/Females Median age, (range), years

Время лечения ИТК, медиана, лет

Median duration of TKI treatment, years

Больные ХМЛ в дебюте заболевания и через 1 год терапии

Patients before treatment and 1 year after the TKI treatment

10/8

40,5 (19-74)

0-1

ГМО и лечение 3-8 лет

DMR and TKI treatment for 3-8 years

19/13

34,5 (23-63)

5

ГМО и лечение 9-16 лет

DMR and TKI treatment for 9-16 years

10/13

53 (32-80)

11

Все больные и доноры подписали информированное согласие на забор костного мозга. Исследование было одобрено этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ гема­тологии» МЗ РФ. Образцы костного мозга получали в момент рутинных диагностических пункций костно­го мозга. Все больные после длительного лечения ИТК имели ГМО, пункции костного мозга выполнялись в связи с планируемой отменой ИТК.

Поскольку характеристики ММСК и КОЕф за­висят от возраста, в качестве контроля для ММСК и КОЕф больных в дебюте заболевания, больных через 1 и 3—8 лет после начала терапии использовали ММСК и КОЕф из костного мозга 60 здоровых до­норов (24 мужчины и 36 женщин), в возрасте от 20 до 78 лет (медиана 49 лет), для больных через 9—16 лет после начала терапии использовали ММСК и КОЕф из костного мозга 43 здоровых доноров лет (21 муж­чина, 21 женщина) в возрасте от 31 до 78 лет (медиана 50 лет).

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

ММСК выделяли из 3—5 мл костного мозга больных и здоровых доноров. Для выделения мононуклеаров костный мозг смешивали с равным объемом среды аМЕМ media (ICN), содержащей 0.2 % метилцеллюлозы (1500 cP, Sigma-Aldrich). Через 40 мин большин­ство эритроцитов и гранулоцитов оседали, в то время как мононуклеарные клетки оставались в суспензии. Затем верхнюю фракцию (суспензию) отбирали и цент­рифугировали в течение 10 мин при 450 G. Клеточный осадок ресуспендировали в стандартной среде для куль­тивирования, состоящей из среды aMEM с 10 % эмбрио­нальной телячьей сыворотки (ЭТС) Hyclone, 2 мМ L-глутамина (ICN), 100 ЕД/мл пенициллина (Ferein) и 50 мкг/мл стрептомицина (Ferein). Клетки культиви­ровали по 3 х 106 клеток на флакон T25 см2 (Corning- Costar). После формирования конфлюэнтного монослоя клетки отмывались 0,02 % ЭДТА (ICN) в физиологиче­ском растворе (Sigma-Aldrich), а затем обрабатывались трипсином (ICN). Клетки рассаживали по 4 х 103 кле­ток на см2 площади флакона. Культуры при 37 °C в ат­мосфере с 5 % CO2.

ММСК были иммунофенотипированы [18] для определения поверхностных молекул [19] (рис. 1А) и получены данные по дифференцировке клеток in vitro в остеобласты и адипоциты стандартным методом [20] (рис. 1Б).

 

Рисунок 1. Характеристики ММСК: А — иммунофенотип ММСК, экспрессированы антигены CD105, CD73, CD90; не экспрессированы маркеры кроветворных клеток CD45, CD34, CD14, CD19 и HLA-DR; Б — дифференцировка ММСК в остеогенном и адипогенном направлениях

Figure 1. Characteristics of MMSCs. A. Immunophenotype of MMSCs, antigens CD105, CD73, CD90 are expressed; hematopoietic cell markers CD45, CD34, CD14, CD19 and HLA-DR are not expressed. Б. Differentiation of multipotent MSCs in osteogenic and adipogenic directions

 

Анализ колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕф) из костного мозга

Для анализа КОЕф ядросодержащие клетки по­лученных образцов костного мозга культивирова­ли по 106 и 5 х 105 на флакон с площадью дна 25 см2 в среде альфа-MEM с 20 % ЭТС (Hyclone, США), 2 мМ L-глутамина (ICN, США), 100 ед/мл пеницил­лина («Ферейн», Россия), 50 мкг/мл стрептомицина («Ферейн», Россия) в течение 14 дней. Подсчет колоний производили под бинокулярной лупой (Opton, Германия) после окрашивания в 1 % кристаллвиолете на 20 % метаноле.

Определение относительного уровня экспрессии генов

Определение уровня экспрессии генов проводилось методом обратной транскрипции с последующей по­лимеразной цепной реакцией в режиме реального вре­мени (модификация Taq-Man) на приборе Rotor-Gene (Corbett, Australia). Для выделения РНК был исполь­зован стандартный протокол с небольшими модифи­кациями [21]. Для построения первых цепей ДНК после гибридизации мРНК со смесью поли-Т-праймеров и случайных гексамеров использовали обрат­ную транскриптазу (M-MLV, Promega) в соответствии с рекомендациями производителя. Для нормализации образцов использовали гены «домашнего хозяйства» BACT (бета-актин) и GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа), относительный уровень экспрес­сии генов рассчитывали методом ΔΔCt: [22].

Статистический анализ. Данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего. Достоверность различий средних значений определялась с помощью критерия Манна—Уитни для распределений, отлич­ных от нормального и A-критерия Стьюдента для нор­мальных распределений (достоверными считались прир < 0,05).

Результаты

Концентрация КОЕф и ростовые характеристики ММСК

Изучили концентрацию КОЕф и ростовые характе­ристики ММСК больных ХМЛ в дебюте заболевания и в течение терапии ИТК до 16 лет. В дебюте заболевания и в самом начале лечения концентрация КОЕф в кост­ном мозге больных не отличалась от таковой у доноров (табл. 2). Через год после начала лечения концентрация КОЕф снижалась почти в 4 раза, а затем постепенно увеличивалась в группе больных, которые получали терапию более 8 лет. В этой группе больных концент­рация КОЕф в костном мозге не отличалась от концен­трации в костном мозге здоровых доноров. Суммарная продукция ММСК за 4 пассажа достоверно снижалась в 2 раза через год после начала терапии, а затем посте­пенно увеличивалась и не отличалась от таковой у до­норов. У больных в дебюте заболевания время до Р0, т.е. достижения конфлюентного монослоя после установ­ления культуры, было достоверно увеличено, что ука­зывало на уменьшение концентрации стромальных предшественников в костном мозге. Далее время до Р0 постепенно уменьшалось и после 8 лет лечения не отли­чалось от такового у доноров. Время удвоения популя­ции ММСК было в 2 раза больше в дебюте заболевания по сравнению с ММСК доноров и оставалось увеличен­ным в течение года лечения ИТК, после еще несколь­ких лет лечения оно нормализовалось и не отличалось от доноров соответственного возраста.

 

Таблица 2. Концентрация КОЕ-Ф и культуральные характеристики ММСК больных ХМЛ до начала и во время лечения

Table 2. Concentration of CFU-Fs and the cultural characteristics of MMSCs in CML patients prior to and during TKI treatment

Характеристики

Characteristics

Доноры (n = 60) (M = 42 года) Donors (n = 60) (M = 42 years)

Больные до лечения (n = 18) Patients prior to treatment

Лечение ИТК в течение 1 года дебют (n = 18)

1 year of TKI treatment (n = 18)

Лечение ИТК меньше 8 лет (n = 32)

Less than 8 years of TKI treatment (n = 32)

Доноры (n = 43)

(M = 49 лет) Donors (n = 43) (M = 49 years)

Лечение ИТК больше 8 лет (n = 23)

More than 8 years of TKI treatment (n = 23)

Концентрация КОЕф на 106 клеток костного мозга

Concentration of CFU-Fs per 106 bone marrow cells

16,2 ± 2,8

17,1 ± 4,6

4,9 ± 1,2*

11,9 ± 2,6

171 ± 3,7

14,2 ± 2,8

Суммарная продукция MМСК за 3 пассажа, x 106

Cumulative production of MMSCs during 3 passages, x106

10,9 ± 1,2

74 ± 1,8

6,5 ± 0,8*

13,5 ± 1,8

77 ± 1

8,6 ± 1,4

Время до Р0, дней

Time before P0, days

14,4 ± 0,4

17,9 ± 0,9*

17,6 ± 0,8*

14,7 ± 0,7

14,5 ± 0,5

15,2 ± 0,6

Время удвоения популяции, дней

Population doubling time, days

2,9 ± 0,2

6 ± 0,8*

5 ± 0,5*

2,7 ± 0,2

3,1 ± 0,2

3,5 ± 0,3

Примечание. М — медиана возраста; * — обозначает р< 0,05 при сравнении с соответствующей группой доноров при помощи f-критерия Стъюдента для независимых выборок.

Note. М — median age; * — denotes p <0.05 when compared to the corresponding donor group using the Student's t-test for independent samples.

Анализ экспрессии генов в КОЕф и ММСК

Экспрессия многих генов изменялась в КОЕф в де­бюте заболевания. К ним относятся гены, связанные с хрящевой, жировой и костной дифференцировками (SOX9, PPARG и BGLAP, SPP1), экспрессия которых достоверно повышалась. Это означает, что КОЕф были индуцированы к дифференцировке и, скорее всего, обеспечивали взрослыми стромальными клет­ками костный мозг более интенсивно, что, в свою очередь, связано с повреждением стромального ми­кроокружения опухолевыми клетками. Экспрессия генов, связанных с пролиферацией предшественни­ков, сильно не изменялась. Экспрессия ВМР4 была значительно повышена, и достоверно отличалась от таковой у доноров.

Анализ относительного уровня экспрессии генов в ММСК больных ХМЛ показал, что в дебюте за­болевания стромальные клетки-предшественницы были активированы по сравнению с таковыми у доно­ров. Относительный уровень экспрессии генов фак­торов, регулирующих кроветворные клетки и ЛСК (IL6 и LIF), был достоверно повышен в 2,5 и 14 раз соответственно (табл. 4). По мере лечения экспрессия генов этих факторов постепенно снижалась, однако уровень экспрессии IL6 все равно оставался выше, чем у доноров. Некоторые факторы роста ММСК (FGF2, его рецепторы — FGFR1, FGFR2, рецептор фактора роста из тромбоцитов — PDGFRA) были повышены в дебюте заболевания, тогда как экспрессия фактора роста сосудистого эндотелия — VEGF, опухолевого фактора роста 1 и 2 — TGFB1 и TGFB2 не были из­менены (табл. 4). Среди изученных молекул адгезии достоверное снижение в 2 раза было отмечено только для МСАМ, остальные молекулы не были изменены. Экспрессия генов, участвующие в дифференцировке ММСК (SPP1, SOX9, PPARG), была повышена в дебю­те заболевания. Относительный уровень экспрессии PPARG оставался повышенным через год после на­чала лечения, а затем постепенно нормализовался. Экспрессия гена маркера костной дифференцировки (SPP1) постепенно повышалась по мере лечения, экспрессия маркера хрящевой (SOX9) дифференци- ровки была увеличена в дебюте заболевания и в те­чение года лечения, однако при длительном лечении ИТК достоверно снижалась в 2 раза по сравнению с таковыми у доноров. Экспрессия генов, характер­ных для ММСК (NES, JAG1 и IGF1), была повышена в дебюте заболевания и постепенно нормализовалась при длительном лечении за исключением NES, уро­вень экспрессии которого достоверно уменьшался по сравнению с таковым у доноров.

Таким образом, у больных ХМЛ профиль экспрес­сии генов изменен в дебюте заболевания и только ча­стично нормализуется даже при длительной терапии.

 

Таблица 3. Изменение относительного уровня экспрессии некоторых генов в КОЕ-Ф больных ХМЛ

Table 3. Changes in the REL of some genes in CFU-F in CML patients

Группы

Groups

BGLAP

SPP1

PPARG

SOX9

FGFR1

FGFR2

VEGF

FGF2

BMP4

Доноры (η = 60)

Donors (n = 60)

1,0 ± 0,2

6,3 ± 2,1

1,7 ± 0,5

0,1 ± 0,03

0,8 ± 0,1

0,4 ± 0,2

1,1 ± 0,3

5,3 ± 2,1

0,3 ± 0,1

ХМЛ дебют (η = 18)

Primary CML patients (n = 18)

2,9 ± 0,3*

16,6 ± 3,8*

6,9 ± 1,7*

1,3 ± 0,4*

0,7 ± 0,04

0,4 ± 0,2

0,95 ± 0,1

73 ± 2,5

1,1 ± 0,3*

Примечание. * — р < 0,05 при сравнении с соответствующей группой доноров при помощи f-критерия Стъюдента для независимых выборок.

Note. * — p < 0.05 when compared with the corresponding donor group using the Student's t-test for independent samples.

 

 

Таблица 4. Относительный уровень экспрессии некоторых генов в ММСК больных ХМЛ до начала и в процессе лечения

Table 4. Relative expression level of some genes in the MMSCs of CML patients prior to and during TKI treatment

Анализ ММСК у больных в зависимости от достижения ГМО

При анализе ММСК у больных в дебюте заболевания в зависимости от дальнейшего достижения ими ГМО были обнаружены закономерности. У больных, не достигших ГМО в течение 4-х лет, была меньше концентрация КОЕф в костном мозге, суммарная клеточная продукция за 4 пассажа также была меньше, а время до Р0 увеличено (табл. 5). Все эти изменения не достоверны, однако прослеживалась тенденция, указывающая на более значительное повреждение стромальных клеток-предшественниц у группы больных, не достигших ГМО. В ММСК больных, достигших ГМО, относительный уровень экспрессии 3-х генов, отвечающих за регуляцию кроветворных клеток, был в 2 раза ниже, чем в ММСК больных, не достигших ГМО (табл. 5).

Таким образом, в работе выявлены существенные различия в стромальных клетках-предшественницах больных в зависимости от их ответа на лечение ИТК и достижения ГМО.

 

Таблица 5. Характеристики ММСК у больных в зависимости от достижения ими ГМО

Table 5. Characteristics of MMSCs in patients at the onset of the disease depending on the DMR achievement

Достижение ГМО

DMR

+

-

Количество больных

Number of patients

5

8

Длительность терапии ИТК в момент анализа

Time of TKI treatment at the moment of analysis

17З ± 3,2

50,2 ± 1,6

Концентрация КОЕф в костном мозге на 106 клеток

CFU-F concentration per 106 bone marrow cell

29,5 ± 5,0

10,6 ± 3,6

Суммарная продукция ММСК, x 106

Cumulative MMSCs production for 4 passages, x 106

14,5 ± 2,0

5,3 ± 1,7

Время до РO, дней

Time to PO, days

15,6 ± 0,2

18,9 ± 1,4

Достоверные отличия в REL генов в ММСК*

Significant differences in REL in MMSCs

Jag1

3,6 ± 0,1*

6,0 ± 0,7

TGFb1

0,6 ± 0,3*

1,7 ± 0,2

LIF

4,6 ± 1,9*

12,5 ± 2,7

Примечание. * — обозначает р < 0,05 при сравнении групп больных достигших ГМО и не достигших при помощи t-критерия Стьюдента для независимых выборок.

Note. * — indicates p < 0.05 when compared MSCs from patients with DMR with the patients without DMR using the Student's t-test for independent samples.

 

Обсуждение

Известно, что не только строма костного мозга опре­деляет кроветворение, но и качество кроветворения влияет на стромальные клетки [23, 24]. Как опухолевые клетки, так и ИТК могут оказывать влияние на строму больных ХМЛ. Было показано [25], что ММСК боль­ных ХМЛ в дебюте заболевания и в течение года ле­чения ИТК лучше поддерживают кроветворные клет­ки-предшественники, чем ММСК доноров и больных острыми лейкозами.

Целью настоящей работы было изучение стромальных клеток-предшественниц у больных ХМЛ в дебюте заболевания и по мере лечения ИТК. Известно, что стромальные и мезенхимальные клетки у этих больных не затронуты опухолевым клоном [26]. Исследование концентрации КОЕф, основных характеристик ММСК, паттерна экспрессии некоторых генов, уча­ствующих в дифференцировке стромальных клеток и поддержании кроветворения, определяют измене­ния в стромальных предшественниках. В работе пока­зано, что концентрация КОЕф и суммарная клеточная продукция ММСК не отличаются от таковых у доно­ров в дебюте заболевания. Через год после начала ле­чения концентрация КОЕф в костном мозге больных уменьшалась в 4 раза, а суммарная клеточная про­дукция ММСК уменьшалась в 2 раза, что указывает на повреждающее влияние ИТК на стромальные пред­шественники. Далее, по мере длительного лечения, концентрация КОЕф и пролиферативный потенциал ММСК восстанавливались. Вероятно, стромальные клетки постепенно адаптируются к ингибированию тирозиновых киназ. Анализ REL генов, участвующих в мезенхимальной дифференцировке КОЕф, выявил достоверное увеличение экспрессии генов-маркеров костной (BGLAP и SPP1), хрящевой (SOX9) и жировой (PPARG) дифференцировок. КОЕф больных в дебюте заболевания оказались более дифференцированными, чем у доноров. При этом в дебюте заболевания умень­шалась концентрация ММСК, что совпадает с дан­ными других авторов [27, 28]. Опухолевые клетки адаптируют ниши костного мозга и, вероятно, инду­цируют образование новых кроветворных территорий для опухолевых стволовых клеток. После длительного лечения у больных восстанавливаются количествен­ные показатели стромальных клеток-предшественниц. В ММСК больных изменен профиль экспрессии некоторых генов. В дебюте заболевания в ММСК боль­ных достоверно повышена экспрессия генов, участву­ющих в регуляции кроветворения, — IL6, LIF, CSF1, IGF1, JAG1 и SDF1; ростовых факторов для ММСК — FGF2, FGFR1, FGFR2, PDGFRA, BMP4 генов, участву­ющих в дифференцировке ММСК — SOX9, PPARG. Повышение экспрессии SDF1 — гена цитокина, отве­чающего за попадание кроветворных клеток в строму костного мозга, JAG1 — гена белка, регулирующего пролиферацию и дифференцировку стволовых кро­ветворных клеток, указывает на повышенную способ­ность ММСК поддерживать кроветворение, что под­тверждается данными об улучшении способности ММСК больных поддерживать кроветворные клетки предшественницы доноров [25]. При этом экспрессия генов молекул адгезии также связанных с хомингом СКК (MCAM и ICAM1) снижена в ММСК больных и не восстанавливается до уровня ММСК доноров по мере лечения. В работе D. Aggoune и соавт. [9] была показана повышенная экспрессия других генов, отно­сящихся к статусу «стволовости» ММСК — NANOG, FOXO3 по сравнению с ММСК доноров. К этим генам в нашей работе можно добавить LIF и IGF1. По мере ле­чения, в зависимости от его длительности, экспрессия всех этих генов уменьшалась и в некоторых случаях достигала таковой в ММСК доноров. Восстановление ростовых характеристик ММСК после длительного лечения можно объяснить частичной нормализаци­ей экспрессии FGF2, FGFR1, FGFR2, PDGFRA, BMP4 и генов, относящихся к дифференцировке, — SOX9, PPARG. Очевидно, что изменения в экспрессии генов не однозначны и затрагивают различные свойства ММСК. Суммарно можно заключить, что концен­трация КОЕф и основные характеристики ММСК восстанавливаются после многих лет терапии ИТК. Вероятно, ИТК не оказывают фатального влияние на ростовые характеристики клеток-предшественниц стромального микроокружения.

Было показано, что ЛСК и СКК по-разному регу­лируются стромальным микроокружением костного мозга [29], однако по большинству характеристик эти клетки совпадают [30]. Анализ ММСК в 2-х груп­пах больных в дебюте заболевания, достигших ГМО менее чем за 1,5 года и не достигших ГМО более чем за 4 года, выявил существенные изменения в экспрес­сии генов, участвующих в регуляции СКК. В ММСК группы больных, достигших ГМО, REL LIF был в 2 раза ниже, чем в общей группе, и в 3 раза ниже, чем в группе больных, не достигших ГМО, а REL JAG1 и TGFB1 был в 2 раза ниже. Очевидно, что ЛСК лучше поддерживаются ММСК с более высоким уровнем экс­прессии этих регуляторных генов. Такие ЛСК более успешно выживают под действием ИТК, что не дает возможности получить ГМО у этих больных.

У больных увеличение количества ЛСК связано с из­менением регуляции в сигнальном пути ВМР (кост­ного морфогенетического белка), которое сохраняет­ся у больных, резистентных к терапии ИТК [31, 32]. Сигналы BMP контролируют стволовые клетки в ни­шах. Белки семейства ВМР (BMP2 и BMP4) важны как для нормального кроветворения, так и при опухоле­вой трансформации. Факторы семейства BMP, первона­чально описанные при формировании кости, оказались связанными с биологией большого числа органов и сис­тем, от эмбриональных до взрослых тканей, и участвуют в пролиферации, дифференцировке и апоптозе стволо­вых клеток. Клетки опухолевого микроокружения — основные источники растворимых ВМР. И наоборот, ЛСК отображают измененные рецепторы и сигнальные элементы BMP [33, 34]. Показано, что ВМР 4 вовлечен в развитие резистентности к ИТК [35]. Разницы в экс­прессии ВМР2 и ВМР4 в этих двух группах больных об­наружено не было. Однако в ММСК больных в дебю­те заболевания ВМР2 достоверно ниже, чем у доноров, а ВМР4 — выше и в ММСК, и в КОЕф. Через год после начала лечения экспрессия обоих генов либо еще боль­ше снижается, либо увеличивается.

Таким образом, важность стромального микро­окружения для функционирования и сохранения ЛСК у больных ХМЛ не вызывает сомнений. Исследование стромальных клеток-предшественниц у этих больных в дебюте заболевания может иметь прогностическое значение.

Об авторах

Н. А. Петинати
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии», лаборатория физиологии кроветворения Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Петинати Наталия Арнольдовна*, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологии кроветворения


И. Н. Шипунова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии», лаборатория физиологии кроветворения Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Шипунова Ирина Николаевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологии кроветворения


А. Е. Бигильдеев
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии», лаборатория физиологии кроветворения Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Бигильдеев Алексей Евгеньевич, доктор биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологии кроветворения


Н. В. Сац
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии», лаборатория физиологии кроветворения Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Сац Наталья Владимировна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологии кроветворения


Е. Ю. Челышева
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии», научно-консультативное отделение химиотерапии миелопролиферативных заболеваний Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Челышева Екатерина Юрьевна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник научно-консультативного отделения химиотерапии миелопролиферативных заболеваний


О. А. Шухов
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии», научно-консультативное отделение химиотерапии миелопролиферативных заболеваний Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Шухов Олег Александрович, кандидат медицинских наук, научный сотрудник отделения, врач-гематолог 

тел.: +7(495)612-16-36



А. Н. Петрова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии», научно-консультативное отделение химиотерапии миелопролиферативных заболеваний Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Петрова Анна Николаевна, аспирант научно-консультативного отделения химиотерапии миелопролиферативных заболеваний, врач-гематолог


А. Г. Туркина
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии», научно-консультативное отделение химиотерапии миелопролиферативных заболеваний Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Туркина Анна Григорьевна, доктор медицинских наук, профессор, руководитель научно-консультативного отделения химиотерапии миелопролиферативных заболеваний


Н. И. Дризе
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии», лаборатория физиологии кроветворения Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Дризе Нина Иосифовна, доктор биологических наук, заведующая лабораторией физиологии кроветворения


Список литературы

1. Taichman R.S. Blood and bone: two tissues whose fates are intertwined to create the hematopoietic stem-cell niche. Blood. 2005; 105: 2631–9.

2. Kumar S., Geiger H. HSC Niche Biology and HSC Expansion ex vivo. Trends Mol. Med. 2017; 23: 799–819.

3. Morrison S.J., Scadden D.T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 2014; 505: 327–34.

4. Chen Q., Yuan Y., Chen T. Morphology, differentiation and adhesion molecule expression changes of bone marrow mesenchymal stem cells from acute myeloid leukemia patients. Mol. Med. Rep. 2014; 9: 293–8.

5. Shipounova I.N., Petrova T.V., Svinareva D.A. et al. Alterations in hematopoietic microenvironment in patients with aplastic anemia. Clin. Transl. Sci. 2009; 2: 67–74.

6. Shipounova I.N., Petinati N.A., Bigildeev A.E. et al. Alterations of the bone marrow stromal microenvironment in adult patients with acute myeloid and lymphoblastic leukemias before and after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Leuk. Lymphoma. 2017; 58: 408–17.

7. Zhao Z.-G., Liang Y., Li K. et al. Phenotypic and functional comparison of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow of normal adults and patients with hematologic malignant diseases. Stem. Cells Dev. 2007; 16: 637–48.

8. Estrada-González P.K., Gómez-Ceja L., Montesinos J.J. et al. Decreased frequency, but normal functional integrity of mesenchymal stromal cells derived from untreated and Imatinib-treated chronic myeloid leukemia patients. Leuk. Res. 2014; 38: 594–600.

9. Aggoune D., Sorel N., Bonnet M-L. et al. Bone marrow mesenchymal stromal cell (MSC) gene profi ling in chronic myeloid leukemia (CML) patients at diagnosis and in deep molecular response induced by tyrosine kinase inhibitors (TKIs). Leuk. Res. 2017; 60: 94–102.

10. Arrigoni E., Del Re M., Galimberti S. et al. Concise Review: Chronic Myeloid Leukemia: Stem Cell Niche and Response to Pharmacologic Treatment. Stem. Cells Transl. Med. 2018; 7: 305–14.

11. Guzman M.L., Swiderski C.F., Howard D.S., et al. Preferential induction of apoptosis for primary human leukemic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2002; 99 (25): 16220–5.

12. Horne G., Jackson L., Helgason V., Holyoake T. Stem Cell Guardians — Old and New Perspectives in LSC Biology. Curr. Drug Targets. 2017; 18: 405–13.

13. Rea D., Mahon F-X. How I manage relapse of chronic myeloid leukaemia after stopping tyrosine kinase inhibitor therapy. Br. J. Haematol. 2018; 180: 24–32.

14. Bhatia R. Novel approaches to therapy in CML. Hematol Am Soc Hematol Educ Progr. 2017; 2017: 115–20.

15. Bhatia R., McGlave P.B., Dewald G.W. et al. Abnormal function of the bone marrow microenvironment in chronic myelogenous leukemia: role of malignant stromal macrophages. Blood. 1995; 85: 3636–45.

16. Camacho V., McClearn V., Patel S., Welner R.S. Regulation of normal and leukemic stem cells through cytokine signaling and the microenvironment. Int. J. Hematol. 2017; 105: 566–77.

17. Sands W.A., Copland M., Wheadon H. Targeting self-renewal pathways in myeloid malignancies. Cell Commun. Signal. 2013; 11: 33.

18. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defi ning multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8: 315–7.

19. Fong T.A., Mosmann T.R. Alloreactive murine CD8+ T cell clones secrete the Th1 pattern of cytokines. J. Immunol. 1990; 144: 1744–52.

20. Свинарева Д.А., Шипунова И.Н., Ольшанская И.В. и др. Основные свойства мезенхимальных стромальных клеток донорского костного мозга: поверхностные маркеры. Терапевтический архив. 2010; 82: 52–6.

21. Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 2006; 1 (2): 581–5. DOI: 10.1038/nprot.2006.83

22. Schmittgen T.D., Livak K.J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nat. Protoc. 2008; 3: 1101–8.

23. Frisch B.J., Ashton J.M., Xing L. et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 2012; 119: 540–50.

24. Lane SW. Bad to the bone. Blood. 2012; 119: 323–5.

25. Sorokina T., Shipounova I., Bigildeev A. et al. The ability of multipotent mesenchymal stromal cells from the bone marrow of patients with leukemia to maintain normal hematopoietic progenitor cells. Eur. J. Haematol. 2016; 97: 245–52.

26. Maniatis A.K., Amsel S., Mitus W.J., Coleman N. Chromosome pattern of bone marrow fi broblasts in patients with chronic granulocytic leukaemia. Nature. 1969; 222: 1278–9.

27. DiIanni M., Moretti L., Del Papa B. et al. Chronic myeloproliferative disorders: the bone marrow stromal component is not involved in the malignant clone. Leukemia. 2007; 21: 377–8.

28. Estrada-González P.K., Gómez-Ceja L. et al. Decreased frequency, but normal functional integrity of mesenchymal stromal cells derived from untreated and Imatinib-treated chronic myeloid leukemia patients. Leuk. Res. 2014; 38: 594–600.

29. Zhang B., Ho Y.W., Huang Q. et al. Altered microenvironmental regulation of leukemic and normal stem cells in chronic myelogenous leukemia. Cancer Cell. 2012; 21: 577–92.

30. Dick J.E. Stem cell concepts renew cancer research. Blood. 2008; 112: 4793–807.

31. Toofan P., Irvine D., Hopcroft L. et al. The role of the bone morphogenetic proteins in leukaemic stem cell persistence. Biochem. Soc. Trans. 2014; 42: 809–15.

32. Gerber J.M., Gucwa J.L., Esopi D. et al. Genome-wide comparison of the transcriptomes of highly enriched normal and chronic myeloid leukemia stem and progenitor cell populations. Oncotarget. 2013; 4(5): 715–28.

33. Laperrousaz B., Jeanpierre S., Sagorny K. et al. Primitive CML cell expansion relies on abnormal levels of BMPs provided by the niche and on BMPRIb overexpression. Blood. 2013; 122: 3767–77.

34. Zylbersztejn F., Flores-Violante M., Voeltzel T. et al. The BMP pathway: A unique tool to decode the origin and progression of leukemia. Exp. Hematol. 2018; 61: 36–44.

35. Grockowiak E., Laperrousaz B., Jeanpierre S., et al. Immature CML cells implement a BMP autocrine loop to escape TKI treatment. Blood. 130: 2860–71.


Для цитирования:


Петинати Н.А., Шипунова И.Н., Бигильдеев А.Е., Сац Н.В., Челышева Е.Ю., Шухов О.А., Петрова А.Н., Туркина А.Г., Дризе Н.И. ИЗМЕНЕНИЯ В КЛЕТКАХ-ПРЕДШЕСТВЕННИЦАХ СТРОМАЛЬНОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ КОСТНОГО МОЗГА БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ В ДЕБЮТЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ И В ХОДЕ ЛЕЧЕНИЯ. Гематология и трансфузиология. 2019;64(4):424–435. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-424-435

For citation:


Petinati N.A., Shipunova I.N., Bigildeev A.E., Sats N.V., Chelysheva E.Y., Shukhov O.A., Petrova A.N., Turkina A.G., Drize N.I. CHANGES IN STROMAL PROGENITOR CELLS DERIVED FROM BONE MARROW IN PATIENTS WITH CHRONIC MYELOGENOUS LEUKAEMIA AT THE ONSET OF THE DISEASE AND DURING TREATMENT. Russian journal of hematology and transfusiology. 2019;64(4):424–435. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-424-435

Просмотров: 72


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0234-5730 (Print)
ISSN 2411-3042 (Online)