Определение минимальной измеримой остаточной болезни у взрослых больных острыми лейкозами

Введение

Острые лейкозы — это заболевания, обусловленные клональной пролиферацией в костном мозге (КМ) клеток-предшественниц. С появлением новых протоколов лечения, таргетных и клеточных препаратов, применяемых в терапии этих заболеваний, удалось значительно увеличить продолжительность жизни больных острыми лимфобластными лейкозами (ОЛЛ) и острыми миелоидными лейкозами (ОМЛ). Внедрение в практику новых подходов к терапии привело к тому, что полной ремиссии (ПР) на ранних этапах терапии достигают большинство больных. ПР характеризуется количеством бластных клеток, обнаруживаемых при исследовании пунктата КМ, менее 5 %, при условии нормального эритропоэза, гранулоцитопоэза и мегакариоцитопоэза, количестве нейтрофилов в периферической крови не менее 1,0 × 109/л и тромбоцитов — не менее и 100 × 109/л, при отсутствии экстрамедуллярных очагов лейкемического поражения [1][2]. Однако несмотря на достижение ПР, на разных сроках после окончания лечения у многих больных развиваются рецидивы, которые могут быть обусловлены персистенцией минимальной остаточной болезни (МОБ). МОБ называют популяцию опухолевых клеток, невыявляемую цитологическим методом, но которая может быть обнаружена чувствительными методами, такими как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и многоцветная проточная цитометрия (МПЦ), у больных в состоянии ПР. Термин «МОБ» в настоящее время заменяется термином «измеримая остаточная болезнь» [3]. Величина МОБ может быть дана в относительном выражении или процентном. Например, МОБ равная 10-3 (или 0,1 %) означает, что на тысячу нормальных клеток приходится одна опухолевая.

На рисунке 1 отображена динамика редукции доли опухолевых клеток у 4 больных острыми лейкозами, получающих терапию в рамках конкретного протокола. Морфологическую ремиссию констатируют, если доля бластных клеток в пунктате КМ не превышает 5 %. В конце индукции (точка I) у больного 1 морфологической ремиссии нет, а у больных 2, 3 и 4 она достигнута. Для этих больных целесообразно провести исследование МОБ, однако возникает вопрос — когда и каким методом.

Существует две тактики исследования МОБ: 1) оценка ответа на начальном этапе терапии для определения МОБ-ассоциированных групп риска; 2) последующий мониторинг МОБ у больных, у которых достигнута ПР, для обнаружения МОБ-рецидива и предсказания развития гематологического рецидива. Показано, что начальная кинетика редукции опухолевой массы имеет большую прогностическую значимость [4]. Величину остаточного опухолевого клона измеряют на ранних этапах терапии (например, +15 день), порой и до подтверждения ПР. Быстрый клиренс опухолевой массы и достижение МОБ-негативного статуса в ходе ранних этапов лечения ассоциируются с благоприятным прогнозом, тогда как персистенция МОБ при проведении терапии является неблагоприятным признаком.

В протоколе терапии острых лейкозов предусмотрено определение МОБ в конце индукции методом МПЦ. Например, на рисунке 1 это соответствует точке I, чувствительность метода составляет 0,01 %. Такое раннее определение МОБ часто проводится в протоколах терапии для детей. У больного 2 МОБ обнаруживается и составляет 0,11 %, а больные 3 и 4 имеют МОБ-негативный статус (так как количество остаточных клеток ниже предела чувствительности МПЦ). Впоследствии у больного 2 зафиксирован ранний рецидив, у больного 3 — поздний, а у больного 4 сохраняется ремиссия. Кроме того, рассчитывается количественный порог стратификации на этих точках: если у больного в данной точке терапии значение МОБ будет больше этого порога, то он относится к группе неблагоприятного прогноза. На рисунке 1 порог стратификации составляет 0,05 %, следовательно, больной 2 относится к группе неблагоприятного прогноза.

Длительный мониторинг МОБ на более отдаленных этапах терапии проводится у больных, у которых достигнуты ПР и МОБ-негативный статус. На рисунке 1 у больных 3 и 4 МОБ не выявилась в точке I (конец индукции), и им проведен дальнейший мониторинг в точке II (конец консолидации), а также точках III, IV и V поддерживающей терапии. У больного 4 сохраняется МОБ-негативный статус в течение всего периода. У больного 3 обнаружена МОБ в количестве 0,012 % в точке V, что предшествовало развитию морфологического рецидива (рис. 1).

Рисунок 1. Динамика количества опухолевых клеток в процессе терапии
Figure 1. Tumour cell count dynamics in therapy

Однако длительный мониторинг МОБ на отдаленных этапах (через год и более после начала терапии) сопряжен с определенными трудностями. Технологии поиска МОБ являются трудоемкими и дорогостоящими. Кроме того, отсутствие МОБ на отдаленных этапах терапии не является гарантией того, что рецидив в дальнейшем не разовьется [5]. Детекция МОБ может производиться разными методами, которые имеют свои особенности. Например, на рисунке 1 указаны методы МПЦ и ПЦР. Метод ПЦР более чувствителен, чем МПЦ, поэтому и на рисунке 1 чувствительность МПЦ представлена как 0,01 %, а ПЦР — 0,001 %.

Чувствительность методов определения МОБ

Аналитическая чувствительность любого лабораторного метода — это наименьшее количество вещества (наи­меньшая концентрация), которое можно обнаружить этим методом [6]. Применительно к детекции МОБ чувствительность метода можно описать как минимальное количество опухолевых клеток, которое можно обнаруживать с помощью данного метода. МОБ-негативность не означает, что опухолевых клеток нет вообще, и достигнуто полное отсутствие опухолевых клеток у больного. МОБ-негативность означает, что в образце не найдено опухолевых клеток при указанной чувствительности метода, и что опухолевые клетки могут персистировать, но в меньшем, чем чувствительность метода количестве. Поэтому и происходит смена понятия «минимальная остаточная болезнь» на термин «измеримая остаточная болезнь». Чувствительность метода определения МОБ может быть подсчитана в относительном выражении или процентном. Например, чувствительность 10-4 (или 0,01 %) означает, что возможно определить наличие 1 опухолевой клетки среди 10 000 нормальных клеток. Именно такая чувствительность требуется в большинстве протоколов терапии острых лейкозов [7].

Нарастает тенденция к внедрению в практику все более чувствительных методов, которые позволяют обнаружить меньшие количества опухолевых клеток. Например, секвенирование нового поколения (next generation sequencing, NGS) и проточная цитометрия следующего поколения (next generation flow, NGF) позволяют достичь чувствительности 10-7 (или 0,00001 %), т. е. найти одну опухолевую клетку на 10 млн нормальных [8][9][10]. Такие методы требуют высокой клеточности анализируемого образца: если клеток в образце всего 100 тысяч, чувствительности 10-7 достичь невозможно. С этим связаны сложности определения МОБ на ранних этапах терапии, когда нередко у больных наблюдается аплазия [7]. Детекция МОБ более чувствительными методами имеет свои преимущества. Например, на рисунке 1 ПЦР как более чувствительный метод позволил обнаружить опухолевые клетки в количестве 0,0011 % у больного 3 в точке I, тогда как результат обнаружения МОБ методом МПЦ — негативный. С другой стороны, это не имеет значения, т. к. пороговым количеством опухолевых клеток, на основании которого происходит стратификация больных в этом протоколе, является 0,05 % (рис. 1). Это означает, что детекция крайне низкого количества опухолевых клеток высокочувствительным методом должна быть клинически обоснована.

Прогностическая значимость МОБ. Пороговые значения МОБ

В разных протоколах приняты разные пороговые значения МОБ в зависимости от контрольной точки исследования, а также применяемого метода (МПЦ или ПЦР). Эти пороговые значения позволяют провести стратификацию больных на группы риска. Обычно определение МОБ для этого проводят на начальных этапах терапии (индукции или консолидации ремиссии), где в пределах одного протокола больные с быстрым клиренсом МОБ имеют более благоприятный прогноз, чем больные с медленным клиренсом и высокими значениями МОБ в контрольных точках.

Чтобы оценить влияние количественных показателей МОБ в конкретной точке протокола на частоту рецидивов, используют анализ выживаемости. По результатам такого анализа рассчитывают оптимальные пороговые значения МОБ, по которым можно выделить группы пациентов с разным риском развития рецидивов. В таблице 1 суммированы данные по пороговым значениям МОБ, полученные в разных исследованиях.

Таблица 1. Пороговые значения минимальной остаточной болезни по данным разных исследований
Table 1. Minimal residual disease cut-offs reported in published sources

Примечание. ПЦР — полимеразная цепная реакция, МПЦ — многоцветная проточная цитометрия, БСВ — бессобытийная выживаемость, ПР — полная ремиссия, ВРР — вероятность развития рецидива, БРВ — безрецидивная выживаемость, НД — нет данных или количественные данные не представлены.
Note. PCR — polymerase chain reaction, MFC — multicolour flow cytometry, EFS — event-free survival, CR — complete remission, PR — probability of relapse, RFS — relapse-free survival, ND — no data or quantitative data not provided.

Раннее определение количественных показателей МОБ и ранняя стратификация пациентов имеют свои преимущества. В протоколе терапии ОЛЛ для детей и подростков AIEOP-BFM ALL 2000 (NCT00613457) [25] исследование МОБ проводилось на 33-й и 78-й день терапии методом ПЦР, однако экспериментально МОБ оценивалась и на 15-й день методом МПЦ у 830 больных. По результатам исследования выявлено три группы больных: с количеством МОБ на 15-й день < 0,1 % (42 % от всей когорты больных); с МОБ от 0,1 до 10 % (47 % больных) и более 10 % (11 % больных). Пятилетняя кумулятивная вероятность рецидива у них составила 7,5, 17,5 и 47,2 % соответственно [16].

Эти данные были учтены в последующем исследовании AIEOP-BFM ALL 2009 (EudraCT Number: 2007-004270-43) [26], в котором проводилась рандомизация больных с целью изучения корректировки терапии в зависимости и от значения МОБ в том числе. У больных, не относящихся к высокому риску, с количеством опухолевых клеток в костном мозге < 0,1 %, определенном на 15-й день терапии методом МПЦ, проводилась редукция дозы даунорубицина на 50 %. У больных группы высокого риска, т. е. если МОБ методом ПЦР была > 10-3 на 33-й день и осталась позитивной на 12-й неделе, и/или если на 15-й день МОБ методом МПЦ была более 10 %, использовали терапевтическую тактику удлинения приема PEG-L-аспарагиназы [26].

Еще одним примером целесообразности раннего определения МОБ может служить исследование результатов терапии ОЛЛ у детей и подростков ALL-REZ BFM 2002 (NCT00114348) [27]. Согласно данному протоколу, больным с МОБ менее 10-3 в конце индукции (неделя 5), проводилась стандартная консолидация и поддерживающая терапия, а трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) рекомендуется только при наличии совместимого родственного донора. Если же значение МОБ в конце индукции составляет 10-3 и более, то больному выполняется ТГСК от родственного или неродственного совместимого донора. Результаты лечения по этому протоколу сравнили с данными предыдущего протокола ALL-REZ BFM P95/96 [28], в котором ТГСК проводили независимо от результатов МОБ в конце индукции. В группе больных с МОБ ≥ 10-3 вероятность бессобытийной выживаемости составила 64 % при лечении по протоколу ALL-REZ BFM 2002 и 18 % — по протоколу ALL-REZ BFM P95/96 (p < 0,001). Прицельное выполнение ТГСК улучшило прогноз у больных с медленной редукцией опухоли [28].

Таким образом, раннее исследование МОБ способствует ранней стратификации больных на группы риска и проведению корректировки химиотерапии. С одной стороны, если у больного произошел очень быстрый клиренс опухолевой массы (и на основании величины МОБ в контрольной точке установлен благоприятный прогноз), то возможно уменьшить дозы химиотерапевтических препаратов и тем самым снизить частоту развития неблагоприятных эффектов терапии. С другой стороны, когда скорость редукции опухолевых клеток низкая, и в контрольных точках выявляется большое количество МОБ, можно провести интенсификацию терапии, рассмотреть возможность смены препаратов или проведения ТГСК.

В протоколах терапии острых лейкозов у взрослых по результатам исследования МОБ также принимаются решения об изменении терапии, но в основном в отношении проведения ТГСК, а не коррекции терапевтических доз химиопрепаратов. В испанском исследовании PETHEMA ALL-AR-03 trial (NCT00853008) [29] кандидатами для ТГСК являются только больные, у которых высокие показатели МОБ, а не все больные, относящиеся к группе высокого риска. В протоколе GMALL 07/2003 (NCT00198991) [30] при персистенции МОБ > 10-4 в конце консолидации решается вопрос о ТГСК. В российском протоколе терапии Ph-негативных (Ph — Philadelphia chromosome, филадельфийская хромосома) ОЛЛ «ALL-2016» (NCT01193933) [31] сочетание начального лейкоцитоза и персистенция МОБ на 190-й день предусматривают решение вопроса о смене терапии и выполнении ТГСК.

Важным является вопрос о предтрансплантационном значении МОБ. Z. Shen и соавт. [32] провели метаанализ, включавший 21 исследование, посвященное влиянию МОБ непосредственно перед ТГСК у больных ОЛЛ. Эти исследования были опубликованы в 1998–2016 гг., а в качестве метода детекции МОБ применялись и МПЦ, и ПЦР. Анализ данных показал, что больные с МОБ-позитивным статусом перед ТГСК имели более высокий риск развития рецидива, чем больные с МОБ-негативным статусом (отношение рисков (ОР) составило 3,26; p < 0,05), а также меньшую продолжительность безрецидивной выживаемости (ОР = 2,53; p < 0,05) и общей выживаемости (ОР = 1,98; p < 0,05).

У больных ОМЛ наблюдается такая же закономерность: при выявлении МОБ перед ТГСК вероятность рецидива значимо выше, чем в случае отсутствия МОБ [33][34][35]. S. A. Buckley и соавт. [36] выполнили метаанализ, включивший 19 статей о влиянии МОБ при ОМЛ перед ТГСК, опубликованных в 2005–2016 гг. По результатам анализа, выявление МОБ перед ТГСК ассоциировано с более высоким риском развития рецидива и худшей общей выживаемостью.

Таким образом, во многих протоколах предусмотрено проведение ТГСК у больных с персистирующей МОБ на определенном этапе терапии. Однако выполнение ТГСК в МОБ-позитивном статусе ассоциировано с неблагоприятным прогнозом, а именно — высоким риском рецидива в посттрансплантационном периоде. Поэтому проводится разработка терапевтических тактик, позволяющих добиться МОБ-негативности с последующим проведением ТГСК. Например, в исследовании ALL-REZ BFM 2002 [27] больным с МОБ ≥ 10-3 перед ТГСК были проведены интервенционные блоки химиотерапии, и в 78 % случаев произошла редукция МОБ. Однако значимого уменьшения вероятности рецидива после ТГСК не достигнуто [37]. Более перспективным представляется применение иммунотерапии. Показана эффективность применения блинатумомаба у взрослых больных В-ОЛЛ с персистирующей МОБ (n = 113). Элиминация остаточных опухолевых клеток после 1-го цикла терапии была достигнута у 88 (78 %) больных, и 55 больным была проведена ТГСК. Медиана безрецидивной выживаемости для МОБ-негативных больных составила 23,6 месяца, для МОБ-позитивных — 12,5 месяца (p = 0,002). Авторы пришли к выводу, что такие результаты выгодно отличаются от ранее опубликованных данных для больных с МОБ-позитивным статусом или рефрактерными ОЛЛ [38].

В некоторых протоколах терапии ОЛЛ для больных детского возраста проводится анализ МОБ на очень ранних этапах терапии. У детей больных ОЛЛ с ранней МОБ-негативностью риск развития рецидива крайне низкий, поэтому длительный мониторинг МОБ на отдаленных этапах терапии, ассоциированный с инвазивной процедурой забора КМ, у них нецелесообразен. У взрослых больных ситуация иная: даже при достижении ранней МОБ-негативности риск развития рецидива довольно высок и достигает 20–30 % [4][12][39].

Мониторинг МОБ после достижения больным МОБ-негативности также может быть полезен в качестве предиктивного метода обнаружения развивающегося рецидива. В исследовании N. Pemmaraju и соавт. [40] с 2003 по 2014 гг. ОЛЛ диагностировали у 647 взрослых больных, среди них МОБ-негативности, которую определяли МПЦ, достигли 536 (91 %) больных. У МОБ-негативных больных был продолжен мониторинг МОБ в ПР на отдаленных этапах терапии, и у 55 из них была обнаружена МОБ, то есть выявлен МОБ-рецидив. Медиана времени до МОБ-рецидива составила 14 месяцев (разброс от 3 до 58 месяцев). У 44 (80 %) больных в дальнейшем развился морфологический рецидив. Медиана продолжительности сохранения ПР после МОБ-рецидива составила 3 месяца (разброс: < 1–33 месяца). У 49 из 55 больных с МОБ-рецидивом до развития морфологического рецидива проводилась терапия: у 16 больных продолжили поддерживающую терапию в соответствии с протоколом, у 15 больных провели интенсифицированную терапию, у 9 больных сменили терапию и включили неларабин, блинатумомаб или ритуксимаб, и у 9 больных выполнили ТГСК. При сравнении этих терапевтических подходов не было получено достоверных отличий по общей выживаемости, однако выборки больных были небольшими [40].

Основываясь на представленных данных, целесообразно проведение оценки МОБ у взрослых больных, по крайней мере ОЛЛ, через каждые 3 месяца до конца поддерживающей терапии [4][40][41].

Таким образом, определение МОБ интегрировано в протоколы терапии и проводится в определенные контрольные точки определенным методом. Нельзя пороговые значения МОБ, полученные на одном протоколе, автоматически переносить на другой. При разработке нового протокола или режима химиотерапии необходимо проводить проспективные исследования и определять пороговые значения и контрольные точки, а не заимствовать их из других протоколов. Методы оценки МОБ в российских протоколах терапии острых лейкозов у взрослых представлены в таблице 2.

Таблица 2. Исследование минимальной остаточной болезни в российских протоколах терапии острых лейкозов у взрослых
Table 2. Minimal residual disease estimation in national treatment protocols for acute leukaemia in adults

Примечание. ОЛЛ — острый лимфобластный лейкоз, МПЦ — многоцветная проточная цитометрия, ПЦР — полимеразная цепная реакция, ТГСК — трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, ОМЛ — острый миелоидный лейкоз, ОПЛ — острый промиелоцитарный лейкоз.
Note. ALL — acute lymphoblastic leukaemia, MFC — multicolour flow cytometry, PCR — polymerase chain reaction, HSCT — haematopoietic stem cell transplantation, AML — acute myeloid leukaemia, APL — acute promyelocytic leukaemia.

Сопоставление количества бластных клеток, определенных разными методами

МОБ — это опухолевые клетки, которые можно обнаружить чувствительными методами у больных, у которых достигнута ПР, которая устанавливается при наличии в пунктате КМ менее 5 % бластных клеток. Тогда вызывает недоумение тот факт, что в протоколе AIEOP-BFM ALL 2000 [25] неблагоприятным прогностическим фактором явилась МОБ более 10 % в КМ на 15-й день, определенная методом МПЦ. В данном исследовании [16] сравнивались результаты МОБ с количеством бластных клеток, определенных морфологическим методом. Была показана хорошая корреляция между этими показателями, однако были и случаи несоответствия данных. С одной стороны, МОБ < 0,1 % была получена у 295 больных, при этом у 48 (16,3 %) из них количество бластных клеток было > 5 %, т. е. ПР фактически отсутствовала. С другой стороны, МОБ ≥ 10 % определялась у 76 больных, при этом у 19 (25 %) из них бластных клеток было меньше 5 %, т. е. морфологическая ремиссия была достигнута, но вероятность рецидива у них была 36,8 % [16]. Такие несоответствия данных можно объяснить:

1. Разведение КМ периферической кровью. Содержание миелокариоцитов в первой порции пунктата КМ превышает клеточность второй порции в 3 и более раза [42]. Значительная примесь крови меняет соотношение субпопуляций клеток, и доля бластных клеток не может быть точно подсчитана. Поэтому для мониторинга МОБ рекомендуется исследование первой порции КМ объемом 0,5–1 мл.

2. Неудовлетворительное качество мазков КМ, когда подсчет бластных клеток затруднен, особенно при гипоплазии КМ.

3. Интенсивное восстановление кроветворения, при котором количество бластных клеток в пунктате КМ может быть больше 5 %, а МОБ может быть очень низкой или не определяться вообще. В этом случае бластные клетки, которые определяются морфологически, вероятнее всего являются нормальными гемопоэтическими предшественниками, а не опухолевыми клетками.

Детекция МОБ методом ПЦР и методом МПЦ показала большую прогностическую значимость во многих протоколах терапии острых лейкозов. Однако в рамках одного протокола обычно используют только один из этих методов. Несмотря на это, имеются данные, сравнивающие результаты МОБ, полученные одно­временно разными методами. При сравнении оценки МОБ методом ПЦР и методом МПЦ обычно получают высокую сопоставимость данных (около 90 %). Лишь в небольшой группе больных положительный результат МОБ был получен только одним методом. Объяснения данного явления могут быть сведены к следующим причинам:

1) Различия в чувствительности методов. ПЦР обычно более чувствителен, чем МПЦ.

2) Некоторые опухолевые клетки проходят стадию апоптоза, при этом, так как они содержат ДНК, результат ПЦР будет положительным, а метод МПЦ, исключая их из анализа, дает отрицательный результат;

3) Смена иммунофенотипа приводит к отрицательным результатам МПЦ при положительных данных ПЦР;

4) Подбор пациент-специфичных праймеров к минорной опухолевой субпопуляции, которая элиминируется в ходе терапии, приводит к отрицательным результатам ПЦР и положительным — МПЦ [43][44].

Несоответствия результатов можно получить и между двумя вариантами мониторинга МОБ методом ПЦР. В исследовании L. Hovorkova и соавт. [45] изучали МОБ у детей с Ph+ ОЛЛ тремя методами: ПЦР с пациент-специфичными праймерами к химерному гену BCR-ABL1 (то есть мониторировали уровень ДНК, а не РНК), к перестройкам генов иммуноглобулина/Т-клеточного рецептора (ИГ/ТКР) и к делеции гена IKZF1. Была отмечена хорошая корреляция между этими тремя методами у большинства больных, однако у более 20 % больных количество химерного гена BCR-ABL1 значительно (> 1 log) превышало количество перестроенных генов ИГ/ТКР и гена IKZF1 с делецией. Авторами [45] была проведена сортировка клеточных субпопуляций и оценена частота выявления гена BCR-ABL1 в них с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ. Оказалось, что у больных с несовпадающими результатами ПЦР BCR-ABL1 определялся также в зрелых В- и Т-лимфоцитах и миелоидных клетках [45]. Аналогичные результаты были получены и в других исследованиях [46][47][48].

В исследовании H. Inaba и соавт. [49] в рамках протокола AML02 (NCT00136084) [50] было получено, что практически все (308 из 311) ПЦР-негативные образцы также были МПЦ-негативны. Однако только 19 из 197 (9,6 %) ПЦР-позитивных по RUNX1-RUNX1T1 и CBFβ-MYH11 образцов были МПЦ-позитивны. В данном исследовании только данные МПЦ имели прогностическую значимость после курсов индукции 1 и 2, тогда как результаты ПЦР такого значения не имели [49].

Таким образом, определение МОБ при острых лейкозах стало обязательным направлением научно-клинических исследований. Количественные значения МОБ используют для стратификации больных на группы риска по глубине ответа на терапию и прогнозирования развития рецидива. Несмотря на многочисленные исследования МОБ, необходимо учитывать, что пороговые значения МОБ, определяющие различные прогностические группы больных, применимы только в рамках того протокола, в котором они были получены.