АГРЕГАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ И ИХ РАЗМЕРЫ ПРИ ОЖОГОВОЙ БОЛЕЗНИ У ДЕТЕЙ

Введение

Нарушения микроциркуляции и гемостаза разви­ваются с первых часов после тяжелой термической травмы и определяют патогенез ее острых периодов [1]. Важной причиной этих нарушений является из­менение функциональных свойств тромбоцитов, пре­жде всего повышение их агрегационной способности [2]. Агрегация тромбоцитов при ожоговой болезни исследовалась, в основном, с помощью экзогенных ин­дукторов [3—5]. При этом она изучалась у взрослых больных и, главным образом, лишь в острый период ожоговой болезни. Механизмы изменения агрегации тромбоцитов при ожоговой болезни остаются недоста­точно изученными.

Степень активации тромбоцитов при ожоговой болез­ни может быть велика за счет резкого повышения содер­жания в крови агонистов агрегации. Кроме плазменных факторов определенную роль в повышении агрегационных свойств тромбоцитов могут играть изменения их морфологии, в частности изменение их среднего объема (mean platelet volume, MPV). Считается, что маленькие тромбоциты имеют более низкие функциональные воз­можности, а большие тромбоциты являются метаболи­чески и ферментативно более активными [6]. Однако вопрос о том, является ли средний объем тромбоцитов полезным маркером в оценке их функционального со­стояния при ожоговой болезни, остается открытым до настоящего времени. В литературе имеются лишь единичные сообщения об изменении спонтанной агре­гации тромбоцитов [2] и их среднего объема при тяже­лых ожогах у взрослых больных [7].

Изучение функциональных свойств тромбоцитов у больных детского возраста при ожоговой болезни не проводилось.

Цель работы — исследование спонтанной и АДФ- индуцированной агрегации тромбоцитов в зависимо­сти от их размеров при ожоговой болезни у детей

Материалы и методы

На проведение данной работы было получено раз­решение локально-этического комитета федерального государственного бюджетного учреждения высшего об­разования «Приволжский медицинский исследователь­ский университет» Минздрава России (ФГБОУ ВО ПМИУ). Информированное согласие на участие в исследовании было получено от родителей всех детей. В исследование были включены 28 больных ожогово­го центра ФГБОУ ВО ПМИУ обоих полов в возрасте от 3 до 17 лет с ожогами площадью от 10 до 70 % по­верхности тела. Проведена серия наблюдений в период лечения больных от 3 суток после термической травмы до полного закрытия ожоговых ран и выписки больного.

Согласно принятой классификации [8], выделяли следующие периоды ожоговой болезни:

• ожоговый шок — до 3 сут;
• острая ожоговая токсемия — 3—9 сут;
• септикотоксемия — с 9-х суток до полного зажив­ления ран;
• период реконвалесценции (до восстановления двига­тельных функций и возможности самообслуживания).

Полученные результаты сравнивались с соответст­вующими показателями 18 условно здоровых детей обоих полов того же возраста.

Кровь забирали на 3—8, 12-16-е сутки после травмы и после закрытия ожоговых ран (20-е сутки и более). Забор крови осуществляли утром, натощак, путем ве­непункции локтевой вены в вакуумные пробирки, со­держащие 3,8 % цитрат натрия (в соотношении 9:1) и К ЭДТА (для подсчета количества тромбоцитов и их среднего объема). Плазму, обогащенную тромбоцитами (ПОТ), получали путем центрифугирования цитратной крови в течение 7 мин при 800 об./мин. Бедную тром­боцитами плазму получали путем центрифугирования оставшейся крови в течение 20 мин при 3000 об./мин.

Спонтанную агрегацию тромбоцитов исследова­ли на реоскопе, сконструированном по принципу [9], в нашей модификации [10]. Для этого тромбоциты по­мещали между двумя плоскопараллельными пласти­нами, вращающимися навстречу друг другу, что приво­дило к спонтанной агрегации тромбоцитов в условиях искусственного сдвигового потока с видеозаписью про­цесса агрегации. ПОТ (количество тромбоцитов предварительно стандартизовали до концентрации 200—250 х 10⁹ /л помещали между двумя плоскопараллельными пластинами и создавали поток со скоростью сдвига 40 с^-1. Далее производили видеозапись процесса агрегации в течение 400 с, а также его дискретную ми­крофотосъемку с интервалом в 20 с после начала агре­гации. Компьютерную обработку полученных данных осуществляли с помощью специально разработанной программы, рассчитывающей плотность ρ (усл. ед.), площадь S (усл. ед.) и периметр П (усл. ед.) агрегатов, которые дают представление об их объеме и размере, время появления максимальных агрегатов.

Индуцированную АДФ (2 х 10^-5 М) агрегацию тром­боцитов изучали турбидиметрическим методом Born [11] на лазерном анализаторе марки 230LA-2 произ­водства НПФ «Биола» (Россия). Исследование прово­дили с использованием ПОТ (количество тромбоцитов предварительно стандартизовали до концентрации 200—250 х 10⁹/л. Процесс АДФ-индуцированной аг­регации тромбоцитов оценивали по степени (мак­симальная амплитуда агрегатограммы Ма, процент светопропускания) и скорости агрегации (амплитуда агрегатограммы через 35 с после добавления индукто­ра, процент светопропускания).

Концентрацию фибриногена определяли по методу Клаусса. Количество тромбоцитов и их MPV опре­деляли кондуктометрическим методом на гематоло­гическом анализаторе Abacus Junior 30 ND (Diatron, Hungary) в течение 1 часа после венепункции.

Статистический анализ. Полученные результаты представлены как выборочное среднее ± стандартная ошибка среднего. Количественные показатели прош­ли проверку на нормальность распределения с исполь­зованием критерия Шапиро—Уилка (пакет программ Statistica 6.0). Результаты исследования обработаны методами непараметрической статистики с примене­нием критериев Манна—Уитни и парных сравнений Уилкоксона. Для изучения взаимосвязей между из­учаемыми параметрами применяли корреляционный анализ (метод Спирмена). Различия считались стати­стически значимыми прир < 0,05.

Результаты

Скорость спонтанной агрегации тромбоцитов зна­чительно возрастала при ожоговой болезни (табл. 1). Если у здоровых детей к 40-й секунде после помещения ПОТ в условия искусственного сдвигового потока лишь в единичных случаях начинали образовываться мелкие агрегаты, то в остром периоде ожоговой болезни у всех больных в этих условиях уже образовалось большое ко­личество агрегатов, количество которых осталось повы­шенным и до конца периода токсемии (табл. 1). Кроме того, впервые регистрировали и оценивали интеграль­ную оптическую плотность образовавшихся агрегатов, их площадь и периметр, которые позволяли предста­вить их объем и размер. Значительно увеличивались эти параметры как в остром периоде ожоговой болезни, так и через 12—16 суток после травмы. Важной особен­ностью агрегации является то, что эти показатели агре­гации оставались увеличенными даже при полном за­крытии ожоговых ран, при выписке больных (табл. 2).

Изменялся при ожогах и характер спонтанной агрега­ции тромбоцитов. Если у здоровых детей образование крупных агрегатов начиналось через 206,0 ± 14,2 с, то после 3—8 дней ожога оно происходило значительно раньше — через 115,1 ± 12,4 с (р < 0,05). Даже при выпис­ке больных образование крупных агрегатов остава­лось ускоренным и наблюдалось через 160,5 ± 15,1 с (р < 0,05). Три крупных агрегата образовались лишь у 20 % здоровых детей. При ожоге у 77 % больных три крупных агрегата образовались в период от 3 до 8 дней после ожоговой травмы и у 80 % обожженных — в пе­риод от 12 до 16 суток после ожога. В эти же сроки после ожога у 61 и 41 % детей образовались 4, а у 15 % детей — до шести крупных тромбоцитарных агрегатов (рис. 1). При выписке у 37,5 % детей сохранялась спо­собность к образованию до трех крупных агрегатов, что было выше этого показателя у здоровых детей.

Изучение АДФ-индуцированной агрегации тром­боцитов показало, что ожоги вызывают разнонаправ­ленные изменения этого показателя. Скорость АДФ- индуцированной агрегации у 60 % больных во все периоды ожоговой болезни была ниже аналогичного показателя у здоровых детей, а у 45 % больных степень была выше, чем у здоровых. Статистически значимых различий между показателями АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов у здоровых детей и при ожогах не обнаружено.

Значительно изменялась при ожоговой болезни у де­тей и концентрация тромбоцитов. В раннем постшоковом периоде (третьи сутки после ожоговой травмы) концентрация тромбоцитов (248,4 ± 17,65 х 10⁹ /л) была существенно ниже (р < 0,05), чем к восьмому дню по­сле ожога. Более высокая концентрация тромбоци­тов сохранялась и к моменту выписки больных, хотя и в меньшей степени, чем в период поздней токсемии (табл. 3). Эти данные согласуются с ранее полученны­ми результатами у взрослых больных с ожоговой бо­лезнью [12].

Средний объем тромбоцитов возрастал в остром периоде ожоговой болезни и значительно снижался к 12—16-м суткам после травмы. К выписке средний объем тромбоцитов приближается к норме (табл. 3). Установлена достоверная обратная корреляция между концентрацией тромбоцитов и MPV через 3—8 суток после ожога (r = —0,39; р = 0,04).

Статистически достоверная зависимость количест­ва тромбоцитов, их среднего объема и параметров аг­регации от возраста и площади поражения больных не обнаружена. Однако это может быть связано с не­большим количеством больных в группах и требует дальнейшего исследования.

В остром периоде ожоговой болезни концентрация фибриногена значительно повышалась по сравнению со здоровыми детьми — до 6,21 ± 0,40 г/л (р < 0,05), а к 12—16 дням после ожога концентрация фибриноге­на составляла 4,51 ± 0,33 г/л (р < 0,05). При выписке концентрация фибриногена не отличалась от его уров­ня у здоровых детей и составляла 3,15 ± 0,19 г/л.

Обсуждение

В дополнение к их первичной гемостатической функ­ции тромбоциты участвуют в патогенезе воспаления, инициируя и поддерживая воспалительные процессы путем секреции и высвобождения при агрегации мно­гочисленных биологически активных веществ, таких как интерлейкин-1, фактор активации тромбоцитов, фактор тромбоцитов 4 [13]. В последнее время поя­вилось достаточное количество исследований, указы­вающих на связь объема тромбоцитов (MPV) с рядом воспалительных состояний [14—16]. Однако каким образом отражаются изменения MPV на функцио­нальных свойствах тромбоцитов, в частности на их агрегации, остается неизученным. Нами установ­лено, что уменьшение концентрации тромбоцитов и MPV в период ожоговой токсемии не сопровожда­ется снижением спонтанной агрегации тромбоцитов. Не обнаружено корреляции между концентрацией тромбоцитов, MPV и всеми исследованными показа­телями агрегации тромбоцитов при ожоговой болез­ни у детей.

Таким образом, изменения размеров, количества тромбоцитов и их агрегационной способности при ожо­говой болезни не зависят друг от друга. Можно пред­положить, что динамика концентрации тромбоцитов вызвана тем, что в период шока происходит максималь­ное потребление тромбоцитов за счет гиперкоагуляции, а в ряде случаев — диссеминированного внутрисосудистого свертывания [17, 18]. После выхода из состояния шока начинал преобладать тромбоцитоз, что соответ­ствует литературным данным [12, 19, 20]. В этот пери­од уменьшается MPV. Известно, что уменьшение MPV происходит при ряде воспалительных процессов и мо­жет быть маркером их активности [21, 22].

Механизмы, регулирующие объем тромбоци­тов, остаются в значительной степени неясными. Уменьшенный объем тромбоцитов в период ожоговой токсемии может быть связан с тем, что большие акти­вированные тромбоциты потребляются в первую оче­редь [23]. Кроме того, уменьшение MPV может проис­ходить за счет микровезикуляции, которая возникает при ожоговой болезни [24, 25]. Согласно литератур­ным данным [26], множественные микровезикулы (МВ) в крови имеют тромбоцитарное происхожде­ние. Высвобождение МВ не только сопровождается уменьшением MPV. Сами МВ играют важную роль в патогенезе различных заболеваний, особенно сопро­вождающихся риском тромботических осложнений и воспалительных состояний [27, 28].

Таким образом, усиление спонтанной агрегации тромбоцитов при ожоговой болезни у детей не связа­но с изменением MPV. Наиболее важным фактором гиперагрегации тромбоцитов является гиперфибрино- генемия [2]. По нашим данным, концентрация фибри­ногена значительно повышена в острый период ожого­вой болезни. При выписке концентрация фибриногена в среднем не отличается от этого показателя у здоро­вых детей. Однако корреляции между концентрацией фибриногена и показателями агрегации тромбоцитов при ожоговой болезни у детей не обнаружено. Это сви­детельствует о том, что в механизме гиперагрегации тромбоцитов важную роль играет наличие в крови ожоговых больных большого количества индукторов агрегации.

Важную роль в агрегации тромбоцитов при ожоговой болезни может играть тромбинемия. При этом спон­танная агрегация тромбоцитов осуществляется за счет взаимодействия рецепторов тромбоцитов GPIb с тром­бином, который, имея два центра связывания, может служить мостиком между тромбоцитами [29, 30].

Таким образом, при наличии в плазме крови ожого­вых больных большого количества индукторов агрега­ции тромбоцитов, прежде всего тромбина, активными (высокоаффинными) становятся многие рецепторы, в том числе PAR1 и PAR4. Активация рецепторов сти­мулирует передачу сигнала внутрь клетки, что ведет к активации фосфолипазы С, мобилизации Ca²+, акти­вации протеинкиназы С и, как следствие, к активации интегринов и агрегации тромбоцитов [31, 32]. При тер­мической травме это, вероятнее всего, и происходит.

Для проверки этого положения проведены следую­щие исследования [33]. Кровь стабилизировали эти- лендиаминтетрауксусной кислотой (4,8 мкмоль/л), блокируя тем самым один из конечных путей актива­ции тромбоцитов — увеличение концентрации вну­триклеточного Ca²+. При этом спонтанная агрегация донорских тромбоцитов полностью предотвращалась. В этих условиях агрегация тромбоцитов ожоговых больных снижалась, но полностью не блокировалась.

Это подтверждало наличие большого количества ак­тивированных тромбоцитов в крови больных ожого­вой болезнью (рис. 1).

В основе механизма агрегации тромбоцитов лежит взаимодействие GPIIb/IIIa со своими лигандами. Однако при ожоговой болезни значительный вклад в этот процесс вносят и иные пути активации и агре­гации тромбоцитов, осуществляемые при непосредст­венном участии других рецепторов и лигандов [34].

Таким образом, при ожоговой болезни у детей про­исходило значительное увеличение скорости, степени и характера спонтанной агрегации тромбоцитов, сохра­нявшейся повышенной и к периоду выписки больных. При ожоговой болезни у детей выявлены разнонаправ­ленные изменения АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов, статистически не отличающиеся от ана­логичных показателей у здоровых детей. При ожоговой болезни у детей не обнаружено зависимости повышен­ной агрегации тромбоцитов от их измененного средне­го объема (MPV) и развивающейся гиперфибриногене- мии. В крови больных ожоговой болезнью обнаружено большое количество активированных тромбоцитов.