Preview

Гематология и трансфузиология

Расширенный поиск

Кинетические параметры активации комплемента у больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией при лечении экулизумабом

https://doi.org/10.35754/0234-5730-2020-65-2-126-137

Полный текст:

Аннотация

Введение. Экулизумаб подавляет терминальные этапы активации комплемента и является стандартом лечения пароксизмальной ночной гемоглобинурии (ПНГ). Недостаточно стабильная ингибиция комплемента обуславливает «прорывной» внутрисосудистый гемолиз и субоптимальный ответ на терапию экулизумабом у части больных ПНГ.

Цель исследования — оценить стабильность ингибирования комплемента при лечении экулизумабом больных ПНГ с помощью тестирования кинетических параметров активации комплемента.

Материалы и методы. В исследование включены 12 больных ПНГ, длительно получающих экулизумаб (медиана — 54 мес, разброс 4–66 мес). Медиана возраста составляла 35 лет (от 22 до 68 лет), 92 % больных были лица женского пола. Медиана размера клона ПНГ составляла 96 % среди гранулоцитов. Контрольную группу составили 12 здоровых доноров (возраст 25–60 лет, женщины — 75 %). Активацию комплемента оценивали непосредственно перед очередной инфузией экулизумаба и далее — через 5 и 10 дней. Кинетические параметры (период индукции, скорость гемолиза, T50 — время, необходимое для достижения 50 % гемолиза) регистрировали отдельно для общей активности комплемента и альтернативного пути активации с использованием эритроцитов кролика (ЭК).

Результаты. Параметры активации комплемента непосредственно перед очередным введением экулизумаба соответствовали выраженному торможению общей активности системы. Индукционный период был удлинен в 7 раз по сравнению с контролем (медиана 180 против 25 секунд, р < 0,0001), а скорость гемолиза оказалась меньше в 28 раз (медиана 1,6 против 45,1 × 10 6 ЭК/мин, р < 0,0001). Величина Т50 превышала значения контроля в 20 раз (медиана 690 против 35 секунд, р < 0,0001). Параметры альтернативного пути активации комплемента были снижены в 2–3 раза по сравнению с контролем. В одном случае повторные тестирования выявили недостаточную ингибицию комплемента, что было ассоциировано с фармакокинетическим «прорывным» гемолизом. Степень дальнейшей ингибиции комплемента и тенденция к восстановлению активности существенно варьировали при динамическом тестировании на 5-й и 10-й день после инфузии экулизумаба.

Заключение. Результаты исследования продемонстрировали индивидуальные различия остаточной активности комплемента у больных ПНГ, длительно получающих терапию экулизумабом. Тестирование активности комплемента обосновано при субоптимальном ответе на терапию экулизумабом и при рассмотрении коррекции терапии. Кинетическая регистрация остаточного комплемент-зависимого лизиса эритроцитов кролика демонстрирует более высокую чувствительность, чем традиционное исследование CH50.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование: исследование не имело спонсорской поддержки.

Для цитирования:


Тарасова Ю.В., Климова О.У., Андреева Л.А., Васина Л.В., Галебская Л.В., Бабенко Е.В., Кулагин А.Д. Кинетические параметры активации комплемента у больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией при лечении экулизумабом. Гематология и трансфузиология. 2020;65(2):126-137. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2020-65-2-126-137

For citation:


Tarasova Y.V., Klimova O.U., Andreeva L.A., Vasina L.V., Galebskaya L.V., Babenko E.V., Kulagin A.D. Kinetic parameters of complement activation in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria during eculizumab therapy. Russian journal of hematology and transfusiology. 2020;65(2):126-137. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/0234-5730-2020-65-2-126-137

Введение

Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) — это приобретенное заболевание, связанное с сомати­ческой мутацией в стволовых кроветворных клетках гена PIG-A, который кодирует ранние этапы синтеза гликозилфосфатидилинозитолового (GPI) якоря [1]. GPI-якорь осуществляет фиксацию на мембране мно­гих белков, включая ингибиторы каскада комплемента CD55 и CD59 [2]. Эти мембранные белки препятству­ют комплемент-зависимому разрушению собственных клеток механизмом реактивного лизиса. Отсутствие на эритроцитарных мембранах CD55 и CD59 при­водит к выраженному комплемент-опосредованному внутрисосудистому гемолизу, уменьшению времени жизни эритроцитов более чем в 2 раза, гемоглобин- емии, деплеции оксида азота [3, 4]. Развиваются ха­рактерные для ПНГ симптомы и осложнения: анемия, гемоглобинурия, желтуха, дисфагия, боли, тромбозы, нарушение функции почек, которые приводят к инвалидизации и высокой смертности больных [5—7]. В России клиническая характеристика и прогноз ПНГ у взрослых и детей были детально изучены в боль­ших когортных исследованиях ПСПбГМУ им. акад. И. П. Павлова [8, 9].

Применение гуманизированных моноклональных антител к компоненту С5 (экулизумаб), блокирую­щих С5-конвертазу как альтернативного (АПК), так и классического (КПК) путей активации комплемен­та, купирует внутрисосудистый гемолиз, значительно улучшает состояние и снижает смертность больных ПНГ [10—13]. Однако у 30% больных развивается лишь субоптимальный ответ на терапию экулизума- бом, у них может сохраняться анемия и потребность в трансфузиях эритроцитов, возникать «прорывной» внутрисосудистый или de novo СЗ-опосредованный внесосудистый гемолиз [14]. Это объясняется комплексом причин и механизмов, среди которых рассматривают­ся сопутствующая костномозговая недостаточность, индивидуальные параметры фармакокинетики экулизумаба, комплемент-активирующие состояния (КАС), опсонизация эритроцитов фрагментами С3 компонен­та комплемента и другие [15]. В поддерживающей фазе препарат вводится в стандартной дозе 900 мг один раз в 14 дней. При этом достигаемый индивидуальный профиль и устойчивость ингибиции комплемента изу­чены недостаточно. «Прорывной» внутрисосудистый гемолиз является одним из ключевых компонентов субоптимального ответа на терапию экулизумабом, развивается на фоне регулярной терапии в стандарт­ном дозовом режиме и характеризуется возвратом клинических и лабораторных проявлений ПНГ (сла­бость, гемоглобинурия, боли, увеличение сывороточ­ной концентрации лактатдегидрогеназы, уменьшение концентрации гемоглобина крови и другие), в том чи­сле с риском тяжелого гемолитического криза, остро­го повреждения почек и тромбозов. В связи с этим для индивидуализации терапии ПНГ экулизумабом целесообразно проводить промежуточную оценку со­стояния системы комплемента [16, 17].

Общепринятый метод оценки функциональной ак­тивности комплемента — это величина СН50, то есть количество комплемента, которое лизирует 50% стан­дартной взвеси сенсибилизированных эритроцитов барана [18]. Сенсибилизированные эритроциты бара­на являются инициаторами только КПК, к которому путем амплификации подключается АПК. Раздельная регистрация активности КПК и АПК с применением этих клеток невозможна. Эритроциты кролика счи­таются инициаторами АПК. Это действительно так, но только в условиях блокады КПК с помощью хелации ионов кальция добавлением к сыворотке кро­ви этиленгликоль тетрауксусной кислоты (ЭГТА). Без ЭГТА эритроциты кролика, атакованные природ­ными антителами (IgG и IgM) человека, инициируют КПК [19]. Антигеном мембраны эритроцитов кроли­ка, к которому в сыворотке крови человека имеется вы­сокий титр антител, является углеводный компонент Gal alpha-1,3Gal beta-1,4GlcNAc-R (α-галактозильный эпитоп), широко распространенный среди микроорганизмов [20]. Ранее нами был предложен и охаракте­ризован кинетический метод раздельного определения активности комплемента по АПК и КПК, который от­личался высокой чувствительностью и хорошей вос­производимостью [21].

В настоящей работе впервые изучены параметры лизиса эритроцитов кролика по АПК и по общему комплементу (ОК), АПК + КПК в сыворотке крови больных ПНГ в динамике одного цикла введения экулизумаба. Оценена стабильность ингибирования ком­племента на фоне терапии экулизумабом с помощью кинетического метода тестирования активности ком­племента.

Цель исследования — оценить стабильность инги­бирования комплемента при лечении экулизумабом с помощью тестирования кинетических параметров активации комплемента

Материалы и методы

Больные

В исследование включались больные с верифици­рованным диагнозом ПНГ, постоянно получающие терапию экулизумабом в НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. Размер клона ПНГ определяли методом высокочувст­вительной проточной цитометрии по ранее детально описанному стандартному протоколу [22]. Медиана времени от последнего тестирования размера кло­на до включения в исследование составила 18 (5—131) дней.

В исследование были включены 12 больных, краткая характеристика которых приведена в таблице 1. В ко­горте превалировали женщины (92%), медиана воз­раста составила 35 лет (от 22 до 68 лет). Классическая форма заболевания (кПНГ) имелась у 8 (67%) боль­ных, 4 (33%) больных имели анамнез апластической анемии (АА/ПНГ). Размер клона ПНГ (медиана) на момент исследования составлял 96% среди гранулоцитов и моноцитов и 81% среди эритроцитов. Все больные до начала лечения имели интенсивный хронический внутрисосудистый гемолиз и показа­ния для терапии экулизумабом согласно текущим Национальным рекомендациям [23]. Концентрация лактатдегидрогеназы (ЛДГ) сыворотки крови до нача­ла терапии экулизумабом у всех больных значительно превышала 1,5 верхней границы нормальных значе­ний (ВГН), медиана составила 8,8 ВГН (2,1—24,7).

 

Таблица 1. Характеристика больных

Table 1. Pafienf characteristics

№ больного

UPN

Возраст, лет

Age, years

Пол

Gender

Вариант ПНГ

PNH type

Размер клона ПНГ, %

PNH clone size, %

ЛДГ, ХВГН

LDH, xULN

Терапия экулизумабом,
мес

Eculizumab therapy,
months

«Прорывной»
внутрисосудистый
гемолиз

BTH

гранулоциты

granulocytes

моноциты

Monocytes

эритроциты

RBC

До лечения

Before therapy

На момент исследования

At the time of the study

I

28

Ж

F

кПНГ

cPNH

97,08

96,54

99,40

24,74

1,25

4

нет

no

2

27

Ж

F

АА/ПНГ

AA/PNH

39,98

63,3

16,87

2,09

1,42

12

нет

no

3

32

Ж

F

кПНГ

cPNH

95,99

95,75

70,23

8,06

1,09

66

KAC

CAC

4

68

M

M

кПНГ

cPNH

53,49

72,03

21,19

3,59

1,41

56

нет

no

5

65

ж

F

кПНГ

cPNH

99,96

99,97

99,59

11,64

1,76

42

KAC

CAC

6

33

Ж

F

кПНГ

cPNH

99,67

99,81

98,38

10,83

1,93

60

KAC

CAC

7

26

Ж

F

АА/ПНГ

AA/PNH

96,10

95,73

99,77

12,03

0,77

42

нет

по

8

46

Ж

F

кПНГ

cPNH

96,08

95,86

88,14

14,75

1,29

30

KAC

CAC

9

37

Ж

F

кПНГ

cPNH

79,08

74,7

57,29

9,21

1,26

60

KAC

CAC

10

37

Ж

F

АА/ПНГ

AA/PNH

93,32

91,73

41,66

6,85

1,58

66

ФК и KAC

FC and CAC

11

49

Ж

F

кПНГ

cPNH

96,06

94,64

95,86

6,24

1,01

54

нет

no

12

22

Ж

F

АА/ПНГ

AA/PNH

99,83

99,35

74,06

3,63

1,26

54

ФК

FC

Медиана, диапазон

Median, range

35

(22-68)

НП

NA

НП

NA

96,07

(39,98- 99,96)

95,74

(63,3-99,97)

81,10

(16,87-99,77)

8,84

(2,09-24,74)

1,28

(0,77-1,93)

54

(4-66)

НП

NA

Примечание. Ж — женщины; M — мужчины; кПНГ — классическая ПНГ; АА/ПНГ — апластическая анемия/ПНГ; ВГН — верхняя граница нормальных значений; ФК — фармакокинетиче­ский «прорывной» гемолиз; KAC — комплемент-активирующие состояния; НП — не применимо.

Note. UPlP — unique patient number; F — female; AH — male; cPNH — classic PNH; AA/"FtPH — aplastic anemia/'PtpH; Gran. — qrariulocytes; Mon. — monocytes; RBC — red blood cells; IPLtP — the upper limit of normal values; FTH — breakthrough intravascular hemolysis; FC — pharmacolPnelic breakthrouqh hemolysis; CAC — complemenl-aclivalinq conditions; tpA — not applicable.

Исследование проводилось на этапе поддержива­ющей терапии. Продолжительность терапии эку­лизумабом варьировала от 4 до 66 мес, медиана — 54 мес. Препарат экулизумаб (Солирис®, Alexion Pharmaceuticals, Inc., Boston, MA, США) вводили вну­тривенно по 900 мг каждые 14 дней.

«Прорывной» внутрисосудистый гемолиз диагности­ровался в случае возобновления клинических симпто­мов и лабораторных проявлений ПНГ на фоне регу­лярной терапии экулизумабом в стандартном дозовом режиме. Лабораторным критерием «прорывного» гемолиза было повышение сывороточной концентра­ции ЛДГ выше 2 ВГН при документации ее снижения ниже 1,5 ВГН на предшествующих этапах лечения экулизумабом.

Критерием фармакокинетического «прорывного» гемолиза был повторяющийся (стереотипный) харак­тер развития клинических и лабораторных проявле­ний за 1—4 дня до очередного введения экулизумаба. Фармакодинамический «прорывной» гемолиз диаг­ностировался при документированной связи эпизода с комплемент-активирующим состоянием (инфекция, операция, беременность и др.).

Стереотипный фармакокинетический «прорывной» внутрисосудистый гемолиз предполагался у 2 боль­ных (№ 10 и 12), еще у 5 больных имелись отдельные эпизоды фармакодинамического «прорывного» гемо­лиза, связанные с беременностью (п = 3) и инфекци­ей (п = 2). На момент исследования во всех случаях имелся клинический контроль внутрисосудистого ге­молиза, сывороточная концентрация ЛДГ составляла 1,28 ВГН (0,77-1,93).

Контрольную группу составили 12 здоровых доно­ров (9 женщин и 3 мужчин) в возрасте от 25 до 60 лет. Исследование носило наблюдательный характер, одо­брено этическим комитетом ПСПбГМУ им. акад. И. П. Павлова, от всех больных было получено инфор­мированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией.

Определение кинетических параметров активации комплемента

Забор образцов крови для исследования прово­дили непосредственно перед очередной инфузией экулизумаба (п = 12). Динамическое тестирование через 5 и 10 дней после инфузии выполнено у 11 боль­ных. Выбор точек исследования предполагал оста­точную ингибицию комплемента перед очередным введением экулизумаба, максимальное ингибирова­ние — на пятый день и тенденцию к утрате ингибиции к десятому дню цикла лечения в случае развития фар­макокинетического прорывного гемолиза.

В качестве инициаторов как КПК, так и АПК ис­пользовали трижды отмытые 0,9% раствором хлорида натрия эритроциты кролика (ЭК). В термостатирован­ную при 37 оС кювету спектрофотометра СФ-2000 (ООО «ЛОМО», Санкт-Петербург) вносили 0,1 мл сыворотки крови, 0,4 мл 5 мМ вероналово-мединалового буфера (VBS; pH = 7,4) и 0,2 мл физиологического раствора. Смесь прогревали в течение 3 мин и добавляли 0,1 мл стандартной взвеси эритроцитов кролика (1,8 х 10 6 кле­ток/мл). С этого момента проводили 5-секундную реги­страцию динамики оптической плотности при 800 нм. Полученные параметры характеризовали суммарную активность КПК и АПК, т. е. ОК. Для регистрации комплементзависимого гемолиза в условиях актива­ции комплемента только по АПК вместо VBS вносили ЭГТА-VBS, то есть буфер, содержащий 10 мМ ЭГТА, блокирующий КПК. После завершения гемолиза из­меряли параметры активности комплемента, а именно: lag-t (индукционный период от момента внесения ЭК до начала снижения экстинкции, с); V (скорость гемо­лиза, х10 6 ЭК/мин) и Т50 (период времени от внесения ЭК до лизиса 50% клеток, с).

Статистический анализ. В связи с небольшой выборкой и отличным от нормального распределением числовых рядов для описательной характеристики использова­ны медианы, минимальные и максимальные значения. Различия значений кинетических параметров актива­ции комплемента между анализируемой группой боль­ных и контрольной группой здоровых доноров оцени­вались с помощью U-теста Манна — Уитни. О наличии изменений параметров активации комплемента на 5-й и 10-й дни после введения экулизумаба судили по вели­чине критерия Фридмана. Корреляционные связи по­казателей активации комплемента между собой, с дли­тельностью терапии экулизумабом и с концентрацией билирубина тестировались с использованием рангово­го коэффициента Спирмена. Тестирование альтерна­тивной гипотезы было двусторонним, статистически значимым при значении p < 0,05. Статистический ана­лиз проводился с использованием пакетов Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США) и EZR, версия 2.15.2 (R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия).

Результаты

Кинетические параметры активации системы комплемента больных перед очередной инфузией экулизумаба

Параметры активации комплемента в сыворотке крови, полученной непосредственно перед очередным введением экулизумаба, соответствовали выражен­ному торможению активности системы по сравнению с контролем (рис. 1).

 

Рисунок 1. Кинетические параметры активации комплемента у здоровых доноров (п = 12) и больных ПНГ (п = 12) непосредственно перед очередной инфузией экулизума­ба (день 0). КПК — классический путь активации комплемента; АПК — альтернативный путь активации комплемента; ЭК — эритроциты кролика

Figure 1. Kinetic parameters of complement activation in healthy donors (n = 12) and patients with PNH (n = 12) immediately before the infusion of eculizumab (0). CP — classical pathway; AP — alternative pathway; rRBC — rabbit red blood cell

 

Особенно значительным было снижение парамет­ров суммарной активности КПК + АПК: по сравне­нию с контролем индукционный период был увеличен в 7 раз (медиана 180 с (50-300 с) против 25 с (20-30 с), p < 0,0001), а скорость гемолиза оказалась меньше в 28 раз (медиана 1,6 х 106 ЭК/мин (1,0-9,7 х 106 ЭК/мин) против 45,1 х 106 ЭК/мин (35,9-52,8 х 106 ЭК/мин), p < 0,0001). Соответственно величина Т50 превышала значения контроля почти в 20 раз (медиана 690 с (110— 900 с) против 35 с (30—45 с), (р < 0,0001).

Активность АПК как по скорости гемолиза, так и по величинам индукционного периода и Т50 у боль­ных также была снижена, однако не столь значительно по сравнению с ОК. Медиана lag-t, скорости гемолиза и времени лизиса 50% клеток составили 350 с (270— 450 с), 3,0 х 106 ЭК/мин (2,3-7,6 х 106 ЭК/мин) и 585 с (440—720 с) против 152,5 с (100—190 с), 9,25 х 106 ЭК/мин (7,3—10,9 х 106 ЭК/мин) и 307,5 с (230—380 с) соответст­венно в контрольной группе (р < 0,0001) (рис. 1).

Поскольку компонент С5 участвует во всех путях ак­тивации комплемента, можно предположить, что более значительное торможение ОК обусловлено дополни­тельными причинами. В связи с известной способно­стью высоких концентраций неконъюгированного би­лирубина тормозить цитолиз по КПК был проведен дополнительный анализ потенциального значения это­го феномена. У 10 из 12 обследованных больных (кроме больных 5 и 7) концентрация билирубина превышала норму и колебалась от 28,7 до 91,1 мкмоль/л за счет конъюгированного билирубина (22,6—79,9 мкмоль/л). Существенного повышения сывороточной концентра­ции неконъюгированного билирубина не отмечалось (5,1—13,3 мкмоль/л). В связи с этим корреляция между параметрами активации комплемента и концентраци­ей неконъюгированного билирубина в сыворотке кро­ви отсутствовала (ОК lag-t, r = —0,09; ОК V, r = 0,01; ОК T50, r = —0,21, р > 0,05).

Параметры активации комплемента перед очередной инфузией экулизумаба не зависели от длительности предшествующей терапии (ОК lag-t, r = —0,06; ОК V, r = 0,13; ОК T50, r = —0,36, р > 0,05). Но при индивиду­альном сравнении параметров активации комплемента был обнаружен ряд особенностей. У больной № 10 па­раметры активации ОК оказались близки значениям, характерным для контрольной группы (рис. 1). Именно показатели этой больной (lag-t = 50 c, V = 9,7 х 106 ЭК/мин, Т50 = 110 с) обусловили большой разброс данных по па­раметрам ОК во всей группе обследованных. При по­вторном исследовании в другом цикле введения препа­рата были вновь получены близкие результаты (lag-t = 45 c, V = 35 х 106 ЭК/мин, Т50 = 130 с), соответствую­щие показателям здоровых доноров. При этом параме­тры активации комплемента по альтернативному пути у данной больной, за исключением скорости гемолиза, были близки к параметрам остальных больных, то есть к моменту очередной инфузии экулизумаба АПК оста­вался подавленным. Следовательно, высокая актив­ность ОК у данной больной была преимущественно об­условлена повышенной активностью КПК.

Среди особенностей этого случая следует отме­тить сравнительно низкий процент клона дефектных по CD59 эритроцитов (42%) при истинном размере клона более 90% и повышение сывороточной актив­ности ЛДГ более 1,5 ВГН, что свидетельствует о со­хранении достаточно активного внутрисосудистого гемолиза к моменту очередного введения экулизума- ба. У данной больной имело место сочетание эпизодов фармакодинамического «прорывного» внутрисосудистого гемолиза, связанного с КАС (впервые дебютировавшая целиакия) с последующими стереотипными эпизодами фармакокинетического «прорывного» ге­молиза непосредственно перед очередным введением экулизумаба, уже в отсутствие отчетливых КАС.

Еще у одной больной (№ 12) с предполагаемым фармакокинетическим «прорывным» гемолизом степень ингибиции комплемента непосредствен­но перед очередной инфузией экулизумаба была выраженной и не отличалась от других больных. Последующее углубленное тестирование и эффек­тивный контроль заболевания на фоне эксперимен­тальной терапии ингибитором C3 показали ключевой вклад С3-опосредованного внесосудистого гемолиза в субоптимальный ответ на экулизумаб в данном на­блюдении.

Динамика изменения параметров активации комплемента в процессе лечения экулизумабом

Варьирование степени ингибиции комплемента непосредственно до очередного введения экулизумаба подтверждалось при динамическом тестировании на 5-й и 10-й дни цикла лечения (рис. 2).

 

Рисунок 2. Динамика параметров активации комплемента у больных ПНГ (n = 11) в процессе одного цикла поддерживающего лечения экулизумабом (D0 — до инфузии экулизумаба, D5 — 5-й день, D10 — 10-й день). КПК — классический путь активации комплемента; АПК — альтернативный путь активации комплемента; ЭК — эритроциты кролика

Figure 2. Dynamics of complement activation parameters in patients with PNH (n = 11) during one cycle of maintenance treatment with eculizumab (D0 — before infusion of eculizumab, D5 — Day 5, D10 — Day 10). CP — classical pathway; AP — alternative pathway; rRBC — rabbit red blood cell

 

На пятый день после инфузии экулизумаба измене­ния всех показателей, как ОК, так и АПК, свидетель­ствовали о достоверном дальнейшем торможении си­стемы: скорость комплементзависимого гемолиза (V) снижалась, а lag-t и Т50 увеличивались. По параме­трам ОК дальнейшего торможения не было выявлено, или оно было минимальным у 3 больных (№ 1, 2 и 11) по lag-периоду и у двух (№ 1 и 3) — по скорости ге­молиза. В АПК исключений было меньше: у больной № 11 не было изменений ни lag-периода, ни скорости гемолиза, а у больного № 4 — только скорости ге­молиза.

На десятый день цикла лечения экулизумабом из­менения параметров активации комплемента были индивидуальны. У 5 больных торможение АПК еще усилилось (больные № 1, 2, 7, 9, 10), у троих больных (№ 5, 8, 11) параметр вернулся к исходному значению и еще у троих (больные № 3, 4, 6) стал ниже исходной величины.

Между величинами lag-t и V у обследованной груп­пы больных наблюдалась сильная отрицательная кор­реляция (r = —0,96; р < 0,001 и r = —0,87; р < 0,01 соот­ветственно по ОК и КПК). В связи с этим, по нашему мнению, самым информативным является показатель Т50, который включает и lag-t, и время лизиса до до­стижения 50% суспензии клеток.

Из рисунка 2 видно, что на пятый день после инфузии экулизумаба у всех больных, кроме больного № 1, величина Т50 повысилась, что свидетельствовало о дальнейшем выраженном торможении комплемен­та. Особенно значительным (более чем в 4 раза) было повышение Т50 у больной № 10, у которой отмечалась высокая исходная общая активность комплемента. Повторное исследование больной № 10 выявило более чем четырехкратного торможения комплемента на пя­тый день после инфузии экулизумаба. Тем не менее степень ингибиции общей активности комплемента в данном случае не достигала параметров большинст­ва других больных.

Величина Т50 при активации комплемента по аль­тернативному пути на пятый день после инфузии экулизумаба повышалась у всех больных, кроме больной № 11. Однако прирост величины не давал таких вы­соких значений, как при ОК, в отношении некоторых больных, в том числе больной № 10.

На десятый день после инфузии экулизумаба только у 5 больных сохранялось дальнейшее подавление ак­тивности комплемента (Т50 превышало исходную ве­личину), еще у 5 больных показатель Т50 возвращался к исходному значению, а у 1 больного имелось раннее снижение показателя.

Таким образом, несмотря на хороший клинический эффект длительной терапии экулизумабом, доку­ментированы значительные индивидуальные разли­чия остаточной активности комплемента у больных ПНГ. Клиническое значение выявленных индивиду­альных параметров подавления комплемента на фоне терапии экулизумабом отчетливо прослеживается у больной № 10, у которой стереотипный характер «прорывного» гемолиза строго связан с недостаточной ингибицией комплемента.

Обсуждение

Терапия ингибитором терминальных этапов актива­ции комплемента — препаратом экулизумаб являет­ся стандартом лечения больных ПНГ, улучшающим состояние больных и эффективно предотвращаю­щим новые тромботические и органные осложнения. При этом почти у 20% больных развился «прорывной» внутрисосудистый гемолиз, а анемия разной степени тяжести персистировала, как минимум, у половины больных [14]. Эти клинические признаки свидетель­ствуют об отсутствии полной блокады комплемен­та. При этом исследование активации комплемента у больных ПНГ до настоящего времени не входит в стандарты мониторинга эффективности длительной терапии ингибитором C5 компонента комплемента. В настоящем исследовании впервые у больных, дли­тельно получающих терапию экулизумабом, проведен анализ параметров активации комплемента кинети­ческим методом раздельного определения активности комплемента по АПК и КПК.

По данным P. R. de Latour и соавт. [16], остаточная активность комплемента, определяемая по традици­онной величине CH50, регистрировалась только в по­ловине образцов сыворотки крови больных ПНГ, по­лучавших экулизумаб. Тем не менее авторы выявили обратную связь между концентрацией экулизумаба и активностью комплемента в крови больных. Другие авторы, отмечая важность регистрации активности комплемента, не выявили комплементзависимого ли­зиса эритроцитов курицы в сыворотке крови больных ПНГ, получавших экулизумаб [24]. В настоящем ис­следовании активность комплемента сыворотки крови регистрировалась у всех больных во все временные периоды цикла введения экулизумаба. Это свидетель­ствует об отсутствии полной блокады комплемента при терапии экулизумабом и более высокой чувстви­тельности кинетического метода регистрации компле­мента с использованием эритроцитов кролика.

Самое значительное торможение комплемента, как по АПК, так и по КПК, наблюдалось в настоящей работе на пятый день после введения экулизумаба, что соответствовало повышению концентрации пре­парата по результатам исследования его фармакокине­тики [16]. На десятый день после инфузии экулизумаба направленность изменений параметров активации комплемента у обследованных больных была индиви­дуальной. По данным литературы [16], в аналогичный период (9-й день) концентрация экулизумаба в крови больных ПНГ становилась низкой, но варьировала у разных больных в широком диапазоне значений.

По данным литературы, неконъюгирован- ный билирубин в концентрациях, превышающих 170 мкмоль/л, ингибировал комплементзависимый цитолиз по КПК путем взаимодействия с компонен­том dq [25]. Настоящее исследование не подтверди­ло значение этого феномена у обследованных больных с ПНГ. Изученные параметры активации комплемента не коррелировали с концентрацией неконъюгированного билирубина, что, вероятно, объясняется отсут­ствием существенного повышения его концентрации, в отличие от конъюгированного билирубина.

Разная степень гемолитических проявлений ПНГ при блокировании компонента С5 может быть об­условлена как особенностями фармакокинетики эку- лизумаба, так и индивидуальным молекулярным составом белков системы комплемента у больных. При исследовании выраженности внутрисосудистого и внесосудистого гемолиза у больных ПНГ, получав­ших экулизумаб, авторы показали роль полиморфиз­ма молекулы С5 и разных аллелей рецептора компле­мента-1 (CR1) в гемолитических проявлениях [17].

Новые данные свидетельствуют, что остаточная литическая активность терминального пути ком­племента зависит от силы активатора комплемента и поверхностной плотности C3b, которая усиливает альтернативный путь через мощную петлю амплифи­кации [26]. При высокой плотности C3b на эритроци­тах ингибитор C5 экулизумаб уменьшает, но не отме­няет активность терминального комплемента. C5 более восприимчив к расщеплению конвертазами в услови­ях интенсивного праймирования из-за избытка C3b на эритроцитах, даже в присутствии ингибитора C5. В результате у больного ПНГ, получающего терапию экулизумабом, в условиях сильной активации компле­мента (инфекция, операция и др.) происходит изме­нение конформации С5, которая разрушает стерические помехи, вызванные экулизумабом, что приводит к «прорывному» внутрисосудистому гемолизу.

Комбинация экулизумаба и коверсина, которые свя­зываются с различными эпитопами C5, обладает адди­тивными э фф ектами и способна отменить остаточную литическую активность даже в присутствии сильной активации [26].

В настоящее время оптимизация лечения ПНГ возможна по следующим направлениям. В слу­чае констатации прогрессирующей костномозговой недостаточности у молодых больных с наличием HLA- совместимого донора может рассматриваться транс­плантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток [27]. Однако в большинстве случаев субопти- мальный контроль ПНГ на фоне терапии экулизумабом требует поиска новых вариантов ингибиции ком­племента, преодолевающих недостатки экулизумаба [15]. При этом в качестве мишени по-прежнему рас­сматривается 5-й компонент комплемента, а также новые более проксимальные мишени активации ком­племента (C3, фактор D, фактор В). В США, Японии и Европе для лечения ПНГ одобрен равулизумаб — инновационный ингибитор C5 длительного действия. Данный препарат по сравнению с экулизумабом вызы­вает более стабильную ингибицию C5 [28]. В недавно опубликованных результатах продленной фазы двух ключевых исследований равулизумаба не было зарегистрировано ни одного случая «прорывного» гемо­лиза, связанного с повышением свободного C5 выше 0,5 мкг/мл, т. е. концентрации, связанной с полным ин­гибированием С5 [29].

В проведенном исследовании низкая эффективность стандартной дозы экулизумаба с фармакокинетиче­ским «прорывным» гемолизом была документирована у одной больной, у которой отмечено недостаточное ингибирование комплемента по всем изученным па­раметрам ОК и АПК. Данный случай представляет особый интерес, поскольку первый эпизод фармакодинамического «прорывного» внутрисосудистого гемо­лиза был связан с дебютом целиакии, а в дальнейшем сохранялись эпизоды фармакокинетического «про­рывного» гемолиза уже без клинических проявлений целиакии на фоне безглютеновой диеты. Известно, что аутоиммунные процессы, в том числе целиакия, сопровождаются усилением потребления комплемента [30]. Возможно, это вызывает повышенную продук­цию компонентов КПК и приводит к быстрому нара­станию активности комплемента в промежутках меж­ду инфузиями экулизумаба.

В противоположность этому, во втором случае пред­полагаемый фармакокинетический «прорывной» ге­молиз не был подтвержден по изученным параметрам активности комплемента, а субоптимальный ответ на экулизумаб был преимущественно связан с выра­женным внесосудистым гемолизом за счет опсониза- ции эритроцитов фрагментами C3.

Ингибиторы проксимальных этапов активации ком­племента, в частности компонента C3, наряду с купи­рованием внутрисосудистого гемолиза призваны ре­шить проблему C3-опосредованного внесосудистого гемолиза, который в той или иной мере проявляется практически у всех больных, получающих экулизумаб [15]. В частности, к настоящему времени получены об­надеживающие данные исследования Ib-фазы цикли­ческого пептидного ингибитора C3 (APL-2), представ­ляющего собой пегилированный аналог компстатина [31]. В настоящее время проводится большое рандоми­зированное исследование APl-2 у больных с субопти- мальным ответом на экулизумаб.

Результаты настоящего исследования продемон­стрировали индивидуальные различия активности комплемента у больных ПНГ, получающих длитель­ную антикомплементарную терапию экулизумабом. Обоснована необходимость тестирования активности комплемента при субоптимальном ответе на терапию экулизумабом и при внедрении новых методов тера­пии. Кинетический метод, основанный на раздельной регистрации общей активности комплемента и альтер­нативного пути активации в модели комплемент-зависимого лизиса эритроцитов кролика, демонстрирует более высокую чувствительность, чем традиционное определение CH50.

Список литературы

1. Takeda J., Miyata T., Kawagoe K., et al. Defi ciency of the GPI anchor caused by a somatic mutation of the PIG-A gene in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Cell. 1993; 73(4): 703–11. DOI: 10.1016/0092-8674(93)90250-T.

2. Davitz M.A., Low M.G., Nussenzweig V. Release of decay-accelerating factor (DAF) from the cell membrane by phosphatidylinositol-specifi c phospholipase C (PIPLC). Selective modifi cation of a complement regulatory protein. J Exp Med. 1986; 163(5): 1150–61. DOI: 10.1084/jem.163.5.1150.

3. Rosse W.F. The life-span of complement-sensitive and -insensitive red cells in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood. 1971; 37(5): 556–62. DOI: 10.1182/blood.V37.5.556.556.

4. Rother R.P, Bell L., Hillmen P., Gladwin M.T. The clinical sequelae of intravascular hemolysis and extracellular plasma hemoglobin: a novel mechanism of human disease. JAMA. 2005; 293(13): 1653–62. DOI: 10.1001/jama.293.13.1653.

5. Hillmen P., Lewis S.M., Bessler M., et al. Natural history of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. N Engl J Med. 1995; 333(19): 1253–8. DOI: 10.1056/NEJM199511093331904.

6. de Latour R.P., Mary J.Y., Salanoubat C., et al. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: natural history of disease subcategories. Blood. 2008; 112(8): 3099–106. DOI: 10.1182/blood-2008-01-133918.

7. Parker C., Omine M., Richards S., et al. Diagnosis and management of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood. 2005; 106(12): 3699–709. DOI: 10.1182/blood-2005-04-1717.

8. Кулагин А.Д., Климова О.У., Добронравов А.В. и др. Клиническая манифестация и ошибки диагностики классической пароксизмальной ночной гемоглобинурии: анализ 150 наблюдений. Клиническая онкогематология. 2017; 10(3): 333–41. DOI: 10.21320/2500-2139-2017-10-3-333-341.

9. Кулагин А.Д., Климова О.У., Добронравов А.В. и др. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия у детей и взрослых: сравнительный клинический профиль и долгосрочный прогноз. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2018; 17(3): 11–21. DOI: 10.24287/1726-1708-2018-17-3-11-21.

10. Hillmen P., Hall C., Marsh J.C., et al. Effect of eculizumab on hemolysis and transfusion requirements in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. N Engl J Med. 2004; 350(6): 552–9. DOI: 10.1056/NEJMoa031688.

11. Hi llmen P., Muus P., Roth A., et al. Long-term safety and effi cacy of sustained eculizumab treatment in patients with paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Br J Haematol. 2013; 162(1): 62–73. DOI: 10.1111/bjh.12347.

12. Loschi M., Porcher R., Barraco F., et al. Impact of eculizumab treatment on paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: a treatment versus no-treatment study. Am J Hematol. 2016; 91(4): 366–70. DOI: 10.1002/ajh.24278.

13. Кулагин А.Д. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия: современные представления о редком заболевании. Клиническая онкогематология. 2019; 12(1): 4–20.

14. Kulagin A., Klimova O., Rudakova T., et al. Benefi ts and limitations of longterm eculizumab treatment for paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH): Realworld data from large cohort study in Russia. Blood. 2018; 132 (Supplement 1): 2589. DOI: 10.1182/blood-2018-99-120139.

15. Risitano A.M., Marotta S., Ricci P., et al. Anti-complement treatment for paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: time for proximal complement inhibition? A position paper from the SAAWP of the EBMT. Frontiers in immunology. 2019; 10: 1157. DOI: 10.3389/fimmu.2019.01157.

16. de Latour P.R., Fremeaux-Bacchi V., Porcher R., et al. Assessing complement blockade in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria receiving eculizumab. Blood. 2015; 25(5): 775–83. DOI: 10.1182/blood-2014-03-560540.

17. Hidalgo S.M., Merinero M.H., López A. Extravascular hemolysis and complement consumption in Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria patients undergoing eculizumab treatment. Immunobiology. 2017; 222(2): 363–71. DOI: 10.1016/j.imbio.2016.09.002.

18. Mayer M.M. Complement and complement fi xation. In: Kabat E.A., Mayer M.M., editors. Experimental immunochemistry. Springfi eld, Ill: Charles C. Thomas; 1961: 133–240.

19. Tönder O., Larsen B., Aarskog D., Haneberg B. Natural and immune antibodies to rabbit erythrocyte antigens. Scand J Immunol. 1978; 7(3): 245–49. DOI: 10.1111/j.1365-3083.1978.tb00451.x.

20. Galili U., Rachmilewitz E.A., Peleg A., Flechner I. A unique natural human IgG antibody with anti-alpha-galactosyl specifi city. J Exp Med. 1984; 160(5): 1519–31. DOI: 10.1084/jem.160.5.1519.

21. Галебская Л.В., Рюмина Е.В., Тарасова Ю.В., Леонтьева Н.В. Анализ динамики комплементзависимого гемолиза. Клин. и лаб. диагн. 2001; 3: 47–49.

22. Sipol A.A., Babenko E.V., Borisov V.I., et al. An inter-laboratory comparison of PNH clone detection by high-sensitivity fl ow cytometry in a Russian cohort. Hematology. 2015; 20(1): 31–8. DOI: 10.1179/1607845414Y.0000000162.

23. Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Птушкин В.В. и др. Национальные клинические рекомендации по диагностике и лечению пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Онкогематология. 2014; 9(2): 20–8. DOI: 10.17650/1818-8346-2014-9-2-20-28.

24. Ferreira V.P., Pangburn M.K. Factor H-mediated cell surface protection from complement is critical for the survival of PNH erythrocytes. Blood. 2007; 110(6): 2190–2. DOI: 10.1182/blood-2007-04-083170.

25. Basiglio C.L., Arriaga S.M., Pelusa H.F., et al. Protective role of unconjugated bilirubin on complement-mediated hepatocytolysis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 2007; 1770(7): 1003–10. DOI: 10.1016/j.bbagen.2007.03.005.

26. Harder M.J., Kuhn N., Schrezenmeier H., et al. Incomplete inhibition by eculizumab: mechanistic evidence for residual C5 activity during strong complement activation. Blood. 2017; 129(8): 970–80. DOI: 10.1182/blood-2016-08-732800.

27. Kulagin A., Klimova O., Rudakova T., et al. Eculizumab followed by allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) for hemolytic paroxysmal nocturnal hemoglobinuria/severe aplastic anemia (hPNH/SAA). Bone Marrow Transplant. 2016; 51(1): S90. DOI: 10.1038/bmt.2016.46.

28. de Latour R.P., Brodsky R.A., Ortiz S., et al. Ravulizumab (ALXN1210) Versus Eculizumab in Adults with Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics Observed in Two Phase 3 Randomized, Multicenter Studies. Blood. 2018; 132 (Supplement 1): 626. DOI: 10.1182/blood-2018-99-110858.

29. Hill A., Piatek C.I., de Latour R.P., et al. Breakthrough Hemolysis in Adult Patients with Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria Treated with Ravulizumab: Results of a 52-Week Extension from Two Phase 3 Studies. Blood. 2019; 134(Supplement 1): 952. DOI: 10.1182/blood-2019-128929.

30. Halstensen T.S., Hvatum M., Scott H., Fausa O., Brandtzaeg P. Association of subepithelial deposition of activated complement and immunoglobulin G and M response to gluten in celiac disease. Gastroenterology. 1992; 102(3): 751–9. DOI: 10.1016/0016-5085(92)90155-R.

31. Wong R.S., Pullon H.W., Deschatelets P., et al. Inhibition of C3 with APL-2 Results in Normalisation of Markers of Intravascular and Extravascular Hemolysis in Patients with Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH). Blood. 2018; 132 (Supplement 1): 2314. DOI: 10.1182/blood-2018-99-110827


Об авторах

Ю. В. Тарасова
ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Тарасова Юлия Викторовна, кандидат биологических наук, доцент кафедры биологической химии



О. У. Климова
НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Климова Олеся Усмановна, врач-гематолог поликлинического отделения НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой


Л. А. Андреева
ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Андреева Лариса Алексеевна, ассистент кафедры биологической химии


Л. В. Васина
ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Васина Любовь Васильевна, доктор медицинских наук, заведующая кафедрой биологической химии


Л. В. Галебская
ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Галебская Людвига Вячеславовна, доктор медицинских наук, профессор кафедры биологической химии


Е. В. Бабенко
НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия
Бабенко Елена Витальевна, заведующая отделением криоконсервирования с лабораторией оценки качества трансплантата НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой


А. Д. Кулагин
НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Кулагин Александр Дмитриевич, доктор медицинских наук, профессор кафедры гематологии, трансфузиологии и трансплантологии 

тел.: +7(812) 338 62 84; 197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6–8



Для цитирования:


Тарасова Ю.В., Климова О.У., Андреева Л.А., Васина Л.В., Галебская Л.В., Бабенко Е.В., Кулагин А.Д. Кинетические параметры активации комплемента у больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией при лечении экулизумабом. Гематология и трансфузиология. 2020;65(2):126-137. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2020-65-2-126-137

For citation:


Tarasova Y.V., Klimova O.U., Andreeva L.A., Vasina L.V., Galebskaya L.V., Babenko E.V., Kulagin A.D. Kinetic parameters of complement activation in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria during eculizumab therapy. Russian journal of hematology and transfusiology. 2020;65(2):126-137. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/0234-5730-2020-65-2-126-137

Просмотров: 198


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0234-5730 (Print)
ISSN 2411-3042 (Online)