Минорные антигены гистосовместимости как мишени Т-клеточной иммунотерапии

Введение

Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) является «золотым стандартом» терапии острых миелоидных (ОМЛ) и лимфобластных (ОЛЛ) лейкозов [1]. Однако приблизительно у половины больных после алло-ТГСК развивается рецидив заболевания [2–6], что делает актуальной разработку методов терапии рецидивов [7–9]. Терапевтический эффект алло-ТГСК в значительной степени обусловлен реакцией «трансплантат против лейкоза» (РТПЛ), при которой лимфоциты донора уничтожают злокачественные клетки реципиента, пережившие кондиционирование [10–12]. В то же время аллореактивные лимфоциты донора могут атаковать здоровые ткани реципиента, приводя к реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) [13–15]. При алло-ТГСК, при которой донор и реципиент не полностью совместимы по лейкоцитарным антигенам человека (Human Leukocyte Antigen, HLA), иммунный ответ развивается за счет донорских Т-лимфоцитов, которые распознают клетки реципиента, несущие аллогенные аллели HLA [16]. Такое распознавание обусловлено кросс-реактивностью Т-лимфоцитов, содержащихся в популяции клеток памяти [17]. Однако иммунный ответ может возникать и при полностью HLA-совместимой алло-ТГСК, при которой мишенью иммунного ответа являются минорные антигены гистосовместимости (МАГ) [18–20] — полиморфные пептиды, презентируемые в молекулах HLA, которые являются продуктами генов, содержащих несинонимичные однонуклеотидные полиморфизмы (нсОНП). При отсутствии у донора одной из аллельных форм пептида к ней не развивается иммунологическая толерантность, соответственно, среди всего разнообразия донорских лимфоцитов могут встречаться те, которые имеют Т-клеточные рецепторы (ТКР), специфичные к данному пептиду. При попадании таких лимфоцитов в организм реципиента, имеющего иммунологически чужеродную аллельную форму пептида, может возникать аллогенный иммунный ответ. Т-лимфоциты, специфичные к МАГ, преимущественно встречаются среди популяции наивных клеток [21].

Аллогенный иммунный ответ имеет двойственный эффект: с одной стороны, развитие РТПЛ способствует благоприятному исходу алло-ТГСК, с другой, — РТПХ поражает здоровые ткани организма и является потенциально жизнеугрожающим осложнением алло-ТГСК. Долгое время оставался открытым вопрос, насколько взаимосвязаны эти явления. По данным исследований [22–24], у больных с острой или хронической РТПХ рецидивы ОМЛ и ОЛЛ возникают значительно реже. При трансплантации аутологичных или сингенных стволовых клеток, при которой отсутствует риск развития РТПХ, вероятность рецидива заболевания существенно выше, чем при алло-ТГСК, что связано с отсутствием РТПЛ [23][25]. Более поздние исследования показали зависимость между возникновением РТПХ и степенью генетического различия пары «донор — реципиент». Ретроспективный анализ 32 828 больных, которым была выполнена алло-ТГСК, в котором напрямую учитывались различия по HLA и косвенно — по минорным антигенам, показал уменьшение летальности, не связанной с рецидивом заболевания, при уменьшении различий между донором и реципиентом [26]. Позитивный терапевтический эффект алло-ТГСК, выраженный в безрецидивной выживаемости, не зависел от степени различия пар «донор — реципиент» по HLA. Это свидетельствует, что РТПЛ может быть отделена от РТПХ, а МАГ можно использовать в качестве мишеней иммунного ответа для профилактики рецидивов [27].

Цель настоящего обзора — анализ литературы, описывающей иммунный ответ на различные МАГ, а также клинические испытания, использующие МАГ как мишень иммунотерапии.

История изучения МАГ

Впервые МАГ описаны в 1975 г. [28]. Было установлено, что иммунизация мышей гемопоэтическими клетками, полученными от другой линии мышей, идентичной по локусу главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), но при этом отличающейся по другим генам, приводит к иммунному ответу. Цитотоксичность полученных линий Т-лимфоцитов подтверждена in vitro. Был сделан вывод, что существуют некие антигены гистосовместимости, не закодированные в локусе ГКГС. Распознавание этих антигенов обеспечивается Т-лимфоцитами, деплеция Т-лимфоцитов перед трансплантацией позволяет избежать летальности у мышей-реципиентов [29][30]. Одной из важнейших вех стало открытие функции молекул ГКГС в презентации пептидных антигенов Т-лимфоцитам, как чужеродных, так и происходящих из собственных белков организма [31]. Было показано, что МАГ представляют собой презентируемые в контексте ГКГС I аутологичные пептиды, различающиеся по аминокислотной последовательности у донора и реципиента за счет несинонимичных полиморфизмов [32].

Возникновение РТПХ у больных после полностью HLA-совместимой алло-ТГСК подтвердило наличие антигенов гистосовместимости, отличных от HLA и у человека [33, 34]. За счет различия по МАГ вероятность возникновения РТПХ при трансплантации от неродственного HLA-совместимого донора выше, чем при трансплантации от HLA-идентичного сиблинга [35]. Аллореактивные Т-клетки донора способны распознавать различия в одну единственную аминокислоту в последовательности пептида и инициировать иммунный ответ [36]. Для иммунной системы донора отсутствующие в его организме аллели минорных антигенов являются чужеродными, специфичные к ним ТКР не подвергаются негативной селекции в тимусе и толеризации на периферии, в отличие от Т-клеток, специфичных к аутологичным аллельным вариантам, что было показано в экспериментальной модели на мышах [37]. Таким образом, у доноров, не имеющих конкретного аллеля минорного антигена, могут встречаться Т-лимфоциты, специфически распознающие кодируемый им пептид [38].

Был описан [39] первый аутосомный минорный антиген человека, который был назван НА. Несоответствие по этому антигену привело к развитию РТПХ, возникшей после трансплантации от HLA-совместимой сестры к брату. HA антиген не был связан с Y-хромосомой, группой крови, резус-фактором и белками комплемента. Установлено, что этот антиген презентируется в наиболее распространенном у европейцев аллеле HLA — HLA-A2*02. Полученные клоны цитотоксических Т-лимфоцитов распознавали гемопоэтические клетки большинства доноров, несущих этот аллель HLA, что свидетельствовало о высокой частоте встречаемости антигена HA в популяции. В дальнейшем были обнаружены другие минорные антигены человека, как связанные с Y-хромосомой, так и аутосомные [40]. Анализ иммунного ответа in vitro цитотоксических клонов, специфичных к 5 МАГ (НА-1–НА-5), на клетки здоровых доноров показал, что МАГ встречаются с различной частотой: например, антигены HA-2 и НА-3 встречались повсеместно в исследованной популяции, в то время как НА-4 и НА-5 были очень редки. Частота встречаемости антигена НА-1 была около 70 %. Частота обнаружения цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к HA-1, после несовместимой по этому антигену алло-ТГСК была существенно больше, чем для других антигенов. Авторы пришли к выводу, что существует феномен иммунодоминантности МАГ, а НА-1 является наиболее иммуногенным из изученных антигенов, за счет чего при несовпадении между донором и реципиентом по НА-1 иммунный ответ направлен преимущественно на этот антиген [41].

Изучение специфичности цитотоксических клонов, полученных от больных с РТПХ, подтвердило феномен иммунодоминантности: при HLA-несовместимой трансплантации цитотоксические клоны обладали специфичностью к несовместимой молекуле HLA, при полностью HLA-совместимой трансплантации, несовместимой по НА-1, все выделенные аллореактивные клоны были специфичны к НА-1, а при совместимости по HLA и НА-1 иммунный ответ развивался на антигены Y-хромосомы [42]. Таким образом, иммунный ответ на аллоантигены иерархичен: подавляющее большинство образующихся аллореактивных клонов цитотоксических Т-лимфоцитов специфично к наиболее иммунодоминантному антигену, на субдоминантные антигены в таком случае иммунный ответ практически не развивается. Иерархичность иммунного ответа на МАГ подтверждена у мышей [43]. Установлено, что Т-клеточные клоны, специфичные к иммунодоминантным МАГ, способны уничтожать клетки лейкоза у мышей, в то время как клоны, специфичные к субдоминантным МАГ, не способны оказать противоопухолевого действия [44]. Число иммунодоминантных антигенов невелико: примерно 0,5 % от пептидов, теоретически способных связаться с HLA (Kd < 500 nM), обладают достаточной аффинностью для иммунодоминантности (Kd < 50 nM), однако из-за неэффективного процессинга антигена, а также отсутствия в организме ТКР к некоторым пептидным антигенам, количество иммунодоминантных пептидов оценивается еще ниже, примерно в 0,2 % от потенциально презентируемых пептидов [45].

Один из механизмов иммунодоминантности — конкуренция пептидов за связывание с HLA. Данный феномен наблюдается, только если доминантный и субдоминантный антиген экспрессируется в одном типе клеток [46] и презентируются одним и тем же аллельным вариантом HLA. Иммунодоминантным в таком случае является антиген, который имеет наибольшую аффинность связывания с HLA [47, 48]. Другой возможный механизм возникновения иммунодоминантности МАГ — сильно различающаяся частота встречаемости специфичных ТКР из-за различной вероятности их образования в процессе соматической рекомбинации. Это было показано на примере мышиного минорного антигена B6dom1, который был более иммунодоминантным, чем Н3 и Н13, хотя аффинность связывания с ГКГС этих антигенов приблизительно одинакова [49]. Была проведена оценка разнообразия бета-цепей ТКР, специфичных к этим МАГ, среди наивных Т-клеток мышей, не имевших аллеля МАГ. Выяснилось, что разнообразие B6dom1-специфичных ТКР бета-цепей значительно выше.

Иммунодоминантность МАГ наблюдается и в клинической практике. В исследовании [50] были проанализированы 327 HLA-совместимых ТГСК. Пары «донор — реципиент» были генотипированы по 17 МАГ, презентирующимся в 6 разных аллельных вариантах HLA. Исследование подтвердило, что несовпадение по аутосомным МАГ ассоциировано с более низкой частотой рецидива как после трансплантации от родственного, так и неродственного донора. Установлена корреляция между несовпадением по Y-хромосомным МАГ и возникновением РТПХ, при этом подобная корреляция для аутосомных МАГ не установлена. О роли МАГ-специфичных лимфоцитов в развитии РТПЛ свидетельствует тот факт, что у 10–33 % реципиентов с помощью окраски HLA-тетрамерами в крови были обнаружены донорские МАГ-специфичные клетки, при этом их наличие было ассоциировано с лучшей безрецидивной выживаемостью. Однако иммуногенность МАГ сильно различалась. CD8+ Т-клетки, специфичные к НA1, HA2, PANE1, LRH1, ACC1, и к Y-хромосомным МАГ HY.A2 и HY.B7, были обнаружены у 25–60 % реципиентов с несовместимостью по МАГ. HA8, SP110, и ZAPHIR вызывали иммунный ответ у 10–20 % реципиентов. В этом исследовании T-клеточный ответ на МАГ ADIR, HwA11, ECGF, HEATR и HY.B8 не был обнаружен, несмотря на генетические различия. Таким образом, не все существующие МАГ одинаково способны вызывать иммунный ответ, и нет однозначных методов предсказания их иммуногенности; детекция иммунного ответа in vivo — единственный надежный критерий [51].

Механизм возникновения МАГ

Существует несколько механизмов возникновения МАГ. Первые описанные МАГ — это производные генов, закодированных на Y-хромосоме: в женском организме эти гены отсутствуют, и при алло-ТГСК от донора-женщины реципиенту-мужчине возможно их распознавание и развитие РТПХ [52]. Однако большая часть описанных МАГ кодируется полиморфизмами в аутосомных генах (рис. 1). Трансляция белков сопровождается образованием определенной доли дефектных рибосомальных продуктов [53] по нескольким механизмам: трансляция пре-сплайсированной мРНК [54], трансляция мРНК, подвергающейся деградации при регуляторной РНК-интерференции [55] или трансляции некодирующих участков генома [56]. Дефектные рибосомальные продукты, а также неправильно свернутые белки и белки с истекшим жизненным сроком убиквитинилируются [57], а затем расщепляются протеасомой на пептиды длиной 4–20 аминокислот [58][59]. Полученные пептиды транспортируются белком-транспортером, связанным с процессингом антигена (Transporter associated with antigen processing, TAP) в эндоплазматический ретикулум [60], где они могут связываться с одним из аллельных вариантов моолекулы HLA, а затем презентироваться на поверхности клетки [61]. Если презентируемый пептид содержит полиморфную аминокислоту, образуется потенциальный МАГ. При этом возможны два различных варианта:

1. Оба пептида, кодируемых различными аллельными вариантами, проходят все стадии до презентации в HLA. Такие МАГ являются кодоминантными — оба вариантных пептида видимы для иммунной системы и потенциально иммуногенны.
2. Аминокислотная замена препятствует презентации одной из аллельных форм пептида в HLA. Такие МАГ являются доминантно-рецессивными — иммуногенностью обладает только один (презентирующийся) аллельный вариант.

Подавляющее большинство минорных антигенов доминантно-рецессивные, доля кодоминантных МАГ оценивается в 7 % [62]. Аминокислотная замена может повлиять на любой из этапов вывода пептида на поверхность клетки. Альтернативный аллельный вариант минорного антигена НА-3 расщепляется протеасомой на более мелкие фрагменты [63], альтернативный аллель НА-8 не взаимодействует с транспортером TAP [64], а альтернативный пептид НА-1 не презентируется за счет того, что он не обладает достаточной аффинностью связывания с HLA-A*02:01 [65].

По результатам анализа публично доступных геномных данных (проект «1000 геномов»), 90 % МАГ происходят из несинонимических однонуклеотидных полиморфизмов при сохранении функциональности обоих аллельных вариантов исходного белка [62]. Однако существуют и другие механизмы: минорный антиген может возникнуть, если один из аллелей гена содержит инсерцию/делецию (LRH-1) [66] или дополнительный стоп-кодон (PANE1) [67]; имеет нарушение в сплайсинге, приводящее к трансляции интрона (ZAPHIR) [68], делецию экзона (ACC-6) [69] и, наконец, в результате делеции всего гена (UGT2B17/A2) [70]. Детально генетические механизмы формирования МАГ описаны в обзоре [71]. В отдельных случаях иммуногенностью может обладать только пептид, имеющий определенную посттрансляционную модификацию, что было показано на примере цистеинилированного пептида белка SMCY из Y-хромосомы [72]. Показано [73], что 0,5 % всех нсОНП, различных между двумя сиблингами, приводили к тому, что вариантный пептид был представлен в иммунопептидоме, в то время как иммуногенностью обладали 0,22 %. При этом отсутствие иммунного ответа на один из аллельных вариантов МАГ не всегда объясняется тем, что пептид не презентируется в HLA. Исследовались [74] три МАГ: LB-CLYBL-1Y, LB-NISCH-1A и LB-SSR1–1S, считающихся доминантно-рецессивными. С помощью оценки связывания меченых пептидов с HLA на поверхности клеточной линии Т2 (неспособной презентировать эндогенные пептиды) показано, что для всех антигенов аффинность связывания с HLA обоих аллельных вариантов пептидов идентична. При этом клоны Т-лимфоцитов, специфичные к иммуногенному аллельному варианту, не распознавали альтернативный пептид. Таким образом, отсутствие иммуногенности в этом случае объясняется, наиболее вероятно, отсутствием у доноров Т-лимфоцитов, способных распознавать эти антигены, что может быть результатом негативной тимусной селекции.

Большинство описанных МАГ презентируется в HLA I класса, однако минорные антигены могут презентироваться и в HLA II класса за счет презентации аутологичных пептидов, захваченных извне. Описано [75] возникновение РТПЛ, мишенью которой были минорные антигены, презентируемые в HLA II класса. С одной стороны, HLA II класса экспрессируются преимущественно в гемопоэтических клетках, и иммунный ответ на презентируемые ими МАГ может вызывать селективную РТПЛ в отсутствие РТПХ. С другой стороны, экспрессия HLA II класса в опухолевых клетках часто подавляется как механизм ускользания от иммунного ответа [76, 77], за счет того, что потеря HLA-II, в отличие от потери HLA-I, не вызывает цитотоксического ответа со стороны NK-клеток [78]. В качестве мишеней для иммунотерапии представляют интерес скорее минорные антигены, презентируемые в HLA I класса.

Биоинформатический анализ геномов предсказывает тысячи полиморфизмов, способных кодировать минорные антигены, представляемые в наиболее частых аллелях HLA I класса [56, 62]. В настоящее время описано относительно небольшое их количество — в обзоре [71] упоминаются 48 минорных антигенов HLA I класса и 8 минорных антигенов HLA II класса. Исследование В-лимфобластоидных линий с секвенированным геномом из проекта «1000 геномов» увеличило количество известных МАГ I класса до 63 [79].

Поиск новых минорных антигенов методами «прямой иммунологии» — через выявление мишеней естественного возникающего иммунного ответа — затруднен за счет феномена иммунодоминантности [42]. При HLA-совместимой неродственной алло-ТГСК степень различия по МАГ в 2 раза больше, чем при HLA-совместимой трансплантации от сиблингов, однако она несет значительно меньший риск возникновения РТПХ, чем единственное несовпадение по одному из аллелей HLA-DP [80, 81]. Хотя количество несовпадений по несинонимичным полиморфизмам напрямую не коррелировало с тяжестью РТПХ, возникновение в 60 % случаев острой РТПХ и в 40 % случаев хронической РТПХ после трансплантации от родственного HLA-совместимого донора вызвано ответом на МАГ [80][81]. При трансплантации от полностью HLA-совместимого донора иммунный ответ ограничивается небольшим количеством наиболее иммунодоминантных МАГ, а различия по субдоминантным МАГ никак не проявляются.

Методы «обратной иммунологии» — с помощью проверки иммуногенности предсказанных МАГ — также оказываются не очень результативными. Полученные in vitro Т-клеточные клоны, распознающие экзогенные пептиды, предсказанных МАГ, не были способны распознать эндогенный пептид во всех случаях, кроме уже открытого МАГ НА-1 [82]. После открытия 50 терапевтически значимых МАГ для 35 % алло-ТГСК становится возможным использование МАГ-специфичной терапии [83].

Преимущества и недостатки МАГ как мишеней для иммунотерапии

Свидетельства роли МАГ в развитии РТПЛ подтолкнули к идее использования МАГ-специфичного иммунного ответа для разработки метода терапии лейкозов, не приводящего к развитию РТПХ [27][33]. Наиболее перспективными мишенями являются МАГ, происходящие из генов преимущественно или исключительно экспрессирующихся в гемопоэтической ткани, что позволит исключать вероятность развития РТПХ [84]. Показано [85], что МАГ-специфичные CD8+ Т-клоны, выделенные от больных с РТПЛ, но без РТПХ, обладают сниженной способностью распознавать негемопоэтические клетки реципиентов, по сравнению с лимфоцитами, полученными от больных с РТПХ. При этом количество тканеспецифичных МАГ крайне невелико: из 6000 проанализированных потенциальных МАГ лишь 39 специфично экспрессированы в гемопоэтической ткани [86].

МАГ обладают рядом преимуществ по сравнению с другими мишенями для терапии лейкозов [87]. МАГ представляют собой антигены, ранее не встречавшиеся с иммунной системой донора, и потому потенциально обладают большей иммуногенностью, чем опухоль-ассоциированные антигены — аберрантно экспрессированные в злокачественных клетках аутологичные белки. Таким образом, по иммуногенности МАГ соотносятся с опухолевыми неоантигенами — продуктами опухоль-специфичных мутаций в белок-кодирующих регионах, а также вирусными антигенами. По сравнению с неоантигенами, МАГ обладают тем преимуществом, что, во-первых, презентируются на всех опухолевых клетках, независимо от образования субклонов; во-вторых, не являются уникальными для конкретного больного. Следовательно, МАГ-специфичная терапия не является полностью персонализированной. Пары «донор — реципиент» легко генотипировать на отдельные МАГ или их панели [88]. Количество мутаций в лейкозах невелико, и неоантигены возникают значительно реже, чем в других типах опухолей [89], что делает МАГ особенно привлекательными именно для лечения этого типа злокачественных заболеваний.

МАГ имеют преимущество и перед поверхностными клеточными маркерами, как например CD19, являющимся маркером B-лимфоцитов и В-клеточных опухолей. CD19 — наиболее широко используемый антиген для Т-клеток с химерным антигенным рецептором (Chimeric Antigen Receptor T-cells, CAR-T) [90]. CAR-T-терапия показала высокую эффективность при лечении В-клеточных лейкозов, однако при ее проведении элиминируются в том числе здоровые В-клетки, что приводит к В-клеточной аплазии и увеличению риска инфекционных осложнений [91]. МАГ-специфичная терапия лишена этих ограничений, поскольку она селективно уничтожает клетки реципиента, не затрагивая клетки крови, происходящих из донорских гемопоэтических клеток. Несмотря на успехи в лечении CD19-положительных опухолей, CAR-T-терапия демонстрирует ограниченную применимость в лечении лейкозов миелоидного происхождения [92]. МАГ-специфичная терапия может быть универсальной для различных лейкозов. Однако МАГ как мишень для терапии опухолей имеет ограничения. Во-первых, МАГ-специфичная терапия может применяться только в контексте алло-ТГСК. Во-вторых, поскольку МАГ презентируются в конкретных аллелях HLA, МАГ-специфичную терапию можно использовать только у больных-носителей конкретного аллеля HLA. Обязательным условием является несовпадение по МАГ между донором и реципиентом. Для использования МАГ как терапевтической мишени необходимо, чтобы донор имел генотип МАГ^–/–, а реципиент — МАГ^+/+ или МАГ^+/–. Максимальная доля иммуногенных несовпадений по конкретному МАГ составляет 25 %, что происходит при частоте иммуногенного аллеля в популяции 0,3 [62]. Лишь 10–15 % иммуногенных полиморфизмов имеют частоту, близкую к 0,3, и перспективны для клинического применения. Существует вероятность, что опухоль будет «ускользать» от иммунного ответа за счет выключения экспрессии гена, кодирующего МАГ или HLA, его презентирующего. Описано, что при трансплантации от HLA-несовместимого донора под действием клонального отбора клетки опухоли способны терять экспрессию HLA [93]. Аналогичный механизм может сделать их невидимыми и для МАГ-специфичных Т-клеток донора.

Перспективные для клинического использования МАГ

НА-1 — наиболее изученный минорный антиген. Он экспрессируется в здоровых гемопоэтических клетках и в клетках многих лейкозов, включая ОМЛ, миелодиспластические синдромы, Т- и В-клеточные ОЛЛ [87][94]. Пептид HA-1H (VLHDDLLEA) — продукт гена ARHGAP45, имеющего аденозиновый вариант однонуклеотидного полиморфизма (rs1801284, база данных dbSNP), презентирующийся на поверхности клетки в ассоциации с HLA-A*02:01 [36]. Индивиды с генотипом rs1801284 A/A или A/G имеют гистидиновый вариант (HA-1H, также называемый HA-1) и считаются HA-1-положительными. Напротив, HA-1-отрицательные лица с генотипом G/G имеют только аргининовый аллельный вариант (HA-1R, VLRDDLLEA), в связи с чем они могут иметь Т-клетки, специфичные к HA-1H. HA-1H и HA-1R образуются при расщеплении протеасомой белка ARHGAP45, оба пептида транспортируются в эндоплазматический ретикулум с помощью транспортера TAP [95]. Однако присутствие аргинина в третьей аминокислоте пептида значительно снижает аффинность связывания VLRDDLLEA с HLA-A*02:01 по сравнению с VLHDDLLEA [65], а HA-1H-специфические Т-клетки не распознают VLRDDLLEA при концентрациях пептида, которые в норме присутствуют на клетках. Следовательно, HA-1-специфические Т-клетки могут быть использованы после алло-ТГСК для избирательного уничтожения клеток лейкоза у HA-1-положительного больного без повреждения HA-1-отрицательных здоровых донорских гемопоэтических клеток. Примерно 50 % населения имеют HLA-A*02:01, а аллельные варианты HA-1 фенотипически сбалансированы в популяции (rs1801284 A/A 16 %, A/G 36 %, G/G 48 %). Таким образом, 52 % являются HA-1-положительными, 48 % — HA-1-отрицательными [87], а 25 % трансплантаций имеют иммуногенное несоответствие.

Остается открытым вопрос о связи минорного антигена НА-1 и РТПХ и, следовательно, безопасности, основанной на НА-1-терапии. Экспрессия источника пептида НА-1 — белка HMHA1 — практически отсутствует или происходит на очень низком уровне в негемопоэтических клетках [94][96]. В условиях in vitro HA-1-реактивные Т-клеточные клоны распознавали HA-1+ гемопоэтические клетки, но не распознавали негемопоэтические клетки с тем же генотипом [97]. Было показано отсутствие реактивности НА-1-специфичных клонов на образцы биопсии кожи из НА-1-позитивных доноров [98].

После алло-ТГСК HA-1-отрицательного донора HLA-A*02:01 и HA-1-положительному реципиенту HA-1-специфические Т-клетки были идентифицированы примерно у трети больных [50]. Сообщено о взаимосвязи между наличием HA-1-специфических Т-клеток и РТПХ, возникающей непосредственно после алло-ТГСК [99]. Однако HA-1-специфические T-клетки были идентифицированы также и у больных без РТПХ после алло-ТГСК с последующей инфузией донорских лимфоцитов [85][100].

Таким образом, в ряде работ иммунный ответ на НА-1 связывают с РТПХ [20][99][101–103]. В других исследованиях такой связи не находят [104–107]. Одним из возможных объяснений такого противоречия является то, что после алло-ТГСК гемопоэтические клетки реципиента в течение еще нескольких месяцев находятся в тканях до полного замещения гемопоэтическими клетками донора [87]. Для развития РТПХ CD8+ Т-лимфоцитам необходим прямой контакт с клетками-мишенями [108][109]. НА-1-специфичные Т-клоны, возникшие из наивных предшественников в условиях in vivo, могут мигрировать в ткани и атаковать гемопоэтические клетки реципиента, вызывая иммунный ответ на другие антигены [110]. Однако возникновение РТПХ менее вероятно при инфузии донорских лимфоцитов спустя несколько месяцев после алло-ТГСК [111] или при использовании генетически модифицированных лимфоцитов, имеющих рецептор с одной единственной специфичностью.

Уменьшение частоты развития РТПХ при отсрочке введения донорских лимфоцитов было показано и в экспериментах на мышах [112]. Уменьшенный риск возникновения РТПХ при отложенной инфузии донорских лимфоцитов объясняют также повышенным в первые месяцы после алло-ТГСК содержанием воспалительных цитокинов, облегчающим активацию МАГ-специфичных лимфоцитов донора [85]. У больных с РТПХ иммунный ответ направлен сразу на несколько МАГ, и нельзя выделить главенствующую роль НА-1-специфичных клеток в процессе РТПХ, что противоречит ранее показанной иммунодоминантности НА-1 [41].

В крови реципиентов, у которых не было РТПХ, были обнаружены НА-1-специфичные Т-лимфоциты, однако их клональное разнообразие было меньше, чем у больных с РТПХ. Таким образом, генетическое различие между донором и реципиентом по НА-1 само по себе не приводит к РТПХ. Поскольку пусковым механизмом РТПХ является воспалительный цитокиновый фон [113], то риск РТПХ можно уменьшить, если разнести по времени алло-ТГСК и трансфузию донорских лимфоцитов или использовать HA-1-специфичные генетически модифицированные лимфоциты.

Минорный антиген НА-2 был открыт в числе первых [41], тогда же было установлено, что он экспрессируется в гемопоэтической ткани, и отсутствует в клетках эпителия и эндотелия различных тканей [97]. Этот МАГ презентируется в HLA-A*02, имеет частоту иммуногенного аллеля в европейской популяции 95 % и является иммунодоминантным. Пептид НА-2 происходит из миозина I класса [114]. С помощью секвенирования генома установлено, что НА-2 — продукт гена MYO1G, имеющего два аллеля: иммуногенный MYO1G^V (YIGEVLVSV) и неиммуногенный MYO1G^M (YIGEVLVSM) [115]. Аминокислотная замена не приводит к значительному изменению аффинности связывания с HLA, а при добавлении экзогенного пептида Т-лимфоциты способны распознавать не только MYO1G^V, но и MYO1G^M. Однако исследование Т-клеточного ответа и масс-спектрометрический анализ связанных с HLA пептидов не показали способность эндогенного пептида MYO1G^M презентироваться в HLA. Следовательно, причиной отсутствия иммуногенности может быть его слабое связывание с TAP или расщепление протеасомой на неподходящие для презентации в HLA фрагменты. Из-за большой частоты иммуногенного аллеля в европейской популяции иммуногенное несовпадение при трансплантации возникает редко, по сравнению с НА-1 имеется меньший объем информации о влиянии несовпадения по НА-2 на исход трансплантации. Анализ исходов трансплантации показывает меньшую вероятность рецидива лейкоза при несовпадении по НА-2 и большую вероятность РТПЛ [116]. При этом из-за ограниченной гемопоэтической тканью экспрессии, НА-2 не является причиной возникновения РТПХ [107], что подтверждается опытами с образцами кожи НА-2-позитивных доноров [98].

НА-2, как и НА-1, представляет собой перспективную мишень для посттрансплантационной иммунотерапии лейкозов. Инфузия донорских лимфоцитов при НА-2-несовместимой алло-ТГСК была ассоциирована с позитивным терапевтическим эффектом [100]. Был клонирован функциональный ТКР, специфичный к НА-2 [117], а затем был предложен метод терапии рецидивов лейкозов, основанный на внедрении в специфичные к цитомегаловирусу (ЦМВ) и вирусу Эпштейна — Барр (ВЭБ) Т-лимфоциты трансгенного НА-2-специфичного ТКР [118]. Установлена специфическая цитотоксичность модифицированных Т-лимфоцитов в отношении клеток лейкоза. В последующей работе была предпринята попытка увеличить эффективность терапии за счет увеличения аффинности НА-2-специфичного ТКР, что привело к возникновению кросс-реактивности на пептид SVGSVLLTV из гена CDH13, также презентируемого в HLA-A*02. Этот ген экспрессируется в здоровых фибробластах и кератиноцитах, что делает данный ТКР с увеличенной аффинностью непригодным для клинического применения [119]. В настоящее время испытания трансгенных НА-2-специфичных Т-лимфоцитов остаются на стадии in vitro, что связано с редкой частотой иммуногенного несовпадения при трансплантации в европейской популяции. Очень высокая частота MYO1G^V в популяции приводит к тому, что лишь небольшая доля полностью HLA-совместимых пар «донор — реципиент» имеет иммунологическое несоответствие, дающее возможность использовать его в качестве мишени. По той же причине MYO1G^V является почти универсальной мишенью для иммунотерапии при алло-ТГСК от гаплоидентичного донора, когда донор не имеет аллеля HLA-A*02:01, а реципиент имеет. В то же время в других популяциях аллельные варианты MYO1G^V и MYO1G^M имеют схожую частоту [120][121].

ACC1/2. Ген BCL2A1 принадлежит к семейству антиапоптотических генов Bcl-2. Два минорных антигена, ACC-1Y и ACC-2D, происходят из разных однонуклеотидных полиморфизмов в гене BCL2A1 и презентируются в аллельных вариантах молекул HLA-A*24:02 и HLA-B*44:03 соответственно [122]. BCL2A1 часто гиперэкспрессирован в злокачественных гемопоэтических клетках и является протоонкогеном. Потенциально опухоли будет труднее «уйти» от иммунного ответа за счет уменьшения экспрессии этого гена, что делает ACC-1 и ACC-2 перспективными мишенями для иммунотерапии [123][124]. Минорный антиген АСС-1 возникает благодаря полиморфизмам rs1138357 в первом экзоне гена BCL2A1, которые приводят к образованию двух пептидных вариантов — ACC-1Y (DYLQYVLQI) и ACC-1C (DYLQCVLQI), презентирующихся в HLA-A*24:02, оба из которых иммуногенны. Минорный антиген ACC-2 происходит из полиморфизма rs3826007, единственный иммуногенный пептид KEFEDDIINW презентируется в HLA-B*44:03. ACC-1Y-специфичные Т-клетки могут быть получены от доноров с аллелем HLA-A*24:02, гомозиготных по полиморфизму (rs1138357, GG, кодирующему DYLQCVLQI). Точно так же ACC-2-специфические Т-клетки могут быть получены доноров с аллелем HLA-B*44:03, гомозиготных по полиморфизму (rs3826007, GG, кодирующему KEFEDGIINW). Нами ранее был клонирован ТКР, специфичный к минорному антигену ACC-1Y, подтверждена его функциональность и отсутствие распознавания альтернативного аллеля [125]. Для антигена ACC-2 последовательности распознающих его ТКР на сегодняшний момент не были опубликованы.

ACC-1 и ACC-2 являются перспективными мишенями для Т-клеточной иммунотерапии. На основании распространенности аллелей HLA-A*24:02 и HLA-B*44:03 и частоты распространения иммуногенных и неиммуногенных вариантов ACC-1 и ACC-2, частота иммуногенного несовпадения при трансплантации от родственных и неродственных доноров составляет 2,8 и 5,2 % для ACC-1 и 3,6 и 6,7 % для ACC-2 соответственно [126].

Существуют разногласия относительно того, насколько избирательно BCL2A1 экспрессируется в гемопоэтических клетках. Анализ экспрессии генов с помощью Нозерн-блоттинга [122], количественной полимеразной цепной реакции и РНК-микрочипов [127] показывает экспрессию исключительно в гемопоэтических клетках. Однако показано [128], что экспрессия BCL2A1 может быть увеличена в негемопоэтических клетках (мезенхимных стромальных клетках) за счет одновременного воздействия интерферона-гамма и фактора некроза опухоли, что впоследствии было подтверждено другим исследованием [127]. Впрочем, клиническая значимость этого обнаруженного in vitro феномена не подтверждается. В двух исследованиях [127][128] негемопоэтические клетки, имеющие аллели ACC-1Y и ACC-2D, не распознавались Т-клеточными клонами без стимуляции экзогенными цитокинами. Более того, анализ результатов ТГСК у 320 больных, имевших аллель HLA-A*24:02, не показал увеличения частоты РТПХ при несовпадении по ACC-1 [129]. Из этих данных следует, что иммунотерапия с использованием ACC-1Y не несет риска развития РТПХ.

Было показано, что ACC-1-и ACC-2-специфичные Т-клетки in vitro обладают способностью лизировать первичные лейкозные клетки, полученные от реципиентов гемопоэтических стволовых клеток [122]. В последующем исследовании с помощью окраски HLA-тетрамером ACC-1-специфичные Т-лимфоциты были выявлены в костном мозге и периферической крови у больного спустя 14 мес. после трансплантации от HLA-совместимого ACC-1-отрицательного донора [130]. ACC-1-специфические Т-клетки, выделенные из костного мозга, пролиферировали в ответ на стимуляцию пептидом ACC1 и проявляли цитотоксичность в отношении клеточной линии, представляющей эндогенный пептид ACC-1, демонстрируя способность ACC-1-специфичных Т-лимфоцитов формировать иммунологическую память, способствующую защите от посттрансплантационного рецидива. Тем не менее, BCL2A1 экспрессируется на высоком уровне не при всех лейкозах. Хотя цитотоксические Т-клетки, имеющие высокоаффинный ТКР, способны уничтожать клетки с низким уровнем экспрессии мишени, перед клиническим применением ACC-специфичной терапии целесообразно оценивать экспрессию этого гена и проводить цитотоксические тесты на бластных клетках конкретных больных.

Клинические исследования МАГ-специфичной терапии

Наиболее простой вариант посттрансплантационной иммунотерапии заключается в трансфузии реципиенту лимфоцитов донора. Эта процедура направлена не только на профилактику или терапию рецидива лейкоза, но и на терапию оппортунистических инфекций, риск возникновения которых сильно повышен из-за связанного с ТГСК кондиционирования и вызываемой им лимфопении [131].

Наибольшее количество специфичных к минорным антигенам реципиента Т-клеточных клонов содержится среди наивных клеток. При контакте с антигеном они способны активироваться и вызывать иммунный ответ на опухолевые клетки при лейкозе [21]. В экспериментальной модели на мышах [132] адоптивный перенос CD8+ лимфоцитов, полученных из мышей, иммунизированных клетками, несущими МАГ, привел к излечению мышей от лейкоза без возникновения РТПХ.

В клиническом исследовании [100] трем HA-1-и/или НА-2-позитивным больным с рецидивом лейкоза производили инфузию лимфоцитов от HA-1-и/или НА-2-отрицательных доноров. У всех 3 больных были достигнуты ремиссия лейкоза и 100 % донорский химеризм. Экспансию НА-1/2-специфичных клонов в крови реципиентов подтверждали окраской HLA-тетрамерами, направленная цитотоксичность этих клонов была подтверждена in vitro [133].

Количество наивных лимфоцитов, специфичных к МАГ, непосредственно в донорской крови невелико: для НА-1 частота наивных клонов оценивается как 2,47 × 10^–6 [134]. В клинических исследованиях метод трансфузии донорских Т-лимфоцитов, полученных с помощью ex vivo экспансий, специфичных к бластным клеткам больных лейкозами, показал умеренную эффективность [135]. Конкретные антигены оставались неизвестными, однако предполагают, что в основном клеточные экспансии были получены на МАГ.

В исследовании [136] 7 больным с рецидивом В-клеточного ОЛЛ или миелодиспластическим синдромом были перелиты Т-лимфоциты, специфичные к МАГ, полученные в результате ex vivo экспансий. Периферические мононуклеары от больных после трансплантации, содержавшие клетки донорского происхождения, стимулировали 3 раза облученными мононуклеарами этих же больных, но до трансплантации. Отбирали CD8+ Т-клеточные клоны, которые обладали селективной цитотоксичностью в отношении В-лимфобластных клеток реципиентского, но не донорского происхождения. Отобранные таким образом клоны характеризовали по уникально перестроенной бета-цепи ТКР, проводили экспансию и вводили больным 3–9 × 10 ⁹ клеток. У 5 из 7 больных была достигнута временная ремиссия, у 2 из них наблюдалась умеренная РТПХ с поражением легких. Для 3 больных с помощью секвенирования генома были определены гены, на полиморфные пептиды которых были получены цитотоксические клоны: P2RX7, DPH1, DDX3Y. Это исследование подтверждает возможность использования МАГ в качестве мишеней для иммунотерапии лейкозов.

В исследовании [137] получали клеточный продукт, содержащий Т-лимфоциты, специфичные к НА-1, методом антиген-специфичной экспансии, и вводили 3 больным. Ни у одного из больных не было РТПХ, однако и клинического ответа не наблюдалось. Недостаточная эффективность метода в обоих исследованиях связана с неоптимальными условиями культивирования, которые привели к истощению культуры и ограниченному времени циркуляции лимфоцитов после трансфузии. В дальнейшем были предложены методы оптимизации условий in vitro экспансии антиген-специфичных клеток: культивирование с интерлейкином-7 и интерлейкином-15 [138] или блокада сигнального пути Akt/протеинкиназы B в лимфоцитах во время экспансии [139].

Естественный МАГ-специфичный иммунный ответ можно усилить за счет введения дендритно-клеточной вакцины параллельно с инфузией донорских лимфоцитов [140]. Девяти больным множественной миеломой (ММ) или с рецидивом ММ после алло-ТГСК вводили донорские лимфоциты, а также донорские дендритные клетки моноцитарного происхождения, презентирующие экзогенные пептиды МАГ. Пары «донор — реципиент» имели несовпадение по минорным антигенам HA-1 и/или UTA2–1 и/или LRH-1. Ни у одного из 5 больных не было РТПХ, у 5 больных МАГ-специфичные лимфоциты детектировались в течение 20 недель. У этих больных прогрессию болезни удалось остановить на 3,5–10 мес.

Дендритно-клеточную вакцину исследовали также в работе [141]. Для 4 из 15 больных, не ответивших на первичную инфузию лимфоцитов, была получена вакцина, презентирующая МАГ НА-1, НА-2 или ACC. У 1 из 4 больных достигнута ремиссия. Хотя за длительное время испытания дендритно-клеточные вакцины показали свою безопасность, терапевтический успех оценивается как неоднозначный [142].

Альтернативный и считающийся в настоящее время более перспективным подход заключается в получении Т-лимфоцитов, распознающих МАГ за счет их генетической модификации, например переносе МАГ-специфичного Т-клеточного рецептора в донорские лимфоциты с помощью вирусного вектора.

В одном из исследований был предложен оригинальный подход, заключающийся в использовании для модификации трансгенным ТКР донорских Т-лимфоцитов, специфичных к ЦМВ или ВЭБ. Предполагаемыми преимуществами такого подхода являлось, во-первых, то, что противовирусная специфичность Т-лимфоцитов должна была способствовать их размножению in vivo и одновременно осуществлять функцию профилактики ЦМВ-инфекции после трансплантации; во-вторых, вирусная специфичность ТКР должна исключить аллореактивность Т-лимфоцитов и потенциальное развитие РТПХ [143]. Модифицированные специфичным к НА-1 ТКР лимфоциты демонстрировали направленную цитотоксическую активность in vitro в отношении лимфобластной клеточной линии, несущей экзогенный пептид HA-1, а также бластных клеток, полученных от больных [144].

Этот подход был применен в первой фазе клинического исследования [145], в котором приняли участие 9 НА-1-позитивных больных с рецидивом ОМЛ после алло-ТГСК. У 4 из них доноры были ЦМВ-отрицательные, поэтому для них клеточный продукт изготовить было невозможно. Состав клеточного продукта сильно различался между больными: вводили от 3 до 283 × 10 ⁶ клеток, из них Т-клеток было 96–99 %, вирус-специфичными были 74–100 %, а модифицированными трансгенным ТКР были 11–41 %. По результатам исследования, из 5 больных, которым вводили клеточный продукт, 1 умер от рецидива ОМЛ, 1 — от посттрансплантационного лимфопролиферативного синдрома и 1 — от бактериальной и грибковой инфекций, выжили 2 больных. Ни у одного не было признаков РТПХ. В группе, в которой не вводили клеточный продукт, 1 больной умер от бактериальной инфекции. По результатам этих исследований можно сделать вывод о низкой эффективности и ограниченной применимости подхода с использованием вирус-специфичных лимфоцитов как модифицируемой популяции. Трансгенные лимфоциты демонстрировали функциональный ответ на бластные клетки больных ОМЛ, полученные в момент рецидива, следовательно, причина неэффективности заключалась не в потере экспрессии МАГ клетками лейкоза. Персистенция модифицированных клеток наблюдалась у 3 из 5 больных, причем эти больные умерли впоследствии. Причина неудачи объясняется недостаточным количеством модифицированных лимфоцитов. Вирус-специфичные лимфоциты, использованные для модификации, принадлежат к популяциям клеток памяти и эффекторам, обладающим меньшим пролиферативным потенциалом по сравнению с наивными клетками [146]. Распознавание лимфоцитами вирусных антигенов дает достаточный стимул для поддержания трансгенной популяции Т-клеток. Однако из-за оптимизации кодонов экспрессия трансгенного ТКР подавила экспрессию эндогенного вирус-специфичного ТКР. Этими факторами объясняется плохая персистенция лимфоцитов в организме реципиентов. Этот метод невозможно стандартизировать и масштабировать из-за малого количества стартового материала для модификации: количество вирус-специфичных клеток оценивается примерно в 1 % от общего пула Т-лимфоцитов [147].

В работе [148] выбран другой подход к терапии: НА-1-специфичные лимфоциты были получены путем трансдукции тотальной фракции CD8+ и CD4+ клеток. В лентивирусный вектор помимо ТКР включены селективный маркер (укороченный CD34), корецептор CD8 и индуцибельная каспаза iCasp9. Использование каспазы позволяет уничтожить трансгенные лимфоциты в случае их неконтролируемой экспансии или развития РТПХ за счет введения AP1903 (Rimiducid), приводящего к димеризации iCasp9 и запуску апоптоза. В настоящее время проводится набор больных для I фазы клинического исследования (NCT03326921), которое должно завершиться в 2024 г.

Количество клинических исследований терапии на основе МАГ очень невелико (табл.) по сравнению с испытаниями CAR-T, количество которых превышает 500 [90]. Также мало число больных, принимающих участие в каждом исследовании. Это объясняется трудностью поиска пары «донор — реципиент», обладающей нужным несовпадением по МАГ, для НА-1 это приблизительно 25 % от общего числа HLA-A*02-совместимых трансплантаций [149].

При внедрении трансгенного ТКР возможно формирование гетеродимеров между нативными и трансгенными альфа- и бета-цепями ТКР. Это может приводить к образованию новых ТКР, обладающих неизвестной специфичностью, и потенциально вызвать РТПХ [150]. Нокаут эндогенного ТКР системой CRISPR/Cas9 позволяет избежать возникновения новой специфичности и улучшить эффекторные качества клеток за счет устранения внутриклеточной конкуренции между разными ТКР [151] (рис. 2).

Как альтернатива трансгенному ТКР был разработан химерный рецептор, специфичный к НА-1 [152]. Использование такого рецептора будет иметь те же ограничения, связанные с подбором пары «донор — реципиент», но потенциально химерный рецептор, обладающий большей аффинностью, сможет распознавать антиген даже при низком уровне его экспрессии.

Таким образом, терапия или профилактика рецидивов злокачественных заболеваний системы крови после алло-ТГСК, направленная на МАГ, является перспективным методом лечения за счет возможности индукции РТПЛ в отсутствии РПТХ. МАГ имеют ряд существенных преимуществ перед другими антигенами в качестве мишеней иммунотерапии. Отсутствие на сегодняшний день значительных успехов в области МАГ-специфичной терапии в большей степени связано с несовершенством методик получения клеточного продукта, использованного в предшествующих испытаниях. Применение современных протоколов культивации Т-лимфоцитов, а также использование для модификации популяций, обладающих большим пролиферативным потенциалом, таких как наивные [153] и стволовые клетки памяти [154], должны повысить эффективность терапии. Учитывая опыт неудачных клинических испытаний и опыт, полученный при использовании CAR-T-терапии, необходимо модифицировать процесс получения Т-лимфоцитов, чтобы повысить их долгосрочную выживаемость и функциональную активность.

Наиболее перспективным подходом представляется не выращивание антиген-специфичных экспансий, а получение антиген-специфичных Т-лимфоцитов за счет внедрения гена Т-клеточного рецептора с известной специфичностью. Это позволит получать стандартизированные Т-лимфоциты с заранее известными свойствами и изученной кросс-реактивностью. Принципиальные ограничения подхода, связанные с небольшой долей больных, у которых возможно таргетировать конкретный МАГ, могут быть преодолены за счет применения МАГ-специфичной терапии в контексте алло-ТГСК от гаплоидентичного донора. По-прежнему остается актуальным поиск новых МАГ, преимущественно экспрессированных в клетках гемопоэтической системы и с повышенной экспрессией в опухолевых клетках. Особенно актуальны МАГ, происходящие из функционально значимых для опухоли генов. Информация, накопленная в предшествующих клинических исследованиях, и арсенал подходов генетического редактирования и производства клеточного продукта, отработанный в области CAR-T-терапии, создали предпосылки к тому, чтобы в ближайшем будущем стало возможным создание высокоспецифичной и эффективной терапии лейкозов, направленной на МАГ.