Preview

Гематология и трансфузиология

Расширенный поиск

МЕТАЛЛОПРОТЕАЗА ADAMTS-13

https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-471-482

Полный текст:

Аннотация

Ведение. Значение открытия металлопротеазы ADAMTS-13 выходит за рамки представления о ее ключевой роли в патогенезе тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТП), имеются данные о наличии связи между снижением активности ADAMTS-13 и тромботическими событиями при остром инфаркте миокарда и ишемическом инсульте.

Цель обзора — обобщение современной информации о структуре и функции металлопротеазы ADAMTS-13.

Основные сведения. Биологической функцией протеазы ADAMTS-13  является расщепление сверхкрупных мультимеров фактора Виллебранда. Основой для понимания функции расщепляющей фактор Виллебранда протеазы явилась демонстрация того, что дефицит ее является причиной развития ТТП. ADAMTS-13 имеет доменную структуру. Установлено функциональное значение большинства доменов ADAMTS-13, ключевая роль взаимодействия ADAMTS-13 и WF в регуляции гемостаза. Конформационная активация протеазы ADAMTS-13  фактором Виллебранда является важным аспектом реализации ее функции. После попадания в кровоток сверхкрупные мультимеры фактора Виллебранда быстро принимают закрытую конформацию, которая становится очень устойчивой к протеолизу ADAMTS-13 при отсутствии напряжения сдвига. Плазменные сверхкрупные мультимеры фактора Виллебранда восстанавливает свою чувствительность к ADAMTS-13 при воздействии высокого напряжения сдвига жидкости, которое разворачивает центральный домен А2 фактора Виллебранда. Развертывание молекулы фактора Виллебранда под воздействием напряжения сдвига открывают в домене А2  ранее скрытые экзосайты, которые постепенно увеличивают сродство связывания между ADAMTS-13  и фактором Виллебранда. Механизм выработки аутоантител против ADAMTS-13 неизвестен и требует дальнейшего изучения. Маскировка криптических эпитопов в  замкнутой конформации ADAMTS-13  предотвращает образование аутоантител. Раннее антигенное распознавание ADAMTS-13 происходит через поверхностные обнаженные эпитопы в С-концевых доменах. Более подробная информация о механизмах взаимодействия между ADAMTS-13 и фактором Виллебранда может улучшить понимание механизмов регуляции свертывающей системы.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование: исследование не имело спонсорской поддержки.

Для цитирования:


Колосков А.В., Мангушло А.А. МЕТАЛЛОПРОТЕАЗА ADAMTS-13. Гематология и трансфузиология. 2019;64(4):471–482. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-471-482

For citation:


Koloskov A.V., Mangushlo A.A. METALLOPROTEASE ADAMTS-13. Russian journal of hematology and transfusiology. 2019;64(4):471–482. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-471-482

Введение

Все большее количество клинических и эксперимен­тальных исследований свидетельствуют о существен­ной роли металлопротеазы ADAMTS-13 (a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin-1-like domains, member 13) не только в патогенезе тромботической тромбоцитопенической пурпуры, но и при сердечно-сосудистых заболеваниях. Расширение знаний о металлопротеазе ADAMTS-13 может улучшить наше понимание патогене­за этих заболеваний, механизмов регуляции свертываю­щей системы крови в целом, а также предложить новые решения для улучшения результатов лечения.

Целью данного обзора является обобщение совре­менной информации о структуре и функции металло- протеазы ADAMTS-13.

Металлопротеазы ADAMTS-13

Пионерские исследования, выполненные в 1996 г., обнаружили взаимодействующую с фактором Виллебранда плазменную протеазу. Было установле­но, что функциональная активность данной протеазы зависит от ионов Zn2+ и Ca2+, присутствие которых было необходимым для расщепления фактора Виллебранда при исследованиях in vitro. Было показано, что воз­действие металлопротеазы приводит к расщеплению мультимеров фактора Виллебранда в специфическом сайте (Tyr1605-Met1606) в домене А2 и уменьшению гемостатической функции фактора Виллебранда in vivo [1, 2]. Металлопротеаза ADAMTS-13 была идентифи­цирована и клонирована в 2001 г. [3, 4].

Биологической функцией металлопротеазы ADAMTS-13 является расщепление сверхкруп- ных мультимеров фактора Виллебранда [5]. Фактор Виллебранда представляет собой большой и гетероген­ный адгезивный гликопротеин — один из ключевых белков свертывающей системы крови [6]. Он синтези­руется в эндотелиальных клетках и мегакариоцитах в виде мономера, подвергаясь дальнейшей димеризации в эндоплазматическом ретикулуме через С-концевую дисульфидную связь [7]. Мультимеризация проис­ходит в аппарате Гольджи в результате образования пропептид-индуцированной дисульфидной связи [8]. Гетерогенный фактор Виллебранда и сверхкрупные мультимеры фактора Виллебранда депонируют­ся в тельцах Вейбеля—Паладе, из которых они могут выделяться конститутивно и при необходимости [9]. Сверхкрупные мультимеры фактора Виллебранда по­тенциально тромбогенны, поскольку способны спон­танно взаимодействовать с тромбоцитами, образуя сгустки, блокирующие систему микроциркуляции [10].

Металлопротеаза ADAMTS-13 синтезируется в основном в печени. Концентрация ADAMTS-13 в плазме человека колеблется от 0,7 до 1,4 мкг/мл. Матричная РНК, кодирующая полноразмерный протеин ADAMTS-13 (примерно 4,3 kb), обнаружи­вается в печени с помощью нозерн-блоттинга [3, 4]. Усеченная форма матричной РНК ADAMTS-13 (при­мерно 2,4 kb) при использовании той же методики обнаруживается в других тканях, таких как плацен­та и скелетные мышцы [4]. Используя обратную по­лимеразную цепную реакцию, фрагменты матричной РНК ADAMTS-13 выявляются во многих тканях, включая почки, поджелудочную железу, селезенку, тимус, предстательную железу, яички, яичники, тон­кую кишку, толстую кишку и лейкоциты перифериче­ской крови [3, 11]. В печени ADAMTS-13 локализует­ся в звездчатых клетках [12]. Содержание матричной РНК ADAMTS-13 и экспрессия белка ADAMTS-13 в звездчатых клетка крыс in vitro и in vivo резко повыша­ется при механическом воздействии или под влиянием трансформирующего ростового фактора β [13], что ука­зывает на возможную роль ADAMTS-13 в ремоделиро­вании ткани печени после травмы. Кроме того, белок ADAMTS-13, продуцируемый в звездчатых клетках, может диффундировать в капилляры и поступать в кровоток, определяя тем самым плазменную актив­ность ADAMTS-13. В пользу этого механизма свиде­тельствуют такие факты, как уменьшение плазменной активности ADAMTS-13 у людей после частичной ге- патэктомии [14] или у крыс после введения диметилнитрозамина, повреждающего звездчатые клетки [15], и повышение активности ADAMTS-13 в звездчатых клетках и плазме в моделях холестаза и стеатогепатита у крыс [16]. Матричная РНК ADAMTS-13 и белок ADAMTS-13 также были обнаружены в эндотелиаль­ных клетках сосудов как in vitro, так и in vivo [17, 18].

Показано [18], что нестимулированные эндотели­альные клетки вены пуповины человека продуцируют в культуре приблизительно 1 нг ADAMTS-13 на 1 мл кон­диционированной среды каждые 60 минут. Количество ADAMTS-13 примерно в 100 раз меньше, чем количе­ство фактора Виллебранда (100 нг/мл), производимого этими клетками в тех же условиях. При использовании иммуногистохимического метода было продемонстри­ровано, что ADAMTS-13 не накапливается совместно с фактором Виллебранда в тельцах Вейбеля—Паладе и, по-видимому, секретируется в циркуляцию непосред­ственно из места синтеза [17, 18].

Функция металлопротеазы ADAMTS-13, синтези­рованной в эндотелии, не вполне понятна. В то время как эндотелиальные клетки синтезируют следовые ко­личества ADAMTS-13 в культуре, суммарная площадь эндотелиальной выстилки предполагает потенциально существенный вклад ADAMTS-13, имеющего эндоте­лиальное происхождение, в величину плазменной ак­тивности ADAMTS-13. Кроме того, металлопротеаза ADAMTS-13, высвобождаемая из эндотелиальных клеток, может расщеплять сверхкрупные мультимеры фактора Виллебранда, фиксированного на поверхно­сти клеток, обеспечивая дополнительный механизм поддержания поверхности, свободной от фактора Виллебранда [18].

В зависимости от клеточного окружения металло- протеаза ADAMTS-13 может обладать как проангио- генным, так и антиангиогенным эффектом. В исследо­вании М. Lee и соавт. [19] были получены результаты, свидетельствующие о том, что, с одной стороны, обра­ботка эндотелиальных клеток вены пуповины челове­ка рекомбинантной ADAMTS-13 приводит к значи­тельному образованию капилляроподобных структур и клеточной миграции, что указывает на усиленный ангиогенез. С другой стороны, когда в культураль­ной среде присутствовал фактор роста эндотелия со­судов, металлопротеаза ADAMTS-13 ингибировала активность, индуцированную этим фактором. Этот антиангиогенный эффект можно предотвратить пред­варительной инкубацией ADAMTS-13 с моноклональ­ными антителами, направленными против С-концевого локуса TSP1 повторов 5—7 [19], что указывает на роль повторов TSP1 в опосредовании про- и антиангиогенных эффектов. Небольшое количество матричной РНК ADAMTS-13 обнаруживается в мегакариоцитах и тромбоцитах человека [20]. Биологическая функция ADAMTS-13, полученной из тромбоцитов, остается неизвестной. В исследовании М. Suzuki и соавт. [21] установлено, что трансгенная, сверхэкспрессированная ADAMTS-13 в тромбоцитах ADAMTS13–/– мы­шей может высвобождаться после активации тром­бином и коллагеном, а также при формировании тромба после повреждения 10 %-ным хлоридом желе­за. Секретируемая человеческая ADAMTS-13 способ­на замедлять процесс образования тромба в брыжееч­ных артериолах после окислительного повреждения и защищает ADAMTS13–/– мышей от тромбогенного эфф екта фактора Виллебранда и индуцированного Шига-токсином тромбообразования. Данные резуль­таты свидетельствуют о том, что ADAMTS-13, синте­зируемая в тромбоцитах, может иметь биологически важную функцию [21].

ADAMTS-13 имеет доменную структуру, включаю­щую сигнальный пептид, пропептид, металлопроте- азный домен, дизинтегрин-подобный домен, первый повтор тромбоспондина первого типа, богатый цистеи- ном, и спейсерный домены. Более дистальный С-конец содержит семь дополнительных повторов тромбоспондина первого типа и два CUB-домена [5].

Основой для понимания функции металлопротеа- зы, расщепляющей фактор Виллебранда, стал уста­новленный факт, что дефицит ее приводит к развитию тромботической тромбоцитопенической пурпуры [22]. За последние 15 лет была установлена функциональ­ная роль большинства доменов ADAMTS-13, а также выяснена ключевая роль взаимодействия ADAMTS-13 и фактора Виллебранда в регуляции гемостаза [23].

Металлопротеазный домен ADAMTS-13 сам по себе не имеет или обладает малой протеолитиче- ской активностью в отношении фактора Виллебранда. Металлопротеазный и дизинтегрин-подобный домены, по-видимому, являются единой функциональной еди­ницей [24—27]. Экспериментальные данные также сви­детельствуют, что добавление дизинтегрин-подобного домена к металлопротеазному домену значительно уве­личивает способность ADAMTS-13 расщеплять фактор Виллебранда [24, 26]. Металлопротеаза ADAMTS-13, лишенная дизинтегрин-подобного домена [24—26] или имеющая точечные мутации в вариабельных об­ластях дизинтегрин-подобного домена (Arg349Ala и Leu350Gly), обладает резко сниженной протеолити- ческой активностью по отношению к пептиду и муль­тимеру фактора Виллебранда, что указывает на важ­ность дизинтегрин-подобного домена в распознавании субстрата. Остатки Arg349 и Leu350 дизинтегрин-по­добного домена ADAMTS-13 могут взаимодействовать с остатками Asp1614 и Ala1612 в центральном домене А2 фактора Виллебранда. Такое взаимодействие, по- видимому, помогает позиционировать связь Tyr1605— Met1606 для расщепления, тем самым заметно влияя на константу скорости и каталитическую эффектив­ность субстратного протеолиза [26].

Большое внимание уделяется значению богатого цистеином и спейсерного доменов ADAMTS-13 в распознавании специфического субстрата [24, 27]. Варианты ADAMTS-13, у которой отсутству­ют как богатый цистеином, так и спейсерный до­мен или только спейсерный домен, практически не обладают активностью по отношению к связан­ным с клеткой сверхкрупным мультимерам фак­тора Виллебранда и циркулирующему фактору Виллебранда [24].

Протеолитическое расщепление пептидного суб­страта увеличивается благодаря взаимодействию некаталитических доменов с доменом А2 (между остатками Asp1614 и Arg1668) фактора Виллебранда [25, 26].

Протеазы семейства ADAMTS имеют пере­менное количество повторов тромбоспондина первого типа (Thrombospondin 1 — TSP1), кото­рые могут играть роль в клеточной локализации и распознавании субстрата. Первый повтор TSP1 ADAMTS-13 связывается непосредственно с реги­оном, состоящим из 73 аминокислотных остатков от D1596 до R1668 фактора Виллебранда, обознача­емым как VWF73 [24]. Повторы 5—8 TSP1 протеазы ADAMTS-13 связываются с фактором Виллебранда через его домен D4 [28]. Показано, что С-концевые повторы TSP1 ADAMTS-13 взаимодействуют с поверхностным рецептором CD36 эндотелиаль­ных клеток [29]. Такое взаимодействие может усили­вать протеолитическое расщепление сверхкрупных мультимеров фактора Виллебранда в месте его выс­вобождения при воздействии силы, возникающих при движении (течении) крови (обозначается тер­мином «воздействие силы сдвига жидкости») [30]. Повторы TSP1 ADAMTS-13 содержат свободные тиолы, которые могут реагировать со свободными тиолами на поверхности сверхкрупных мультиме­ров фактора Виллебранда или плазменного факто­ра Виллебранда, подвергнутых воздействию силы сдвига жидкости. Такое взаимодействие может препятствовать образованию дисульфидных связей между двумя мультимерами фактора Виллебранда в условиях высоких силы сдвига жидкости, ослабляя тем самым фактор Виллебранд-опосредованную ад­гезию и агрегацию тромбоцитов [5, 23]. С другой стороны, представлены данные о том, что у человека и мышей металлопротеаза ADAMTS-13, не содержа­щая С-концевых повторов 2—8 TSP1 и доменов CUB, расщепляет связанные с клеткой сверхкрупные мультимеры фактора Виллебранда и плазменный фактор Виллебранда с такой же эффективностью, как и полноразмерный белок ADAMTS-13 [31, 32]. Для более точного понимания биологической роли повторов TSP1 металлопротеазы ADAMTS-13 необ­ходимы дальнейшие исследования.

Домены CUB уникальны для ADAMTS-13 и не найдены в других металлопротеазах семейст­ва ADAMTS и ADAM-протеазах [33]. Роль доменов CUB металлопротеазы ADAMTS-13 в полной мере неясна. Рекомбинантные CUB-1 и CUB-1+2 домены или синтетические пептиды, полученные из домена CUB-1 ADAMTS-13, частично блокируют протеолитическое расщепление сверхкрупных мультимеров фактора Виллебранда, связанного с эндотелиальными клетками в условиях воздействия силы сдвига жидко­сти. Это позволило предположить, что домены CUB ADAMTS-13 могут взаимодействовать с сверхкрупными мультимерами фактора Виллебранда, фиксиро­ванными на поверхности эндотелиальных клеток [34]. В пользу данной гипотезой свидетельствует тот факт, что молекула ADAMTS-13, у которой отсутствуют до­мены CUB, не способна к расщеплению сверхкрупных мультимеров фактора Виллебранда с фиксированны­ми на нем тромбоцитами в брыжеечных артериолах ADAMTS13–/– мышей [35]. В то же время имеются со­общения о том, что ADAMTS-13 человека, лишенная доменов CUB, расщепляет свежие нити сверхкруп- ных мультимеров фактора Виллебранда в отсутст­вие силы сдвига жидкости [36] и нити сверхкрупных мультимеров фактора Виллебранда, декорированные тромбоцитами и фиксированные к культивируемым эндотелиальным клеткам пупочной вены человека в условиях потока [32]. Эти противоречивые резуль­таты свидетельствуют о сложности оценки функции ADAMTS-13 в физиологических условиях.

Металлопротеаза ADAMTS-13 секретируется как конститутивная активная протеаза [18, 37]. В насто­ящее время ее ингибитор не обнаружен. Плазменный а2-макроглобулин ингибирует многие другие ма­тричные металлопротеазы, включая ADAMTS-4, -5, -7 и -12, но, по-видимому, не связывается и не влияет на активность ADAMTS-13 по отношению к факто­ру Виллебранда, что позволило высказать предполо­жение о регуляции функции ADAMTS-13 на уровне субстрата [5]. Свежесинтезированные сверхкрупные мультимеры фактора Виллебранда, закрепленные на мембране эндотелиальных клеток, могут быть рас­щеплены ADAMTS-13 в присутствии [38] или в отсут­ствие действия силы сдвига жидкости [36]. Это ука­зывает на то, что сверхкрупные мультимеры фактора Виллебранда, связанные с эндотелиальными клетка­ми, находятся в открытой конформации [5]. После попадания в кровоток сверхкрупные мультимеры фактора Виллебранда быстро принимают закрытую конформацию, которая становится очень устойчивой к протеолизу ADAMTS-13 при отсутствии действия силы сдвига жидкости или воздействия денатуратов. Плазменные ультракрупные мультимеры фактора Виллебранда восстанавливают свою чувствительность к ADAMTS-13 при воздействии силы сдвига жидкости (приблизительно 20—100 дин/см2), которое, как пред­полагают, разворачивает центральный домен А2 фак­тора Виллебранда. При этом взаимодействие между фактором Виллебранда и ADAMTS-13 при воздейст­вии силы сдвига жидкости является высокоаффинным [39]. Такая сила сдвига жидкости встречается in vivo в суженных или разветвляющихся сосудах, артериях, артериолах и системе микроциркуляции. Сила сдвига жидкости возрастает по мере нарастания стеноза аор­ты, что приводит к увеличению протеолиза фактора Виллебранда под воздействием ADAMTS-13 [40, 41]. Хирургическая коррекция стеноза снижает скорость сдвига жидкости и тем самым уменьшает чувстви­тельность фактора Виллебранда к воздействию метал- лопротеазы ADAMTS-13, что приводит к нормализа­ции соотношения мультимеров фактора Виллебранда в плазме [5, 42].

Воздействие силы сдвига жидкости, характерное для артериального кровотока, может быть смоде­лировано in vitro с использованием конической пла­стины вискозиметра [43], мини-вортекса [28, 39] и микрожидкостной системы [44], генерирующих ламинарный поток. При воздействии силы сдвига жидкости в модели in vitro протеолитическое расще­пление мультимерного фактора Виллебранда металлопротеазой ADAMTS-13 увеличивается по мере нарастания скорости сдвига жидкости [39]. Также в модели in vitro отмечено расщепление изолирован­ного A1A2A3-тридомена фактора Виллебранда [45] и домена А2 фактора Виллебранда под воздействием силы сдвига жидкости [46]. Суммарно эти данные сви­детельствуют о том, что сила сдвига жидкости играет решающую роль в регулировании протеолитического расщепления фактора Виллебранда металлопротеазой ADAMTS-13 [5].

Коагуляционный фактор VIII, который обладает вы­соким сродством к фактору Виллебранда, может ока­зывать воздействие на доменные области A1A2A3 и ре­гулировать протеолитическое расщепление А2 домена фактора Виллебранда металлопротеазой ADAMTS-13. Эффект усиления протеолиза фактора Виллебранда в присутствии фактора VIII был обнаружен только при воздействии силы сдвига жидкости. Это объяс­няется тем, что связывание фактора VIII с фактором Виллебранда может облегчать конформационное раз­вертывание домена A2 в при воздействии силы сдвига жидкости. При нормандском варианте (2N) болезни Виллебранда, характеризующемся тяжелым дефектом связывания фактора VIII с фактором Виллебранда, имеет место дефект расщепления фактора Виллебранда протеазой ADAMTS-13 в присутствии фактора VIII. Имеющиеся наблюдения свидетельствуют о роли фак­тора VIII как физиологического кофактора, регулиру­ющего расщепление фактора Виллебранда протеазой ADAMTS-13. Данная кофакторная активность зави­сит от взаимодействия между легкой цепью фактора VIII и доменов D'D3 фактора Виллебранда [5, 43].

Тромбоцитарный гликопротеин GP1bα обла­дает свойством связывать фактор Виллебранда. Исследования показали, что добавление фиксирован­ных формалином, лиофилизированных или свежих тромбоцитов и растворимого GP1ba к мультимер ному фактору Виллебранда увеличивает его протеолитическое расщепление металлопротеазой ADAMTS-13 вне зависимости от действия силы сдвига жидкости [43, 47]. Ристоцетин, антибиотик, который связыва­ет домен А1 фактора Виллебранда рядом с сайтом, связывающим GP1ba, также улучшает расщепление мультимерного фактора Виллебранда металлопротеазой ADAMTS-13. Эти результаты свидетельст­вуют, что взаимодействие между тромбоцитарным GP1bα (или ристоцитином) и А1 доменом влияет на доступность А2 домена для действия ADAMTS-13. Ристоцетин уменьшает потребность в факторе VIII для расщепления фактора Виллебранда металлопротеазой ADAMTS-13. Связывание тромбоцитарного GP1ba с фактором Виллебранда усиливает кофакторный эффект фактора VIII [43]. Эти результаты свиде­тельствуют, что фактор VIII и тромбоцитарный глико­протеин GP1ba обладают синергическими эффектами для усиления расщепления фактора Виллебранда металлопротеазой ADAMTS-13 под воздействием силы сдвига жидкости [5].

Конформационная активация металлопротеазы ADAMTS-13 фактором Виллебранда является важным аспектом реализации ее функции. Пониманию функ­ции ADAMTS-13 в значительной степени способство­вало изучение усеченных мутантов, приготовленных из конструкций с постепенным удалением фрагментов, начиная с С-конца. Первоначально было установлено, что расщепление короткого субстрата VWF73 уве­личивалось примерно в четыре раза при усечении полноразмерной металлопротеазы ADAMTS-13 (FL ADAMTS-13) до варианта MDTCS [25]. Это позволи­ло предположить, что дистальные домены, содержащие повторы тромбоспондина и CUB-домены, могут инги­бировать активность молекулы, что было подтверждено в дальнейших исследованиях [23].

При исследовании активности металлопротеазы ADAMTS-13 в зависимости от pH было обнаружено, что FL ADAMTS-13, но не MDTCS, обладает наи­большей активностью при pH 6. Кроме того, моно­клональные антитела, направленные к С-концевым доменам ADAMTS-13, могут повысить ее активность только при pH 6. Это позволяет предположить аутоингибиторную роль С-концевых доменов при физи­ологическом уровне pH. К тому же, помимо сниже­ния pH и наличия активирующих моноклональных антител, аутоингибирование усиливается в присут­ствии домена D4 фактора Виллебранда [48]. Также при изучении аллостерических характеристик металлопротеазы ADAMTS-13 и ее усеченных вариантов было высказано предположение, что металлопротеаза ADAMTS-13 может находиться в компактной и рас­ширенной конфигурации [48].

При анализе металлопротеазы ADAMTS-13 с усилен­ной функциональной активностью (GoF-ADAMTS-13) с вариантным спейсерным доменом, которая обладает повышенной протеолитической активностью по срав­нению с металлопротеазой ADAMTS-13 дикого типа (WT-ADAMTS-13), было показано, что связывание фактора Виллебранда с WT-ADAMTS-13 приводи­ло к разворачиванию и функциональной актива­ции WT-ADAMTS-13 [49]. В исследовании K.South и соавт. [50] установлено, что GoF-ADAMTS-13 протеаза находится в предварительно активированном состоянии и не может быть дополнительно активи­рована фактором Виллебранда D4-CK. Также уста­новлено прямое связывание между спейсерным доме­ном N-концевого фрагмента ADAMTS-13, MDTCS и CUB1-2 доменными фрагментами, в связи с чем этими исследователями было высказано предположение, что подобное взаимодействие поддерживает замкнутую конформацию ADAMTS-13 и нарушается в варианте GoF-ADAMTS-13. Ряд антигенных детер­минант GoF-ADAMTS-13 устроены таким образом, что распознавались антителами, вызывающими при­обретенную тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТП). По-видимому, эти антигенные де­терминанты обычно маскируются связыванием CUB- доменов со спейсерным доменом у WT-ADAMTS-13 и обнаруживаются только при конформационой ак­тивации. Анализ методом электронной микроскопии подтвердил, что WT-ADAMTS-13 находится в ком­пактной, глобулярной конформации, которая частич­но разворачивается в варианте GoF-ADAMTS-13 [50].

Активация ADAMTS-13 фактором Виллебранда D4-CK подчеркивает важную роль С-концевых до­менов фактора Виллебранда в его протеолитической обработке. Был идентифицирован сайт связывания ADAMTS-13 в факторе Виллебранда D4-CK, локали­зованный главным образом в домене D4, который спо­собствует сближению двух белков в отсутствие конформационной активации фактора Виллебранда [28]. Продемонстрирована обратимая ассоциация металло- протеазы ADAMTS-13 с фактором Виллебранда, находящимся в закрытой конформации [51]. Высказано предположение, что такое связывание этих бел­ков обеспечивает успешное расщепление фактора Виллебранда при переходе его в открытую конформа­цию под воздействием силы сдвига жидкости. В свете представленных данных, демонстрирующих конфор- мационную активацию ADAMTS-13, реакцию свя­зывания можно рассматривать также как побужда­ющую стадию активации протеазы ADAMTS-13 для подготовки ее экзосайтного взаимодействия с доменом А2 фактора Виллебранда, открывающимся при разво­рачивании фактора Виллебранда при воздействии сил сдвига [23].

Н.В. Feys и соавт. [51] высказали предположение, что в циркуляции только 3 % ADAMTS-13 связаны фактором Виллебранда в конформационно-активной форме. При тромботических и воспалительных со­стояниях, вследствие которых фактор Виллебранда высвобождается из телец Вейбеля—Палладе активи­рованного эндотелия или фиксируется к обнаженному субэндотелию, доля конформационно-активной про- теазы ADAMTS-13 может быть значительно выше.

При изучении конформационной активации металлопротеазы ADAMTS-13 была установлена гибкость дистальных доменов TSP2—CUB2, которые способст­вовали структурной трансформации, необходимой для изменения формы белка во время процесса акти­вации от компактной к более вытянутой [52].

Идиопатическая ТТП у взрослых обусловлена главным образом тяжелым дефицитом активности ADAMTS-13 вследствие воздействия на нее антител класса IgG. Ингибирующие антитела обнаруживают­ся у 44—100 % больных приобретенной ТТП с тяжелым дефицитом активности плазменной ADAMTS-13 [53]. При использовании высокочувствительных методов ис­следования, такой как иммуноферментный анализ [53], или проточной цитометрии [54] анти-ADAMTS-13 ан­титела класса IgG выявляются у всех больных ТТП, у которых имеется выраженный дефицит активности плазменной ADAMTS-13 [53]. Картирование и про­филирование антител показало, что у больных ТТП в плазме преобладают анти-ADAMTS-13 подклассов IgG1 и IgG4 [55] и почти все анти-ADAMTS-13 класса IgG связываются с богатым цистеином и спейсерным доменами, особенно со спейсерным доменом [56—58]. Другие домены ADAMTS-13, включая пропептид, металлопротеазный, дизинтегриновый, первый повтор TSP1, более дистальные повторы TSP1 и домены CUB, менее реакционноспособны с аутоантителами [56, 58]. Дальнейший анализ позволил установить, что основные антигенные эпитопы локализованы в остатках Tyr572- Asn579 [59], Val657-Gly666 [57, 59] и Gly662-Val687 [60]. У 90 % больных ТТП отмечается потеря чувствитель­ности к аутоантителам анти-ADAMTS-13 после заме­щения в структуре экзосайтного 3-спейсерного домена остатков Arg568, Phe592, Arg660, Tyr661 и Tyr665 [58]. Эти остатки играют критическую роль в распознавании субстрата и протеолизе фактора Виллебранда [57, 61]. Следовательно, можно предположить, что фиксация ау­тоантител анти-ADAMTS-13 в этом регионе блокирует связывание металлопротеазы с фактором Виллебранда и нарушает ее протеолитическую функцию.

Механизм выработки аутоантител против металло- протеазы ADAMTS-13 неизвестен и требует дальней­шего изучения. Преобладание среди больных женщин [56] и изучение аутоантител анти-ADAMTS-13 у сестер-близнецов [62] позволяют предположить нали­чие генетической предрасположенности [5]. Выявлена повышенная частота встречаемости аллеля HLA- DRB1*11 у больных с приобретенной ТТП, что согла­суется с данной гипотезой [63].

Маскировка скрытых (криптических) эпитопов в замкнутой конформации ADAMTS-13 может пре­дотвратить образование аутоантител. Компактная структура плазменной ADAMTS-13 может объяснить низкую иммуногенность ADAMTS-13, вводимой со свежезамороженной плазмой, для восполнения дефи­цита этой металлопротеазы больным врожденной фор­мой ТТП. Конформационные изменения, приводящие к открытию криптические эпитопов, лежат в основе продукции антител. Повышенное содержание фактора Виллебранда в плазме во время беременности или ин­фекции, которые являются клиническими триггерами приобретенной ТТП, может привести к субстрат-индуцированной активации ADAMTS-13 с последую­щим иммуногенным эффектом. Было продемонстри­ровано, что CD4+-T- клетки у больных приобретенной ТТП были реактогенны по отношению к пептидам домена CUB2 металлопротеазы ADAMTS-13 [64]. В другом исследовании [52] были идентифицированы многочисленные антитела, нацеленные на С-концевые домены металлопротеазы ADAMTS-13, которые по­вышают ее активность до уровня, указывающего на конформационную активацию. Высказано пред­положение [65], что раннее антигенное распозна­вание ADAMTS-13 происходит через поверхност­ные обнаженные эпитопы в С-концевых доменах. Потенциальный активирующий эффект этих антител может привести к дальнейшему контакту с эпитопами N-концевого домена и наработке ингибирующей попу­ляции аутоантител. Подобный сценарий с выработкой анти-ADAMTS-13 IgG-аутоантител может реализовы­ваться у здоровых людей, и появление низкоаффин­ных, неингибирующих антител, некоторые из которых были нацелены на С-концевые домены металлопротеазы ADAMTS-13, может предшествовать процессу ги­пермутации В-клеток памяти, необходимой для гене­рации высокоаффинных антител.

Сегодня изучению структуры и функциональ­ной роли металлопротеазы ADAMTS-13 как одного из ключевых белков-регуляторов свертывающей си­стемы крови уделяется значительное внимание раз­личными исследовательскими группами, и следует ожидать в ближайшее время появления новой инфор­мации, расширяющей представления не только о дан­ном белке, но и о системе гемостаза в целом.

Список литературы

1. Furlan M., Robles R., Lammle B. Partial purifi cation and characterization of a protease from human plasma cleaving von Willebrand factor to fragments produced by in vivo proteolysis. Blood. 1996; 87: 4223–34.

2. Tsai H.M. Physiologic cleavage of von Willebrand factor by a plasma protease is dependent on its conformation and requires calcium ion. Blood. 1996; 87: 4235–44.

3. Levy G.G., Nichols W.C., Lian E.C. et al. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature. 2001; 413: 488–94. DOI: 10.1038/35097008

4. Zheng X.L., Chung D., Takayama T, Majerus E. et al. Structure of von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13), a metalloprotease involved in thrombotic thrombocytopenic purpura. J. Biol. Chem. 2001; 276: 41059–63. DOI: 10.1074/ jbc.C100515200

5. Zheng X.L. Structure-function and regulation of ADAMTS-13 protease. J. Thromb Haemost. 2013; 11(Suppl. 1): 11–23. DOI: 10.1111/jth.12221

6. Чернова Е.В. Фактор Виллебранда. Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова. 2018; 10(4): 73–80. DOI: 10.17816/mechnikov201810473-80

7. Marti T., Rosselet S.J., Titani K., Walsh K.A. Identifi cation of disulfi de-bridged substructures within human von Willebrand factor. Biochemistry. 1987; 26: 8099– 109. DOI: 10.1021/bi00399a013

8. Wise R.J., Pittman D.D., Handin R.I. et al. The propeptide of von Willebrand factor independently mediates the assembly of von Willebrand multimers. Cell. 1988; 52: 229–36.

9. Wagner D.D., Saffaripour S., Bonfanti R. et al. Induction of specifi c storage organelles by von Willebrand factor propolypeptide. Cell. 1991; 64: 403–13.

10. Moake J.L., Rudy C.K., Troll J.H. et al. Unusually large plasma factor VIII: von Willebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. N. Engl. J. Med. 1982; 307: 1432–5.

11. Plaimauer B., Zimmermann K., Volkel D. et al. Cloning, expression, and functional characterization of the von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13). Blood. 2002; 100: 3626–32. DOI: 10.1182/blood-2002-05-1397

12. Uemura M., Tatsumi K., Matsumoto M. et al. Localization of ADAMTS13 to the stellate cells of human liver. Blood. 2005; 106: 922–4. DOI: 10.1182/ blood-2005-01-0152

13. Niiya M., Uemura M., Zheng X.W. et al. Increased ADAMTS13 proteolytic activity in rat hepatic stellate cells upon activation in vitro and in vivo. J. Thromb Haemost. 2006; 4:1063–70. DOI: 10.1111/j.1538-7836.2006.01893.x

14. Okano E., Ko S., Kanehiro H, Matsumoto M. et al. ADAMTS13 activity decreases after hepatectomy, refl ecting a postoperative liver dysfunction. Hepatogastroenterology. 2010; 57: 316–20.

15. Kume Y., Ikeda H., Inoue M. et al. Hepatic stellate cell damage may lead to decreased plasma ADAMTS13 activity in rats. FEBS Lett. 2007; 58: 1631–4. DOI: 10.1016/j.febslet.2007.03.029

16. Watanabe N., Ikeda H., Kume Y. et al. Increased production of ADAMTS13 in hepatic stellate cells contributes to enhanced plasma ADAMTS13 activity in rat models of cholestasis and steatohepatitis. Thromb Haemost. 2009; 102: 389–96. DOI: 10.1160/TH08-11-0732

17. Turner N., Nolasco L., Tao Z. Human endothelial cells synthesize and release ADAMTS-13. J Thromb Haemost. 2006; 4: 1396–404. DOI: 10.1111/j.1538- 7836.2006.01959.x

18. Turner N.A., Nolasco L., Ruggeri Z.M., Moake J.L. Endothelial cell ADAMTS-13 and VWF: production, release, and VWF string cleavage. Blood. 2009; 114: 5102–11. DOI: 10.1182/blood-2009-07-231597

19. Lee M., Rodansky E.S., Smith J.K., Rodgers G.M. ADAMTS13 promotes angiogenesis and modulates VEGF-induced angiogenesis. Microvasc Res. 2012; 84: 109–15. DOI: 10.1016/j.mvr.2012.05.004

20. Liu L., Choi H., Bernardo A. et al. Platelet-derived VWF-cleaving metalloprotease ADAMTS-13. J. Thromb Haemost. 2005; 3: 2536–44. DOI: 10.1111/j.1538- 7836.2005.01561.x

21. Suzuki M., Murata M., Matsubara Y. et al. Detection of von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS-13) in human platelets. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 313: 212–16. DOI: 10.1016/j.bbrc.2003.11.111

22. Gardner M.D., Chion C.K., de Groot R. et al. A functional calcium-binding site in the metalloprotease domain of ADAMTS13. Blood. 2009; 113: 1149–57. DOI: 10.1182/blood-2008-03-144683

23. South K., Lane D.A. ADAMTS-13 and von Willebrand factor: a dynamic duo. J. Thromb Haemost. 2018; 16: 6–18. DOI: 10.1111/jth.13898

24. Ai J., Smith P., Wang S. et al. The proximal carboxyl-terminal domains of ADAMTS13 determine substrate specifi city and are all required for cleavage of von Willebrand factor. J. Biol. Chem. 2005; 280: 29428–34. DOI: 10.1074/jbc.M505513200

25. Gao W., Anderson P.J., Sadler J.E. Extensive contacts between ADAMTS13 exosites and von Willebrand factor domain A2 contribute to substrate specifi city. Blood. 2008; 112: 1713–9. DOI: 10.1182/blood-2008-04-148759

26. de Groot R., Bardhan A., Ramroop N. et al. Essential role of the disintegrin-like domain in ADAMTS13 function. Blood. 2009; 113: 5609–16. DOI: 10.1182/ blood-2008-11-187914

27. Gao W., Anderson P.J., Majerus E.M. et al. Exosite interactions contribute to tension-induced cleavage of von Willebrand factor by the antithrombotic ADAMTS13 metalloprotease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103: 19099–104. DOI: 10.1073/pnas.0607264104

28. Zanardelli S., Chion A.C., Groot E. et al. A novel binding site for ADAMTS13 constitutively exposed on the surface of globular VWF. Blood. 2009; 114: 2819–28. DOI: 10.1182/blood-2009-05-224915

29. Asch A.S., Tepler J., Silbiger S., Nachman R.L. Cellular attachment to thrombospondin. Cooperative interactions between receptor systems. J. Biol. Chem. 1991; 266: 1740–5.

30. Vomund A.N., Majerus E.M. ADAMTS13 bound to endothelial cells exhibits enhanced cleavage of von Willebrand factor. J. Biol. Chem. 2009; 284: 30925– 32. DOI: 10.1074/jbc.M109.000927

31. Yeh H.C., Zhou Z., Choi H. et al. Disulfi de bond reduction of von Willebrand factor by ADAMTS-13. J. Thromb Haemost. 2010; 8: 2778–88. DOI: 10.1111/j.1538-7836.2010.04094.x

32. Tao Z., Wang Y., Choi H. et al. Cleavage of ultralarge multimers of von Willebrand factor by C-terminal-truncated mutants of ADAMTS-13 under fl ow. Blood. 2005; 106: 141–3. DOI: 10.1182/blood-2004-11-4188

33. Tang B.L. ADAMTS: a novel family of extracellular matrix proteases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2001; 33: 33–44.

34. Tao Z., Peng Y., Nolasco L. et al. Recombinant CUB-1 domain polypeptide inhibits the cleavage of ULVWF strings by ADAMTS13 under fl ow conditions. Blood. 2005; 106: 4139–45. DOI: 10.1182/blood-2005-05-2029

35. de Maeyer B., de Meyer S.F., Feys H.B. et al. The distal carboxyterminal domains of murine ADAMTS13 infl uence proteolysis of platelet-decorated VWF strings in vivo. J. Thromb Haemost. 2010; 8: 2305–12. DOI: 10.1111/j.1538- 7836.2010.04008.x

36. Xiao J., Jin S.Y., Xue J. et al. Essential domains of a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 repeats-13 metalloprotease required for modulation of arterial thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc. Biol. 2011; 31: 2261–9. DOI: 10.1161/ATVBAHA.111.229609

37. Zhou W., Inada M., Lee T.P. et al. ADAMTS13 is expressed in hepatic stellate cells. Lab Invest. 2005; 85: 780–8. DOI: 10.1038/labinvest.3700275

38. Dong J.F. Cleavage of ultra-large von Willebrand factor by ADAMTS-13 under fl ow conditions. J. Thromb Haemost. 2005; 3: 1710–6. DOI: 10.1111/j.1538- 7836.2005.01360.x

39. Zhang P., Pan W., Rux A.H. et al. The cooperative activity between the carboxyl-terminal TSP-1 repeats and the CUB domains of ADAMTS13 is crucial for recognition of von Willebrand factor under fl ow. Blood. 2007; 110: 1887–94. DOI: 10.1182/blood-2007-04-083329

40. Pareti F.I., Lattuada A., Bressi C. et al. Proteolysis of von Willebrand factor and shear stress-induced platelet aggregation in patients with aortic valve stenosis. Circulation. 2000; 102: 1290–5.

41. Blackshear J.L., Wysokinska E.M., Safford R.E. et al. Indexes of von Willebrand Factor as Biomarkers of Aortic Stenosis Severity (from the Biomarkers of Aortic Stenosis Severity [BASS] Study). Am. J. Cardiol. 2013; 111: 374–81. DOI: 10.1016/j. amjcard.2012.10.015

42. Yoshida K., Tobe S., Kawata M. Acquired von Willebrand disease type IIA in patients with aortic valve stenosis. Ann. Thorac. Surg. 2006; 81: 1114–6. DOI: 10.1016/j.athoracsur.2005.01.023

43. Skipwith C.G., Cao W., Zheng X.L. Factor VIII and platelets synergistically accelerate cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13 under fl uid shear stress. J. Biol. Chem. 2010; 285: 28596–603. DOI: 10.1074/jbc.M110.131227

44. Li M., Ku D.N., Forest C.R. Microfl uidic system for simultaneous optical measurement of platelet aggregation at multiple shear rates in whole blood. Lab. Chip. 2012; 12: 1355–62. DOI: 10.1039/c2lc21145a

45. Wu T., Lin J., Cruz M.A. et al. Force-induced cleavage of single VWFA1A2A3 tridomains by ADAMTS-13. Blood. 2010; 115: 370–8. DOI: 10.1182/ blood-2009-03-210369

46. Zhang Q., Zhou Y.F., Zhang C.Z. et al. Structural specializations of A2, a force-sensing domain in the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106: 9226–31. DOI: 10.1073/pnas.0903679106

47. Nishio K., Anderson P.J., Zheng X.L., Sadler J.E. Binding of platelet glycoprotein Ibalpha to von Willebrand factor domain A1 stimulates the cleavage of the adjacent domain A2 by ADAMTS13. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004; 101: 10578–83. DOI: 10.1073/pnas.0402041101

48. Muia J., Zhu J., Gupta G. et al. Allosteric activation of ADAMTS13 by von Willebrand factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014; 111: 18584–9. DOI: 10.1073/ pnas.1413282112

49. Jian C., Xiao J., Gong L. et al. Gain-of-function ADAMTS13 variants that are resistant to autoantibodies against ADAMTS13 in patients with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 2012; 119: 3836–43. DOI: 10.1182/blood-2011-12-399501

50. South K., Luken B.M., Crawley J.T. et al. Conformational activation of ADAMTS13. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014; 111: 18578–83. DOI: 10.1073/ pnas.1411979112

51. Feys H.B., Anderson P.J., Vanhoorelbeke K. et al. Multi-step binding of ADAMTS-13 to von Willebrand factor. J Thromb Haemost. 2009; 7: 2088–95. DOI: 10.1111/j.1538-7836.2009.03620.x

52. Deforche L., Roose E., Vandenbulcke A. et al. Linker regions and fl exibility around the metalloprotease domain account for conformational activation of ADAMTS-13. J. Thromb Haemost. 2015; 13: 2063–75. DOI: 10.1111/jth.1314

53. Tsai H.M., Raoufi M., Zhou W. et al. ADAMTS13-binding IgG are present in patients with thrombotic thrombocytopenic purpura. J. Thromb Haemost. 2006; 95: 886–92.

54. Li D., Xiao J., Paessler M., Zheng X.L. Novel recombinant glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ADAMTS13 and variants for assessment of anti-AD AMTS13 autoantibodies in patients with thrombotic thrombocytopenic purpura. J. Thromb Haemost. 2011; 106: 947–58. DOI: 10.1160/TH11-05-0337

55. Ferrari S., Mudde G.C., Rieger M. et al. IgG subclass distribution of antiADAMTS13 antibodies in patients with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura. J. Thromb Haemost. 2009; 7: 1703–10. DOI: 10.1111/j.1538- 7836.2009.03568.x

56. Zheng X.L., Wu H.M., Shang D. et al. Multiple domains of ADAMTS13 are targeted by autoantibodies against ADAMTS13 in patients with acquired idiopathic thrombotic thrombocytopenic purpura. Haematologica. 2010; 95: 1555–62. DOI: 10.3324/haematol.2009.019299

57. Pos W., Crawley J.T., Fijnheer R. et al. An autoantibody epitope comprising residues R660, Y661, and Y665 in the ADAMTS13 spacer domain identifi es a binding site for the A2 domain of VWF. Blood. 2010; 115: 1640–9. DOI: 10.1182/blood-2009-06-229203

58. Pos W., Sorvillo N., Fijnheer R. et al. Residues Arg568 and Phe592 contribute to an antigenic surface for anti-ADAMTS13 antibodies in the spacer domain. Haematologica. 2011; 96: 1670–7. DOI: 10.3324/haematol.2010.036327

59. Luken B.M., Turenhout E.A., Kaijen P.H. et al. Amino acid regions 572–579 and 657–666 of the spacer domain of ADAMTS13 provide a common antigenic core required for binding of antibodies in patients with acquired TTP. J. Thromb Haemost. 2006; 96: 295–301. DOI: 10.1160/TH06-03-0135

60. Yamaguchi Y., Moriki T., Igari A. et al. Epitope analysis of autoantibodies to ADAMTS13 in patients with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura. Thromb Res. 2011; 128: 169–73. DOI: 10.1016/j.thromres.2011.03.010

61. Jin S.Y., Skipwith C.G., Zheng XL. Amino acid residues Arg (659), Arg(660), and Tyr(661) in the spacer domain of ADAMTS13 are critical for cleavage of von Willebrand factor. Blood. 2010; 115: 2300–10. DOI: 10.1182/ blood-2009-07-235101

62. Studt J.D., Kremer Hovinga J.A. et al. Familial acquired thrombotic thrombocytopenic purpura: ADAMTS-13 inhibitory autoantibodies in identical twins. Blood. 2004; 103: 4195–7. DOI: 10.1182/blood-2003-11-3888

63. Scully M., Brown J., Patel R. et al. Human leukocyte antigen association in idiopathic thrombotic thrombocytopenic purpura: evidence for an immunogenetic link. J. Thromb Haemost. 2010; 8: 257–62. DOI: 10.1111/j.1538-7836.2009.03692.x

64. Verbij F.C., Turksma A.W., de Heij F. et al. CD4+ T cells from patients with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura recognize CUB2 domain-derived peptides. Blood. 2016; 127: 1606–9. DOI: 10.1182/blood-2015-10-668053

65. Grillberger R., Casina V.C., Turecek P.L. et al. Anti-ADAMTS13 IgG autoantibodies present in healthy individuals share linear epitopes with those in patients with thrombotic thrombocytopenic purpura. Haematologica. 2014; 99: e58–60. DOI: 10.3324/haematol.2013.100685


Об авторах

А. В. Колосков
ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Колосков Андрей Викторович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гематологии и трансфузиологии 

тел.: +7 (812) 948-09-17



А. А. Мангушло
ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Мангушло Александр Александрович, аспирант кафедры гематологии и трансфузиологии 

тел.: +7 (812) 948-09-17



Для цитирования:


Колосков А.В., Мангушло А.А. МЕТАЛЛОПРОТЕАЗА ADAMTS-13. Гематология и трансфузиология. 2019;64(4):471–482. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-471-482

For citation:


Koloskov A.V., Mangushlo A.A. METALLOPROTEASE ADAMTS-13. Russian journal of hematology and transfusiology. 2019;64(4):471–482. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-471-482

Просмотров: 800


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0234-5730 (Print)
ISSN 2411-3042 (Online)