Preview

Гематология и трансфузиология

Расширенный поиск

Особенности иммуногематологических и гематологических показателей крови донора с редким фенотипом -D-

https://doi.org/10.35754/02345730-2020-65-1-52-60

Полный текст:

Аннотация

Введение. Настоящее исследование посвящено редкому варианту фенотипа -D-. Впервые фенотип -D- обнаружили R. Race, R. Sanger и J. G. Selwyn в 1951 г. В России фенотип -D- был впервые обнаружен Мороковым в 1985 г. Обычно фенотип -D- обнаруживают при анализе причин посттрансфузионных осложнений или гемолитической болезни новорожденных, так как у таких больных выявляется высокий титр антител к отсутствующим антигенам. В настоящем исследовании фенотип -D- был выявлен в клинической лаборатории ГУЗ «Ульяновская областная станция переливания крови» у первичного донора крови.

Цель — изучить особенности иммуногематологических и гематологических показателей крови донора с редким фенотипом -D-.

Материалы и методы. Выявление фенотипа -D- иммуногематологическими методами проводилось с помощью автоматических анализаторов. Для подтверждения фенотипа -D- использовалось молекулярное типирование ДНК. Форма эритроцитов донора с фенотипом -D- оценивалась с помощью атомно-силового микроскопа, характеристики эритроидного ростка изучались с помощью автоматического гематологического анализатора. Результаты. Фенотип -D- был выявлен у первичного донора крови. Из-за крайней редкости фенотипа -D- и вследствие отсутствия запрограммированного алгоритма валидация результатов автоматическими анализаторами проходила некорректно. Решающее значение играла визуальная оценка гелевых ID-карт персоналом. Генотипирование подтвердило отсутствие специфичностей C, c, E, e, Cw гена RHCE. Гематологические показатели донора находились в пределах возрастной нормы. Оценка изображения цитологического препарата крови донора не выявила изменений формы эритроцитов и их размера.

Заключение. Первичное определение фенотипа -D- с помощью автоматических иммуногематологических анализаторов может осложняться невозможностью валидации результатов, некорректной работой их программного обеспечения и необходимостью экспертной оценки проб крови персоналом. Рассматриваемый случай фенотипа -D- не сопряжен с изменениями формы эритроцитов и гематологических показателей крови.

Ключевые слова


Для цитирования:


Ламзин И.М., Соколова М.Н., Хайруллин Р.М., Минеева Н.В., Хапман М.Э. Особенности иммуногематологических и гематологических показателей крови донора с редким фенотипом -D-. Гематология и трансфузиология. 2020;65(1):52-60. https://doi.org/10.35754/02345730-2020-65-1-52-60

For citation:


Lamzin I.M., Sokolova M.N., Khayrullin R.M., Mineeva N.V., Khapman M.E. Features of immunohematological and hematological parameters of a donor with a rare phenotype -D-. Russian journal of hematology and transfusiology. 2020;65(1):52-60. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/02345730-2020-65-1-52-60

Введение

В настоящее время учреждения службы крови на ос­новании существующих нормативных документов проводят определение антигенов эритроцитов, в том числе и антигенов системы Rh, у всех доноров РФ [1]. При использовании обозначения фенотип -D- имеют­ся в виду следующие типированные специфичности: D+, C-, c-, E-, е. Обычно фенотип -D- обнаруживают при выявлении причин посттрансфузионных ослож­нений или гемолитической болезни новорожденных, так как у таких больных выявляется высокий титр ан­тител к отсутствующим антигенам [2]. В настоящем исследовании фенотип -D- был выявлен в клиниче­ской лаборатории ГУЗ «Ульяновская областная стан­ция переливания крови» у первичного донора крови, а в последующем у его родного брата.

Впервые фенотип -D- обнаружили R. Race, R. Sanger и J.G. Selwyn в 1951 г. [3]. В России фенотип -D- был впервые обнаружен В. А. Мороковым в 1985 г. и иссле­дован Т. М. Пискуновой и соавт. [4] при разборе клини­ческого случая привычного невынашивания беремен­ности женщины, также проживавшей на территории Ульяновской области. Для уточнения фенотипа было проведено молекулярное типирование ДНК исследу­емого донора крови и его ближайших родственников. Кроме иммуногематологического выявления феноти­па и его генетического подтверждения были изучены некоторые показатели крови исследуемых лиц. Был проведен общий анализ крови с помощью автоматиче­ского гематологического анализатора для уточнения состояния эритроидного ростка. Для оценки формы эритроцитов в настоящей работе был применен атом­но-силовой микроскоп, который ранее уже использо­вался для исследования качества эритроцитов донор­ской крови, заготовленной на базе ГУЗ «Ульяновская областная станция переливания крови» [5].

Цель — изучить особенности иммуногематологических и гематологических показателей крови донора с редким фенотипом -D-.

Материалы и методы

Исследование выполнено в ГУЗ «Ульяновская област­ная станция переливания крови» в соответствии с тре­бованиями этических норм и принципов Декларации Хельсинки (1964 г.) со всеми последующими измене­ниями и дополнениями, а также действующего зако­нодательства РФ. Все первичные документальные дан­ные исследованных образцов крови были обезличены в соответствии с требованиями п. 3 ст. 6 действующего Федерального закона РФ 152-ФЗ «О персональных данных».

Для иммуногематологического исследования доно­ра крови и его ближайших родственников (мать, отец, брат) был проведен сбор четырех образцов крови в ва­куумные пробирки Vacuette с КДДТА фирмы Greiner-Bio-One (Австрия). Исследования на наличие антигенов AB0 и антигенов системы Rh (D, С, с, Е, е) проводились двумя методами. Первый метод — агглютинация эри­троцитов в геле на иммуногематологическом анали­заторе HEMOS SP компании Bio Rad (США). Выбор метода был обусловлен тем, что принцип гелевого ме­тода позволяет с высокой степенью достоверности трак­товать полученный результат при визуальной оценке. Второй метод — магнитизация эритроцитов на автома­тизированном иммуногематологическом анализаторе QWALYS компании Diagast (Франция). Принцип ме­тода магнитизации эритроцитов основан на использо­вании магнитных частиц в процессе подготовки образ­цов крови для исследований, которые абсорбируются на эритроцитах. Под действием магнитного поля эри­троциты с абсорбированными магнитными частицами перемещаются в дно лунки и вступают в реакцию с су­хим реагентом (агглютинация) [6].

Для подтверждения фенотипа было проведено моле­кулярное типирование ДНК [7]. Исследование прово­дилось в лаборатории изосерологии ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России. Для анализа использовали лейкоцитар­ную ДНК, которую выделяли с помощью набора ДНК- сорб-В («Амплипрайм») из образцов крови, отобран­ных в вакуумные пробирки Vacuette с КДДТА фирмы Greiner-Bio-One (Австрия). Типирование проводили с помощью анализатора FluoVista. Молекулярная си­стема детекции FluoVista основана на методе полиме­разной цепной реакции (ПЦР) с аллель-специфическими праймерами SSP и флуоресцентной детекцией «по конечной точке» производства компании Inno-train Diagnostik GmbH (Германия). Детекцию флуоресцен­ции до и после проведения ПЦР осуществляли с по­мощью термоциклера С1000 Touch компании Bio Rad (США).

Для оценки состояния эритроидного ростка иссле­дуемых лиц с фенотипом -D- был проведен общий анализ крови с помощью автоматического гематологи­ческого анализатора Sysmex 1000i (Япония). Образцы капиллярной крови, полученные путем прокола ска­рификатором кожи дистальной фаланги пальца, от­бирали в микропробирки фирмы Sarstedt-Microvttte® 200 К3 Е (Германия). Далее микропробирки устанав­ливали в специальные разъемы анализатора.

Исследование формы поверхности эритроци­тов и их размера проводили с помощью атомно-си­лового микроскопа на базе лаборатории Научно­исследовательского технологического института ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный универ­ситет» Минобрнауки РФ. Атомно-силововая мик­роскопия — метод, основанный на измерении положения микрозонда, движущегося по поверхности образца, и обработке этой информации с помощью специальной компьютерной программы с построени­ем изображения [8]. Для исследования образцов крови с помощью атомно-силового микроскопа готовили ци­тологические препараты: каплю капиллярной крови, полученную путем прокола скарификатором кожи ди­стальной фаланги пальца, наносили на чистое обезжи­ренное предметное стекло и равномерно распределяли краем пластикового шпателя. Препарат фиксировали методом высушивания на воздухе в течение 20 минут при комнатной температуре. Возможность сканиро­вания с помощью атомно-силового микроскопа цитологических препаратов эритроцитов с фиксацией методом высушивания на открытом воздухе и полу­чением корректных результатов приводится в работе M. Takeuchi и соавт. [9], при этом авторами отмечали, что высушивание эритроцитов практически не изме­няло их форму. В данной работе использовали атомно­силовой микроскоп фирмы NT-MDT (Россия), модель Solver P47-Pro. Для создания изображений образцов применяли резонансный метод с генерируемой часто­той 300 kHz. Сканируемая площадь образцов состав­ляла 120 х 120 мкм. С помощью программы NOVA строили изображения поверхности препаратов. Далее на компьютерных моделях сканированных препаратов оценивали форму эритроцитов и их размер [10].

Результаты

Первоначальная диагностика антигенной структуры эритроцитов проводилась с помощью иммуногематологических методов. На рисунке 1 представлен прото­кол исследования, полученный с помощью автомати­зированного иммуногематологического анализатора QWALYS, на котором можно увидеть, что в образцах крови пробанда и его брата (образцы C и D) отсут­ствуют антигены С, с, Е, е и К. При этом анализа­тор при валидации проведенного фенотипирования крови донора с отсутствующими антигенами систе­мы Rh в графе «Результат» выводит ******* (рис. 1). Аппарат корректно интерпретировал фенотипы мате­ри и отца, содержащие антигены системы Rh (образцы А и В). Предположительно это произошло из-за того, что вследствие исключительной редкости фенотипа -D- в программное обеспечение не был заложен алго­ритм интерпретации подобного результата. При про­ведении исследования с использованием иммуногематологического анализатора Hemos SP обнаружили похожую проблему валидации результатов. Фенотипы пробанда и его брата были расценены программой как ошибочные, и протокол зафиксировать не удалось. Для демонстрации фенотипа образца крови пробанда приводилось изображение гелевой ID-карты компа­нии Bio Rad (рис. 2). Результаты, полученные при ис­следовании образцов крови с помощью иммуногематологических методов, представлены в таблице 1.

Рисунок 1. Изображение протокола исследования образцов крови пробанда и его родственников, полученного с помощью автоматического иммуногематологического анализаторе

Figure 1. The protocol of the study of blood samples from the proband and his relatives using an automatic immunohematological analyser

Рисунок 2. Изображение гелевой ID-карты донора с фенотипом делеций

Figure 2. The gel  ID-card of the donor with the deletion phenotype

Таблица 1. Антигены эритроцитов пробанда и его родственников

Table 1. Red blood cells antigens of the proband and his relatives

Результаты, полученные с помощью молекулярного типирования ДНК, подтвердили отсутствие специ­фичностей C, c, E, e, Cw гена RHCE у пробанда и его брата. Ген RHD при этом в обоих случаях присутство­вал. Типирование родителей полностью подтвердило фенотипы, выявленные иммуногематологическими методами. К сожалению, техническая возможность поиска всего разнообразия вероятных аллелей гена RHCE в рамках этого исследования отсутствовала. На рисунке 3 приведена фотография протокола молекулярного типирования ДНК пробанда с помощью на­боров фирмы Inno-train Diagnostik GmbH (Германия). Исходя из теории сцепленного двухгенного наследова­ния и учитывая то, что дети, вероятно, имеют гаплотип -D- в гомозиготном состоянии, можно предположить, что родители имеют гаплотип -D- в гетерозиготном состоянии [11]. Генотип исследованных в настоящей работе лиц можно представить следующим образом: отец: CDe/-D- или Cdef-D-; мать: cde/-D- или cDe/-D-; про­банд и его брат: -D-/-D-.

Рисунок 3. Изображение протокола молекулярного типирования ДНК донора с фенотипом делеций

Figure 3. Molecular DNA typing protocol of the donor with the deletion phenotype

Для оценки состояния эритроидного ростка было проведено исследование образцов крови с помощью автоматического гематологического анализатора. Результаты стандартных гематологических показате­лей приведены в таблице 2. У исследуемых лиц с фе­нотипом -D- не выявлено отклонений показателей, характеризующих состояние эритроцитов: количество эритроцитов, концентрация гемоглобина, гематокрит, средний объем эритроцитов, среднее содержание ге­моглобина в эритроците и его концентрация, стандарт­ное отклонение и коэффициент вариации распределе­ния популяции эритроцитов по величине находились в пределах возрастной нормы. Изображения цитологи­ческих препаратов крови пробанда и его брата, полу­ченные с помощью атомно-силового микроскопа, под­твердили отсутствие изменений формы эритроцитов и их размера (рис. 4 и 5). Большинство эритроцитов имели двояковогнутую форму и типичный для этого типа клеток размер 7—9 мкм. Для сравнения приведено контрольное изображение цитологического препарата донора крови с фенотипом D+ С+ с— Е+ е- (рис. 6).

Таблица 2. Гематологические показатели крови пробанда и его брата

Table 2. Hematological blood indicators of the proband and his brother

 

RBC

(1012/l)

HGB

(g/l)

HCT

(%)

MCV

(fl)

MCH

(pg)

MCHC

(g/l)

RDW-SD (fl)

RDW-CV (%)

Пробанд

(Proband)

5,45

155

44,4

81,5

28,4

349

39,0

13,4

Брат

(Brother)

5,29

154

42,7

80,7

29,1

361

40,8

14,0

Рисунок 4. Изображение цитологического препарата крови пробанда, получен­ное с помощью атомно-силового микроскопа

Figure 4. An atomic force microscope image of a cytological blood preparation from the proband

Рисунок 5. Изображение цитологического препарата крови брата пробанда, полученное с помощью атомно-силового микроскопа

Figure 5. An atomic force microscope image of a cytological blood preparation from the proband's brother

Рисунок 6. Изображение цитологического препарата крови донора с феноти­пом D+ С+ с- Е+ е-, полученное с помощью атомно-силового микроскопа

Figure 6. An atomic force microscope image of a cytological blood preparation from a donor with the phenotype D+ С+ с- Е+ е-

Обсуждение

В настоящей работе продемонстрированы особенно­сти выявления фенотипа -D- с помощью современного оборудования и интерпретации полученных результа­тов специализированным программным обеспечением. Несмотря на укомплектованность современных центров крови и лечебных учреждений соответствующими ана­лизаторами, квалификация и опыт персонала могут сыг­рать решающую роль в принятии решений в нетипичных ситуациях. В случаях ошибок, выявляемых в работе ав­томатической аппаратуры иммуногематологических ла­бораторий, необходимо производить визуальную оценку гелевых ID-карт и анализ полученных результатов.

Учитывая редкость выявления фенотипа -D-, пред­ставлялось интересным проанализировать этиологию его возникновения. По данным R. Race и R. Sanger [12ф у большинства выявленных лиц с фенотипом -D- родители состояли в родстве. При подробном сборе анамнеза у родителей пробанда выявлено, что их близ­кие родственники проживают на территории неболь­шого населенного пункта Ульяновской области, в ко­тором они познакомились и создали семью. Принимая во внимание тот факт, что традиционно представители национальности, к которой принадлежат оба родите­ля, вступают в брак предпочтительно с представите­лями той же национальности, предположение о даль­нем родстве родителей исследуемых лиц полностью исключить невозможно. Это может объяснять наличие у обоих родителей редкого гаплотипа -D-.

Антигены системы Rh являются структурными ча­стями мембраны эритроцитов и принимают участие в обменных процессах, а их полное отсутствие, так называемый фенотип Rhni , сопровождается измене­нием формы эритроцитов и склонностью к гемолизу [13]. Проведенные исследования образцов крови с по­мощью автоматического гематологического анализа­тора и атомно-силового микроскопа не выявили из­менений эритроидного ростка и формы эритроцитов. Отсутствие патологии мембраны эритроцитов в рас­сматриваемом случае, вероятно, связано с наличием других специфичностей системы Rh.

Наличие редкого фенотипа -D- сопровождается опасностью выработки высокого титра антиэритроцитарных аллоантител к отсутствующим антигенам C, с, E, e, Cw при трансфузии донорских эритроцитов [14].

В связи с этим для исключения потенциальной им­мунизации исследуемым лицам было рекомендовано проведение процедуры аутодонорства с последующим замораживанием эритроцитов. Этот метод позволяет хранить эритроциты в течение нескольких лет и осу­ществлять аутотрансфузию в случае возникновения показаний.

Таким образом, первичное определение фенотипа -D- с помощью автоматических иммуногематологических анализаторов может осложняться невоз­можностью валидации результатов, некорректной работой их программного обеспечения и необходи­мостью экспертной оценки проб крови персоналом. Рассматриваемый случай фенотипа -D- не сопряжен с изменениями формы эритроцитов и гематологиче­ских показателей крови.

Список литературы

1. Постановление Правительство Российской Федерации от 22 июня 2019 г. № 797 «Об утверждении правил заготовки, хранения, транспортировки и клинического использования донорской крови и ее компонентов».

2. Донсков С.И., Мороков В.А. Группы крови человека: Руководство по иммуносерологии. М.: ИП Скороходов В.А., 2011. 243 с.

3. Race R., Sanger R., Selwyn J.G. A possible deletion in a human Rh chromosome: a serological and genetical study. Brit. J. Exp. Path. 1951; 32: 124–35.

4. Пискунова Т.М., Мороков В.А., Шамшина Н.М., Тананов А.Т., Зотиков Е.А. Редкий генотип системы Резус Rh (-D-/-D). Гематология и трансфузиология. 1988; 34(10): 45–47.

5. Lamzin I, Khayrullin R. The quality assessment of stored red blood cells probed using atomic force microscopy. Anat Res Int. 2014; 869683. DOI:10.1155/2014/869683.

6. Минеева Н.В., Бутина Е.В. Иммуногематологическое обследование доноров крови и (или) ее компонентов и реципиентов: Методологические указания. СПб., 2017. 45 с.

7. Каландаров Р.С., Головкина Л.Л., Васильева М.Н. и др. Генотипирование групп крови систем АВО и резус у пациентов после множественных гемотрансфузий. Онкогематология. 2017; 12(2): 70–9. DOI: 10.17650/18188346-2017-12-2-70-79.

8. Горшкова Е., Плескова С., Михеева Э. Атомно-силовая микроскопия клеток крови человека. Наноиндустрия. 2012; 34(4): 50–3.

9. Takeuchi M, Miyamoto H, Sako Y. et al. Structure of the erythrocyte membrane skeleton as observed by atomic force microscopy. Biophys J. 1998; 74(5): 2171–83.

10. Ламзин И.М., Хайруллин Р.М., Хапман М.Э. Оценка структуры популяции эритроцитсодержащих сред, находящихся на хранении в банке крови, по данным атомно-силовой микроскопии. Вестник современной клинической медицины. 2014; (7): 16–20.

11. Tippett P. Rh Blood group system: genes 1,2 or 3? Biotest Bulletin. 1997; 5: 393–8.

12. Race R., Sanger R. Blood Groups in Man. 6-th ed. Blackwell scientific publications. 1975. 659 p.

13. Cartron, J.P. RH blood group system and molecular basis of Rh-deficiency. Best Pract Res Clin Haematol. 1999; 12(4): 655–89. DOI: 10.1053/beha.1999.0047.

14. Оловникова Н.И., Николаева Т.Л., Митерев Г.Ю. Иммуногематологическое обследование больных перед трансфузией донорских эритроцитов: пути оптимизации и улучшения качества тестирования. Справочник заведующего КДЛ. 2014; (6): 34–6.


Об авторах

И. М. Ламзин
ГУЗ «Ульяновская областная станция переливания крови»
Россия

Ламзин Иван Михайлович – кандидат медицинских наук, заведующий отделением заготовки крови и ее компонентов.

432017, Ульяновск



М. Н. Соколова
ГУЗ «Ульяновская областная станция переливания крови»
Россия

Соколова Марина Николаевна – врач клинической лабораторной диагностики высшей категории, заведующая клинической лабораторией.

432017, Ульяновск



Р. М. Хайруллин
ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный университет»
Россия

Хайруллин Радик Магзинурович – доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой анатомии человека.

432017, Ульяновск



Н. В. Минеева
ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства»
Россия

Минеева Наталья Витальевна – доктор биологических наук, профессор, руководитель лаборатории изосерологии.

191024, Санкт-Петербург



М. Э. Хапман
ГУЗ «Ульяновская областная станция переливания крови»
Россия

Хапман Марат Эрикович – кандидат медицинских наук, главный врач.

432017, Ульяновск



Для цитирования:


Ламзин И.М., Соколова М.Н., Хайруллин Р.М., Минеева Н.В., Хапман М.Э. Особенности иммуногематологических и гематологических показателей крови донора с редким фенотипом -D-. Гематология и трансфузиология. 2020;65(1):52-60. https://doi.org/10.35754/02345730-2020-65-1-52-60

For citation:


Lamzin I.M., Sokolova M.N., Khayrullin R.M., Mineeva N.V., Khapman M.E. Features of immunohematological and hematological parameters of a donor with a rare phenotype -D-. Russian journal of hematology and transfusiology. 2020;65(1):52-60. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/02345730-2020-65-1-52-60

Просмотров: 616


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0234-5730 (Print)
ISSN 2411-3042 (Online)