ИЗМЕНЕНИЯ В КЛЕТКАХ-ПРЕДШЕСТВЕННИЦАХ СТРОМАЛЬНОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ КОСТНОГО МОЗГА БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ В ДЕБЮТЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ И В ХОДЕ ЛЕЧЕНИЯ

Введение

Кроветворение обеспечивается стволовыми кровет­ворными клетками (СКК). СКК локализуются в кост­номозговых нишах, где происходит их регуляция [1]. Костномозговая ниша состоит из множества компо­нентов: остеобласты, остеокласты, адипоциты, эндоте­лиальные клетки, обильные хемокиновыми рецептора­ми 12-го типа ретикулярные клетки (C-X-C chemokine receptor type 12-abundant reticular cells — CAR cells), швановские клетки, мезенхимальные стволовые клет­ки [2]. В состав кроветворного микроокружения также входят потомки мезенхимальных стволовых клеток — мультипотентные мезенхимальные стромальные клет­ки (ММСК) и их производные колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕ-Ф) [3]. Клеточные эле­менты ниши регулируют кроветворение, в свою оче­редь, качественные изменения в кроветворении влия­ют на компоненты кроветворного микроокружения. Показано, что у больных острыми лейкозами проис­ходят значительные изменения в компонентах ниши. В костном мозге больных острыми лейкозами концент­рация КОЕ-Ф некоторые свойства ММСК, экспрессия генов в этих стромальных клетках-предшественниках изменены [4—7]. У больных хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ) уменьшена частота встречаемости ММСК в костном мозге [8] и увеличена экспрессия некоторых генов [9].

В настоящее время более 90 % больных ХМЛ бла­годаря клинической эффективности ингибиторов тирозинкиназ (ИТК) выживают, имея хорошее качест­во жизни [10]. Наличие лейкозных стволовых клеток (ЛСК) обуславливает развитие лейкоза. ЛСК имеют очень много таких же свойств, как у СКК: они рези­стентны к действию цитостатиков за счет повышенной способности удалять из клетки чужеродные вещества, т.е. обладают множественной лекарственной устойчи­востью [11]. Повышенная лекарственная устойчивость ЛСК определяет резистентность их к терапии [12]. Немногие ЛСК, оставшиеся после терапии, вызывают рецидив заболевания примерно у 50 % больных ХМЛ после отмены ИТК [13]. Функционирование и устой­чивость ЛСК связаны со стромальным микроокруже­нием костного мозга, поддерживающим и защищаю­щим ЛСК [14] Опухолевые клетки-предшественницы при ХМЛ измененно взаимодействуют с микроокру­жением костного мозга, и их состояние непрерывной пролиферации может происходить из-за разрегулированных функций важных молекул межклеточной ад­гезии на поверхности ЛСК [15, 16]. В работе W.A. Sands и соавт. [17] было показано, что ЛСК могут изменять нишу, секретирующую различные костимулирующие молекулы и супрессирующие цитокины, которые нацелены на метаболические пути и облегчают уход от иммунного надзора и индукцию резистентности к химиотерапевтическим препаратам. Эти цитокины включают CXCL12, фактор роста стволовых клеток 1 (stem cell factor-1, SCF-1), интерлейкин-6 (ИЛ-6), несколько факторов роста, таких как фактор роста опухоли бета (transforming growth factor beta, TGF-β), основной фактор роста фибробластов (basic fibroblast growth factor, bFGF) и фактор роста эндотелия сосу­дов (vascular endothelial growth factor, VEGF). Во время лейкогенеза злокачественные клоны постепенно стано­вятся независимыми от физиологического контроля ниши [10]. Более того, ММСК экспрессируют раз­личные факторы, участвующие в поддержании ЛСК как в хронической фазе заболевания, так и при нали­чии глубокого молекулярного ответа (ГМО) [9].

Цель работы — сравнительное изучение клеток- предшественниц стромального микроокружения ММСК и КОЕф, полученных из костного мозга боль­ных ХМЛ в дебюте заболевания, через год после нача­ла лечения и на длительных сроках лечения ИТК.

Материалы и методы

Больные и доноры костного мозга

В исследование были включены 73 больных: 18 боль­ных в дебюте ХМЛ (12 из них также были обследова­ны через год), 32 — через 3—8 лет и 23 — через 9—16 лет после начала лечения ИТК. Данные больных пред­ставлены в таблице 1.

Все больные и доноры подписали информированное согласие на забор костного мозга. Исследование было одобрено этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ гема­тологии» МЗ РФ. Образцы костного мозга получали в момент рутинных диагностических пункций костно­го мозга. Все больные после длительного лечения ИТК имели ГМО, пункции костного мозга выполнялись в связи с планируемой отменой ИТК.

Поскольку характеристики ММСК и КОЕф за­висят от возраста, в качестве контроля для ММСК и КОЕф больных в дебюте заболевания, больных через 1 и 3—8 лет после начала терапии использовали ММСК и КОЕф из костного мозга 60 здоровых до­норов (24 мужчины и 36 женщин), в возрасте от 20 до 78 лет (медиана 49 лет), для больных через 9—16 лет после начала терапии использовали ММСК и КОЕф из костного мозга 43 здоровых доноров лет (21 муж­чина, 21 женщина) в возрасте от 31 до 78 лет (медиана 50 лет).

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

ММСК выделяли из 3—5 мл костного мозга больных и здоровых доноров. Для выделения мононуклеаров костный мозг смешивали с равным объемом среды аМЕМ media (ICN), содержащей 0.2 % метилцеллюлозы (1500 cP, Sigma-Aldrich). Через 40 мин большин­ство эритроцитов и гранулоцитов оседали, в то время как мононуклеарные клетки оставались в суспензии. Затем верхнюю фракцию (суспензию) отбирали и цент­рифугировали в течение 10 мин при 450 G. Клеточный осадок ресуспендировали в стандартной среде для куль­тивирования, состоящей из среды aMEM с 10 % эмбрио­нальной телячьей сыворотки (ЭТС) Hyclone, 2 мМ L-глутамина (ICN), 100 ЕД/мл пенициллина (Ferein) и 50 мкг/мл стрептомицина (Ferein). Клетки культиви­ровали по 3 х 10⁶ клеток на флакон T25 см² (Corning- Costar). После формирования конфлюэнтного монослоя клетки отмывались 0,02 % ЭДТА (ICN) в физиологиче­ском растворе (Sigma-Aldrich), а затем обрабатывались трипсином (ICN). Клетки рассаживали по 4 х 10³ кле­ток на см² площади флакона. Культуры при 37 °C в ат­мосфере с 5 % CO₂.

ММСК были иммунофенотипированы [18] для определения поверхностных молекул [19] (рис. 1А) и получены данные по дифференцировке клеток in vitro в остеобласты и адипоциты стандартным методом [20] (рис. 1Б).

Анализ колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕф) из костного мозга

Для анализа КОЕф ядросодержащие клетки по­лученных образцов костного мозга культивирова­ли по 10⁶ и 5 х 10⁵ на флакон с площадью дна 25 см² в среде альфа-MEM с 20 % ЭТС (Hyclone, США), 2 мМ L-глутамина (ICN, США), 100 ед/мл пеницил­лина («Ферейн», Россия), 50 мкг/мл стрептомицина («Ферейн», Россия) в течение 14 дней. Подсчет колоний производили под бинокулярной лупой (Opton, Германия) после окрашивания в 1 % кристаллвиолете на 20 % метаноле.

Определение относительного уровня экспрессии генов

Определение уровня экспрессии генов проводилось методом обратной транскрипции с последующей по­лимеразной цепной реакцией в режиме реального вре­мени (модификация Taq-Man) на приборе Rotor-Gene (Corbett, Australia). Для выделения РНК был исполь­зован стандартный протокол с небольшими модифи­кациями [21]. Для построения первых цепей ДНК после гибридизации мРНК со смесью поли-Т-праймеров и случайных гексамеров использовали обрат­ную транскриптазу (M-MLV, Promega) в соответствии с рекомендациями производителя. Для нормализации образцов использовали гены «домашнего хозяйства» BACT (бета-актин) и GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа), относительный уровень экспрес­сии генов рассчитывали методом ΔΔCt: [22].

Статистический анализ. Данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего. Достоверность различий средних значений определялась с помощью критерия Манна—Уитни для распределений, отлич­ных от нормального и A-критерия Стьюдента для нор­мальных распределений (достоверными считались прир < 0,05).

Результаты

Концентрация КОЕф и ростовые характеристики ММСК

Изучили концентрацию КОЕф и ростовые характе­ристики ММСК больных ХМЛ в дебюте заболевания и в течение терапии ИТК до 16 лет. В дебюте заболевания и в самом начале лечения концентрация КОЕф в кост­ном мозге больных не отличалась от таковой у доноров (табл. 2). Через год после начала лечения концентрация КОЕф снижалась почти в 4 раза, а затем постепенно увеличивалась в группе больных, которые получали терапию более 8 лет. В этой группе больных концент­рация КОЕф в костном мозге не отличалась от концен­трации в костном мозге здоровых доноров. Суммарная продукция ММСК за 4 пассажа достоверно снижалась в 2 раза через год после начала терапии, а затем посте­пенно увеличивалась и не отличалась от таковой у до­норов. У больных в дебюте заболевания время до Р0, т.е. достижения конфлюентного монослоя после установ­ления культуры, было достоверно увеличено, что ука­зывало на уменьшение концентрации стромальных предшественников в костном мозге. Далее время до Р0 постепенно уменьшалось и после 8 лет лечения не отли­чалось от такового у доноров. Время удвоения популя­ции ММСК было в 2 раза больше в дебюте заболевания по сравнению с ММСК доноров и оставалось увеличен­ным в течение года лечения ИТК, после еще несколь­ких лет лечения оно нормализовалось и не отличалось от доноров соответственного возраста.

Анализ экспрессии генов в КОЕф и ММСК

Экспрессия многих генов изменялась в КОЕф в де­бюте заболевания. К ним относятся гены, связанные с хрящевой, жировой и костной дифференцировками (SOX9, PPARG и BGLAP, SPP1), экспрессия которых достоверно повышалась. Это означает, что КОЕф были индуцированы к дифференцировке и, скорее всего, обеспечивали взрослыми стромальными клет­ками костный мозг более интенсивно, что, в свою очередь, связано с повреждением стромального ми­кроокружения опухолевыми клетками. Экспрессия генов, связанных с пролиферацией предшественни­ков, сильно не изменялась. Экспрессия ВМР4 была значительно повышена, и достоверно отличалась от таковой у доноров.

Анализ относительного уровня экспрессии генов в ММСК больных ХМЛ показал, что в дебюте за­болевания стромальные клетки-предшественницы были активированы по сравнению с таковыми у доно­ров. Относительный уровень экспрессии генов фак­торов, регулирующих кроветворные клетки и ЛСК (IL6 и LIF), был достоверно повышен в 2,5 и 14 раз соответственно (табл. 4). По мере лечения экспрессия генов этих факторов постепенно снижалась, однако уровень экспрессии IL6 все равно оставался выше, чем у доноров. Некоторые факторы роста ММСК (FGF2, его рецепторы — FGFR1, FGFR2, рецептор фактора роста из тромбоцитов — PDGFRA) были повышены в дебюте заболевания, тогда как экспрессия фактора роста сосудистого эндотелия — VEGF, опухолевого фактора роста 1 и 2 — TGFB1 и TGFB2 не были из­менены (табл. 4). Среди изученных молекул адгезии достоверное снижение в 2 раза было отмечено только для МСАМ, остальные молекулы не были изменены. Экспрессия генов, участвующие в дифференцировке ММСК (SPP1, SOX9, PPARG), была повышена в дебю­те заболевания. Относительный уровень экспрессии PPARG оставался повышенным через год после на­чала лечения, а затем постепенно нормализовался. Экспрессия гена маркера костной дифференцировки (SPP1) постепенно повышалась по мере лечения, экспрессия маркера хрящевой (SOX9) дифференци- ровки была увеличена в дебюте заболевания и в те­чение года лечения, однако при длительном лечении ИТК достоверно снижалась в 2 раза по сравнению с таковыми у доноров. Экспрессия генов, характер­ных для ММСК (NES, JAG1 и IGF1), была повышена в дебюте заболевания и постепенно нормализовалась при длительном лечении за исключением NES, уро­вень экспрессии которого достоверно уменьшался по сравнению с таковым у доноров.

Таким образом, у больных ХМЛ профиль экспрес­сии генов изменен в дебюте заболевания и только ча­стично нормализуется даже при длительной терапии.

Анализ ММСК у больных в зависимости от достижения ГМО

При анализе ММСК у больных в дебюте заболевания в зависимости от дальнейшего достижения ими ГМО были обнаружены закономерности. У больных, не достигших ГМО в течение 4-х лет, была меньше концентрация КОЕф в костном мозге, суммарная клеточная продукция за 4 пассажа также была меньше, а время до Р0 увеличено (табл. 5). Все эти изменения не достоверны, однако прослеживалась тенденция, указывающая на более значительное повреждение стромальных клеток-предшественниц у группы больных, не достигших ГМО. В ММСК больных, достигших ГМО, относительный уровень экспрессии 3-х генов, отвечающих за регуляцию кроветворных клеток, был в 2 раза ниже, чем в ММСК больных, не достигших ГМО (табл. 5).

Таким образом, в работе выявлены существенные различия в стромальных клетках-предшественницах больных в зависимости от их ответа на лечение ИТК и достижения ГМО.

Обсуждение

Известно, что не только строма костного мозга опре­деляет кроветворение, но и качество кроветворения влияет на стромальные клетки [23, 24]. Как опухолевые клетки, так и ИТК могут оказывать влияние на строму больных ХМЛ. Было показано [25], что ММСК боль­ных ХМЛ в дебюте заболевания и в течение года ле­чения ИТК лучше поддерживают кроветворные клет­ки-предшественники, чем ММСК доноров и больных острыми лейкозами.

Целью настоящей работы было изучение стромальных клеток-предшественниц у больных ХМЛ в дебюте заболевания и по мере лечения ИТК. Известно, что стромальные и мезенхимальные клетки у этих больных не затронуты опухолевым клоном [26]. Исследование концентрации КОЕф, основных характеристик ММСК, паттерна экспрессии некоторых генов, уча­ствующих в дифференцировке стромальных клеток и поддержании кроветворения, определяют измене­ния в стромальных предшественниках. В работе пока­зано, что концентрация КОЕф и суммарная клеточная продукция ММСК не отличаются от таковых у доно­ров в дебюте заболевания. Через год после начала ле­чения концентрация КОЕф в костном мозге больных уменьшалась в 4 раза, а суммарная клеточная про­дукция ММСК уменьшалась в 2 раза, что указывает на повреждающее влияние ИТК на стромальные пред­шественники. Далее, по мере длительного лечения, концентрация КОЕф и пролиферативный потенциал ММСК восстанавливались. Вероятно, стромальные клетки постепенно адаптируются к ингибированию тирозиновых киназ. Анализ REL генов, участвующих в мезенхимальной дифференцировке КОЕф, выявил достоверное увеличение экспрессии генов-маркеров костной (BGLAP и SPP1), хрящевой (SOX9) и жировой (PPARG) дифференцировок. КОЕф больных в дебюте заболевания оказались более дифференцированными, чем у доноров. При этом в дебюте заболевания умень­шалась концентрация ММСК, что совпадает с дан­ными других авторов [27, 28]. Опухолевые клетки адаптируют ниши костного мозга и, вероятно, инду­цируют образование новых кроветворных территорий для опухолевых стволовых клеток. После длительного лечения у больных восстанавливаются количествен­ные показатели стромальных клеток-предшественниц. В ММСК больных изменен профиль экспрессии некоторых генов. В дебюте заболевания в ММСК боль­ных достоверно повышена экспрессия генов, участву­ющих в регуляции кроветворения, — IL6, LIF, CSF1, IGF1, JAG1 и SDF1; ростовых факторов для ММСК — FGF2, FGFR1, FGFR2, PDGFRA, BMP4 генов, участву­ющих в дифференцировке ММСК — SOX9, PPARG. Повышение экспрессии SDF1 — гена цитокина, отве­чающего за попадание кроветворных клеток в строму костного мозга, JAG1 — гена белка, регулирующего пролиферацию и дифференцировку стволовых кро­ветворных клеток, указывает на повышенную способ­ность ММСК поддерживать кроветворение, что под­тверждается данными об улучшении способности ММСК больных поддерживать кроветворные клетки предшественницы доноров [25]. При этом экспрессия генов молекул адгезии также связанных с хомингом СКК (MCAM и ICAM1) снижена в ММСК больных и не восстанавливается до уровня ММСК доноров по мере лечения. В работе D. Aggoune и соавт. [9] была показана повышенная экспрессия других генов, отно­сящихся к статусу «стволовости» ММСК — NANOG, FOXO3 по сравнению с ММСК доноров. К этим генам в нашей работе можно добавить LIF и IGF1. По мере ле­чения, в зависимости от его длительности, экспрессия всех этих генов уменьшалась и в некоторых случаях достигала таковой в ММСК доноров. Восстановление ростовых характеристик ММСК после длительного лечения можно объяснить частичной нормализаци­ей экспрессии FGF2, FGFR1, FGFR2, PDGFRA, BMP4 и генов, относящихся к дифференцировке, — SOX9, PPARG. Очевидно, что изменения в экспрессии генов не однозначны и затрагивают различные свойства ММСК. Суммарно можно заключить, что концен­трация КОЕф и основные характеристики ММСК восстанавливаются после многих лет терапии ИТК. Вероятно, ИТК не оказывают фатального влияние на ростовые характеристики клеток-предшественниц стромального микроокружения.

Было показано, что ЛСК и СКК по-разному регу­лируются стромальным микроокружением костного мозга [29], однако по большинству характеристик эти клетки совпадают [30]. Анализ ММСК в 2-х груп­пах больных в дебюте заболевания, достигших ГМО менее чем за 1,5 года и не достигших ГМО более чем за 4 года, выявил существенные изменения в экспрес­сии генов, участвующих в регуляции СКК. В ММСК группы больных, достигших ГМО, REL LIF был в 2 раза ниже, чем в общей группе, и в 3 раза ниже, чем в группе больных, не достигших ГМО, а REL JAG1 и TGFB1 был в 2 раза ниже. Очевидно, что ЛСК лучше поддерживаются ММСК с более высоким уровнем экс­прессии этих регуляторных генов. Такие ЛСК более успешно выживают под действием ИТК, что не дает возможности получить ГМО у этих больных.

У больных увеличение количества ЛСК связано с из­менением регуляции в сигнальном пути ВМР (кост­ного морфогенетического белка), которое сохраняет­ся у больных, резистентных к терапии ИТК [31, 32]. Сигналы BMP контролируют стволовые клетки в ни­шах. Белки семейства ВМР (BMP2 и BMP4) важны как для нормального кроветворения, так и при опухоле­вой трансформации. Факторы семейства BMP, первона­чально описанные при формировании кости, оказались связанными с биологией большого числа органов и сис­тем, от эмбриональных до взрослых тканей, и участвуют в пролиферации, дифференцировке и апоптозе стволо­вых клеток. Клетки опухолевого микроокружения — основные источники растворимых ВМР. И наоборот, ЛСК отображают измененные рецепторы и сигнальные элементы BMP [33, 34]. Показано, что ВМР 4 вовлечен в развитие резистентности к ИТК [35]. Разницы в экс­прессии ВМР2 и ВМР4 в этих двух группах больных об­наружено не было. Однако в ММСК больных в дебю­те заболевания ВМР2 достоверно ниже, чем у доноров, а ВМР4 — выше и в ММСК, и в КОЕф. Через год после начала лечения экспрессия обоих генов либо еще боль­ше снижается, либо увеличивается.

Таким образом, важность стромального микро­окружения для функционирования и сохранения ЛСК у больных ХМЛ не вызывает сомнений. Исследование стромальных клеток-предшественниц у этих больных в дебюте заболевания может иметь прогностическое значение.