Репертуар HLA-аллелей у российских больных хроническим лимфолейкозом с неблагоприятным прогнозом

Введение

Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ)  — одно из наиболее распространенных лимфопролифе­ративных заболеваний в Европе и США, характери­зующееся гетерогенностью течения [1]. Мутационный статус генов вариабельного региона тяжелой цепи им­муноглобулинов (IGHV) известен как важный фактор долгосрочного прогноза при ХЛЛ [2][3]. Кроме того, разнообразие вариантов структуры перестроенного гена IGHV опухолевых клеток при ХЛЛ весьма огра­ничено и существенно отличается от такового для нор­мальных В-клеток [4][5]. Около 30 % всех случаев ХЛЛ имеют гены иммуноглобулиновых рецепторов с очень схожими нуклеотидными последовательностями [6][7]. Такие квазиидентичные рецепторы называют сте­реотипными. Всего описано более 200 подгрупп сте­реотипных антигенных рецепторов (САР). Больные с 20 наиболее распространенными САР составля­ют более 12 % от всей популяции больных ХЛЛ [7]. Подавляющее большинство САР формируется с уча­стием немутированных генов IGHV (преимущественно 1-го семейства) и ассоциируется с особо агрессивным течением заболевания [8]. Для разного типа подобных стереотипных рецепторов характерны разные комби­нации крайне неблагоприятных мутаций в генах TP53, NOTCH1 и других, играющих важную роль в онкоге­незе [9]. Эти факты являются важными аргумента­ми в пользу того, что в селекции опухолевых клеток ХЛЛ на ранних стадиях болезни участвуют опреде­ленные антигены (вирусного/бактериального проис­хождения, аутоантигены апоптотических клеток). Также вероятно, что после трансформации клона ан­тигенная стимуляция клеток не утрачивает значения и вместе с другими факторами определяет характери­стики злокачественного клона и прогноз заболевания. В то же время известно, что в разных географических регионах преимущественно используемые IGHV-гены, а также соотношения мутированных и немутирован­ных вариантов ХЛЛ различны [10][11][12][13][14]. Эти различия могут быть связаны как с генетической дивергенцией популяций, так и с особенностями географической среды.

HLA-комплекс играет центральную роль в формиро­вании иммунного ответа. HLA-полиморфизмы могут влиять на способность иммунной системы идентифи­цировать злокачественные клетки и уничтожать их [15]. Впервые информация о связи генов HLA с заболе­ванием у человека появилась более 50 лет назад [16][17]. В литературе описано множество случаев ассоциации специфических HLA-аллелей и гаплотипов с различ­ными онкологическими, аутоиммунными и инфекци­онными заболеваниями [17]. Однако связь HLA-генов с развитием ХЛЛ и ассоциации HLA-аллелей с раз­личными вариантами данного заболевания изучены недостаточно. Для настоящего исследования в этой области была выбрана группа больных ХЛЛ с небла­гоприятным прогнозом, т. к. для этой группы более характерно сужение репертуара генов IGHV, и, по на­шему мнению, вероятность обнаружить ассоциации с HLA-аллелями (при их наличии) выше.

Цель настоящей работы — изучить репертуар HLA- аллелей у больных ХЛЛ с немутированными гена­ми IGHV и наиболее распространенными стереотип­ными рецепторами.

Материалы и методы

Материал. В исследование был включен материал (ДНК) 100 больных ХЛЛ с экспрессией немутирован­ных генов IGHV из коллекции ФГБУ «НМИЦ гема­тологии» Минздрава России. У 50 больных рецепторы не были стереотипными (группа 1), остальные 50 боль­ных имели наиболее распространенные стереотипные антигенные рецепторы (САР) (группа 2). Материал больных был направлен из различных регионов РФ для исследования мутационного статуса генов IGHV с 2008 г. по 2019 г. В качестве контроля была выбрана группа здоровых доноров — 1507 человек.

Анализ генов IGHV. Для определения клональ­ной перестройки ДНК больных амплифицировали в 6 отдельных реакциях с использованием прайме­ров, специфичных к семействам IGHV и консенсусно­го праймера IGHJ [18][19]. Полученный клональный продукт секвенировали с помощью набора BigDye Terminator v1.1 (ThermoFisher Scientific, USA) на генети­ческих анализаторах ABI3130 (ThermoFisher Scientific, USA) или «Нанофор 05» (ФГБУН «ИАП РАН», Россия). Нуклеотидные последовательности анали­зировали в открытых онлайн-базах данных IgBLAST [20] и IMGT [21]. Если последовательность клональ­ного IGHV-гена совпадала с последовательностью од­ного из герминальных IGHV-генов на 98 % и более, считали, что данный ген не подвергался соматиче­ской гипермутации. Принадлежность к САР опре­деляли с помощью открытой онлайн-программы ARResT/AssignSubsets [22].

HLA-типирование по 5 локусам (HLA-A, — B, — C, — DRB1, — DQB1) проводили набором Lifecodes HLA SSO typing kits (Immucor, CT, USA) с использованием Luminex 200 system (Luminex, TX, USA).

Результаты

Все больные, включенные в исследование, имели немутированные гены IGHV. У 76 больных гомология с герминальным геном составляла 100 %, у 24 боль­ных гомология была в диапазоне 98—99,7 %. 50 боль­ных (группа 1) имели нестереотипные антигенные рецепторы, их IGHV-гены распределялись между 3 (29 случаев), 4 (19 случаев) и 5 (2 случая) семейст­вами (табл. 1). Чаще всего в данной группе встреча­лись гены IGHV4-39, IGHV4-34, IGHV3-74, IGHV3-11, у остальных 50 больных (группа 2) наблюдались наи­более распространенные САР, ассоциированные с бо­лее агрессивным течением заболевания по сравне­нию с нестереотипными случаями немутированного ХЛЛ. Большинство из них относились к 1-му семей­ству генов IGHV (46 больных, 92 %) (табл. 1). Самым частым геном в данной группе был IGHV1—69, он встре­чался у половины больных.

При изучении общих особенностей репертуара HLA- аллелей у больных ХЛЛ выявлено, что наиболее часто встречались в локусе HLA-A аллельные группы А*02, А*03, А*01. В локусе HLA-B самыми распространенны­ми группами были B*07, B*35, B*18, B*44. Аллельные группы С*12, С*07, С*06 чаще всего встречались у боль­ных ХЛЛ в локусе HLA-С. Среди HLA-генов II клас­са наиболее распространенными были HLA-DRB1*15, HLA-DRB1*11, HLA-DRB1 *07, HLA-DQB1*03 и HLA- DQB1*03. В большинстве случаев эти аллельные груп­пы также являются наиболее широко распространен­ными и у здоровых доноров.

Однако были обнаружены и значимые различия в репертуаре HLA-аллелей между двумя группа­ми больных, а также здоровыми донорами (табл. 2). В локусе HLA-A группа аллелей HLA-A*33 встреча­лась у больных группы 1 достоверно чаще, чем у до­норов. В локусе HLA-B значимые различия наблюда­лись в 3 аллельных группах. B*18 выявляли у больных группы 2 достоверно чаще, чем у доноров и у боль­ных группы 1. HLA-B*39 чаще выявляли у группы 1 по сравнению с донорами; у группы 2 эти аллели об­наружены не были. Для всех больных частота встре­чаемости аллелей HLA-B*52 была выше, чем у доноров. В локусе HLA-С у больных ХЛЛ чаще встречалась ал­лельная группа С*12, чем у доноров. В локусе DRB1 на­блюдались различия в трех аллельных группах. HLA- DRB1*15 у больных группы 2 выявляли вдвое чаще, чем у здоровых доноров и первой группы, HLA-DRB1 *13, напротив — вдвое реже. HLA-DRB1*16 существенно чаще наблюдали у больных первой группы по сравне­нию с донорами и группой 2. В локусе DQB1 значимых различий обнаружено не было.

Также проведено сравнение по наиболее частым гаплотипам, встречающимсяу больных ХЛЛ. Гаплотипы A*02-B*07-C*07-DRB1*15-DQB1*06 и A*25-B*18-С*12-DR B1*15-DQB1*06 чаще выявлялись у больных группы 2, чем у доноров, однако эти данные не были статистиче­ски значимыми из-за малой выборки.

Кроме того, выявлена существенная разница в ча­стоте гомозиготности аллелей. В локусах HLA первого класса у больных группы 2 втрое чаще встречались го­мозиготные аллели, чем у больных группы 1.

Обсуждение

Локус HLA-генов является наиболее полиморфным в человеческом геноме. Ранее были показаны ассоциа­ции между HLA-антигенами и различными заболева­ниями, включая неходжкинские лимфомы [24], одна­ко таких работ очень мало, в основном, они посвящены исследованиям очень тяжело протекающих заболева­ний. Настоящая работа является первым исследовани­ем репертуара HLA-генов у больных ХЛЛ в России.

Авторы ряда исследований высказывали предполо­жения, что гомозиготность HLA-аллелей ассоциирует­ся с развитием неходжкинских лимфом [24][25][26] и про­грессией ХЛЛ [27][28]. Основная гипотеза заключается в том, что гомозиготность в локусах HLA уменьшает разнообразие антигенов, которые могут быть презентированы Т-лимфоцитам. Эта гипотеза подкрепляется более ранними исследованиями, в которых изучалось влияние гомозиготности генов HLA на инфекционные заболевания [29][30][31]. В этих работах отсутствие разно­образия генов HLA 1-го и 2-го класса ассоциировалось с повышенным риском инфицирования вирусом гепа­тита В и ВИЧ. Таким образом, предполагается, что ог­раничение разнообразия HLA-аллелей обеспечивает развивающейся опухоли преимущество в избегании иммунного ответа. Полученные в настоящей работе данные о более высокой частоте гомозиготных алле­лей в локусах HLA 1-го класса в группе больных с САР, ассоциированных с более агрессивным течением забо­левания [8], косвенно подтверждают эту гипотезу.

Несмотря на небольшую выборку, в настоящей работе удалось обнаружить ассоциацию 2 HLA- аллелей с ХЛЛ с немутированными генами IGHV (HLA-B*52 и HLA-C*12), и еще 2 для ХЛЛ с прогно­стически неблагоприятными САР (HLA-B*18 и HLA- DRB1*15). Некоторые из этих аллелей ассоциированы с аутоиммунными заболеваниями. Аллель HLA- DRB1*15 связана с повышенным риском развития рассеянного склероза, HLA-B*52 ассоциируется с ар­териитом Такаясу [17][32]. Кроме того, наблюдаются некоторые различия в репертуаре HLA-аллелей у боль­ных с экспрессией генов IGHV из разных семейств. Обнаружено, что HLA-B*18 втрое реже встречается у больных с экспрессией 3-го и 4-го семейств IGHV, чем первого семейства, а HLA-DRB1*13 и HLA- DRB1*15 — вдвое реже. HLA-DRB1*16, наоборот, втрое чаще распространен у больных с 3-м и 4-м семейства­ми IGHV по сравнению с первым семейством. Аллель HLA-B*39 не была обнаружена в группе с САР.

Наши данные расходятся с данными исследова­телей из США и Великобритании и частично сов­падают с результатами иранских ученых. В рабо­те L. Gragert и соавт. показано, что у американцев, принадлежащих к белой расе, аллели HLA-A*02:01, HLA-C*05:01, HLA-C*07:01, HLA-C*16:02, HLA-B*14:01, HLA-B*15:01, HLA-DRB1*04:01, HLA-DRB1*04:02, HLA- DRB1*07:01, HLA-DRB1*08:01, HLA-DQB1*03:02, HLA- DQB1*03:03, HLA-DQB1*04:02 и HLA-DQB1*05:04 ассоциированы с ХЛЛ [27]. По данным Di Bernardo Ж. C. и соавт. [33], таковыми являются HLA-A*02:01, HLA-A*31:01, HLA-B*14:01, HLA-C*08:02, DRB1*11:01.

Ни один из указанных аллелей не встречался в груп­пах, проанализированных нами. По данным иран­ских исследователей, в локусе HLA-A также наиболее распространенной и предиктивной является аллель HLA-A*02:01 [34]. Однако в локусе HLA-B значительно чаще, чем у здоровых доноров, у больных ХЛЛ встре­чались HLA-B*18:01 и HLA-B*52:01, как и в выборке в нашем исследовании. При этом наиболее распро­страненной и предиктивной для иранских больных в данном локусе являлся аллель HLA-B*35:01. В рос­сийской выборке группа HLA-B*35 являлась второй по частоте как для больных ХЛЛ, так и для здоровых доноров.

Полученные расхождения возможно объяснить несколькими причинами. Известно, что в различ­ных популяциях частота использования HLA-аллелей и HLA-гаплотипов различна [35][36][37]. Также существу­ют определенные географические особенности репер­туара генов IGHV, и, как следствие, САР. Например, ген IGHV1—69 встречается примерно у 20 % российских больных ХЛЛ, значительно реже в Северной и Южной Европе (10—14 %) и практически отсутствует у боль­ных в Иране [11][38][39]. При этом в России данный ген встречается почти всегда в немутированном вари­анте и является частью нескольких САР, ассоцииро­ванных с агрессивным течением заболевания. Кроме того, мы изучали малые селектированные выборки — все больные имели немутированные IGHV-гены, поло­вина относилась к когорте с прогностически наиболее неблагоприятными САР. Исследование неселектиро- ванных выборок больных ХЛЛ существенно большего размера, вероятно, позволит найти новые ассоциации HLA-аллелей с течением заболевания. Также важно дальнейшее изучение влияния гомозиготности HLA- аллелей на течение ХЛЛ.