Конформационные нарушения мембран эритроцитов в процессе длительного хранения эритроцитной взвеси

Введение

Эритроцитная взвесь (ЭВ) является наиболее востребованным продуктом для гемотрансфузий. Показания к трансфузиям ЭВ включают симптоматическую анемию, острую кровопотерю, с целью восстановления доставки кислорода тканям. Проблема сохранения качества хранящихся эритроцитов и экономические показатели заготовки донорской крови являются весьма актуальными. Ежегодно в мире заготавливают около 118,5 млн единиц ЭВ [1], из них ежегодно в России — 2 млн единиц.

Согласно современным протоколам [2][3], эритроциты для переливания получают путем центрифугирования цельной крови с последующим удалением плазмы и лейкотромбоцитного слоя. После разделения цельной крови на компоненты добавляют взвешивающие растворы, обеспечивающие поддержание жизнеспособности эритроцитов в условиях, отличающихся от физиологических. В 1981 г. была разработана первая современная добавка, содержащая 0,9 %-ный раствор хлорида натрия, аденин-глюкозу и маннит (SAGM). Это позволило хранить ЭВ до 6 недель при температуре от +4 до +6 °C. Современные добавочные растворы, например PAGGSM, позволяют сохранять эритроциты до 49 дней [4]. Существуют также взвешивающие растворы SOLX [5] или ESOL5 [6], которые способствуют подщелачиванию внутриклеточного pH и позволяют сохранять ЭВ до 56 дней [7].

Несмотря на то что в рандомизированных клинических исследованиях не было установлено различий в смертности при переливании «молодых» и «старых» образцов ЭВ [8–10], в ряде работ показано, что такие осложнения, как повышенная восприимчивость к инфекциям, острое повреждение легких, нарушение гемостаза, увеличение частоты пневмонии возникают, когда реципиенту переливают ЭВ, хранящуюся при 4 °C более 19–21 дней [11–16]. Тем не менее прямое влияние качества эритроцитов на состояние здоровья человека остается неясным.

В ЭВ по мере ее хранения развиваются патологические процессы в эритроцитах. Физико-химическая природа патогенного фактора — свободные радикалы, вызывающие оксидативный стресс. В результате меняется морфология эритроцитов [17], нарушается ионная проницаемость мембран [18], уменьшается концентрация 2,3-дифосфоглицерата, образуются поры в липидном бислое, возникает везикуляция [19]. Однако молекулярные механизмы «старения» эритроцитов изучены недостаточно. Неясно, в чем состоят патофизиологические отличия «молодой» от «старой» ЭВ, какова причина старения эритроцитов, каковы механизмы такого старения, какие изменения происходят в мембранах и цитоскелете эритроцитов. Поэтому исследования, отвечающие на эти вопросы, являются весьма актуальными.

Цель настоящей работы — анализ динамики патологических изменений морфологии, наноструктуры, сети цитоскелета и механических свойств мембран эритроцитов в процессе длительного хранения ЭВ, а также связь этих изменений со сроком хранения.

Материалы и методы

Характеристики ЭВ

Шесть пакетов ЭВ разных групп крови были получены в клинических центрах переливания крови г. Москвы. ЭВ хранилась с антикоагулянтом CPD в ресуспендирующем растворе SAGM, при температуре +4 °C, гематокрит составлял 55–62 %. Забор образцов для проведения экспериментов in vitro проводили на 3, 12, 19, 21, 24, 28, 35, 42-е дни хранения. Образцы ЭВ отбирались из пакетов с гемоконсервантом без нарушений их целостности, с сохранением герметичности.

Схема эксперимента

Эксперимент проводился по схеме, представленной на рисунке 1. На первом этапе в контрольные дни хранения из пакета с ЭВ отбирали пробу 13 мл. Полученный образец помещали в термостат на 30 мин для достижения температуры +20 °C. Затем удаляли остатки консервирующего раствора перед проведением каждого исследования. Следующим этапом было проведение различных опытов. Исследовались морфология, наноструктура мембран эритроцитов, изменения сети цитоскелета и жесткость мембран. Были проведены биохимические анализы и анализы кислотно-основного состояния эритроцитов во время хранения ЭВ. Такую схему экспериментов применяли для каждого из 6 пакетов с ЭВ.

Получение монослоя эритроцитов

100 мкл ЭВ центрифугировали при 3000 оборотов в течение 5 минут на центрифуге Universal 320 (Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Германия). Удаляли надосадочный слой и из осадка приготавливали мазок с помощью специального устройства V-sampler (Vision Microscopy, Австрия).

Получение цитоскелета

Для получения изображений цитоскелета и его отдельных фрагментов формировали тени эритроцитов. Подготовку образца проводили в несколько этапов. На первом этапе удаляли компоненты раствора, в котором находились эритроциты во время их хранения. Для этого к 100 мкл ЭВ добавляли 500 мкл фосфатно-солевого буфера pH 7,4. Эту суспензию перемешивали на мини-ротаторе «Bio RS-24» (Biosan, Латвия) со скоростью 8 об./мин в течение 5 мин. Вторая стадия — осаждение клеток. Для этого суспензию центрифугировали при 1500 об./мин в течение 5 мин. Убирали надосадочную жидкость. В осадок с эритроцитами добавляли 500 мкл буфера. Процесс перемешивания и осаждения повторяли 5 раз. После этого оставлялось 75 мкл осажденных клеток. Следующая стадия — гемолиз полученных эритроцитов. Для этого к клеткам добавляли 500 мкл гипотонического раствора 0,09 % NaCl в дистиллированной воде. Полученную суспензию центрифугировали при 3000 об./мин 5 мин. Затем убирали надосадочную жидкость. В завершающей стадии полученный образец помещали на 30 мин в холодильник при +4 °C, после чего смесь выдерживали в течение 10 мин при +20 °C. В полученном образце формировались тени эритроцитов. Из осадка был приготовлен монослой на устройстве V-Sampler для сканирования его на АСМ.

Атомно-силовая микроскопия

Изображения клеток и цитоскелета были получены с использованием атомно-силового микроскопа «NTEGRA Prima» (NT-MDT Spectrum Instrument, Российская Федерация) в полуконтактном режиме. Использовали кантилеверы «NSG01» (TipsNano, Эстония) с радиусом острия 10 нм, резонансной частотой 87–230 кГц, коэффициентом упругости кантилевера K = 5 Н/м. Количество точек сканирования составляло 512 или 1024 в каждой строке изображения. Поля сканирования были 100 × 100 мкм ², 50 × 50 мкм ², 30 × 30 мкм ², 10 × 10 мкм ². Изображения обрабатывали в «SPM Nova software» (NT-MDT Spectrum Instruments, Российская Федерация) [20].

Атомно-силовая спектроскопия

Жесткость клеточных мембран оценивали с помощью модуля Юнга (Е). Для приготовления образца использовали метод оседания клеток на стекло. Жесткость клеток измеряли с помощью кантилеверов «SD-R150-T3L450B» (Nanosensors, Швейцария) с коэффициентом упругости кантилевера K = 1 Н/м и радиусом иглы 150 нм. Все измерения производили только на нативных клетках в фосфатно-солевом буфере. В процессе подготовки измерений для каждого образца проводили калибровку кантилевера на стекле [21]. Для получения эмпирической силовой кривой I (Z) задавали максимальную величину подъема пьезосканера Z_max = 4000 нм и величину тока фотодиода I = 0,5 нА. Время погружения зонда составляло 5 сек. Получение кривых жесткости образцов с эритроцитами проводили по методике, описанной подробно нами ранее [21][22].

Биохимические показатели

Анализатором крови «Miura One» (ISE S. r.l., Италия) определяли количество лактата и глюкозы на протяжении всего периода хранения. Ионометрическим прибором «I-510» (NPO Akvilon, Российская Федерация) измеряли концентрацию внеклеточного калия в ЭВ, используя электрод XC-K-001. рН измеряли прибором «STARTER 2100» (OHAUS, США). Использовали электрод ST210 pH (OHAUS, США). Для оценки процентного содержания производных гемоглобина (HbO₂, Hb, MetHb) и количества свободного гемоглобина использовали цифровой спектрофотометр «Unico 2800» (United Products & Instruments, США). Были измерены спектры поглощения суспензии эритроцитов в фосфатно-солевом буфере в диапазоне длин волн 500–700 нм с шагом 1 нм.

Статистический анализ

Для каждого исследуемого дня хранения (для каждого пакета) приготавливали по три мазка с монослоями теней и монослоями клеток. На каждом мазке сканировали по 5 изображений в разных частях мазка с размером 100 × 100 мкм ². Для анализа наноструктуры сетки цитоскелета сканировали участок размером 2,5 × 2,5 мкм ² на 30 тенях. Получали по 280–300 изображений на один пакет. Всего для 6 пакетов было проанализировано около 4140 изображений. С помощью программы «Image Analysis» Р9 (NT-MDT Spectrum Instruments Co., Российская Федерация) рассчитывали параметры: количество пор и сумму их площадей на заданном размере образца. На каждом образце измеряли по 100 силовых кривых. Всего в исследовании проанализировано 3200 нативных эритроцитов. Для анализа наноструктуры мембран эритроцитов использовали наноповерхности I и II порядков, полученные пространственным преобразованием Фурье. Более подробное разложение исходной поверхности на сумму поверхностей двух и более пространственных периодов подробно описано в предыдущей нашей работе [23][24].

Статистический анализ проводили с помощью программы «Origin Pro2019» (Origin Lab Corporation, США). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Непрерывные переменные предварительно анализировали на нормальность распределения тестом Шапиро — Уилка. Были рассчитаны коэффициенты корреляции Спирмена, чтобы определить тесноту связи между исследуемыми величинами. Для сравнения средних использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA с вычислением F-теста и поправкой Бонферрони.

Результаты

В процессе хранения ЭВ морфология клеток изменялась. На 3-й день хранения ЭВ в монослое наблюдались преимущественно дискоциты. Их количество составляло 89 ± 8 %. К 12-му дню хранения количество дискоцитов уменьшилось до 35 ± 4 %, при этом количество эхиноцитов увеличилось до 25 ± 6 %. К 21-му дню хранения большинство клеток стало эхиноцитами и сфероэхиноцитами — 64 ± 12 %. К 42-му дню хранения количество эхиноцитов составило 14 ± 3 %, сфероэхиноцитов — 45 ± 6 %, лимонообразных — 22 ± 3 %, теней — 3 ± 1 %. Также наблюдали 16 ± 2 % клеток другой формы. На рисунке 2 представлены изображения характерных форм клеток на 3-й, 12-й, 21-й и 42-й дни хранения.

Изменение морфологии клеток связано с изменением наноструктуры мембран эритроцитов. Участок мембраны размером 1,5 ×1,5 мкм ² для каждого контрольного дня хранения раскладывали на поверхности двух порядков, используя пространственное преобразование Фурье. Для каждого фрагмента мембраны измеряли пространственный период l и высоту H. На рисунке 3 показана наноструктура второго порядка для 3-го, 21-го и 42-го дней хранения. В начале срока хранения наноповерхность мембраны эритроцитов имела параметры второго порядка, характерные для нормального эритроцита l = 80–200 нм и H = 2–4 нм. Пространственный период l наноповерхности мембраны, показанный на рисунке 3, составлял 88 ± 7 нм, при этом высота ее шероховатости 𝐻 не превышала 2 ± 1 нм. В середине срока хранения (19–21-й день) на поверхности появлялись дефекты в виде зерен. Размер отдельного зерна составлял 130 ± 20 нм. В области доменов образовывалось от 4–5 до нескольких десятков зерен. Размер домена варьировал от 400 до 2000 нм. Далее к 42-му дню происходило слияние отдельных зерен в более крупные структуры.

Морфология эритроцитов и наноструктура их мембран определяются состоянием их цитоскелета. Сеть цитоскелета состоит из псевдогексагональных ячеек, которые включают филаменты и пустоты (поры) между филаментами. На рисунке 3 представлено изображение цитоскелета эритроцитов в плоском формате 1,5 × 1,5 мкм ² для 3-го, 21-го и 42-го дня хранения. С помощью метода сегментации Advance Watershed в программе Image Analysis P9 рассчитали площади ячеек и количество пор. Средняя площадь пор (S) по мере хранения от 3-го до 42-го дня хранения возрастала в 4,2 ± 0,4 раза. В начале срока хранения средняя площадь составляла 0,018 ± 0,008 мкм ². До 12-го дня хранения ЭВ размеры пор практически не изменялись (p > 0,01). На 21-й день хранения средняя площадь составляла 0,042 ± 0,003 мкм ². К 42-му дню хранения средняя площадь составляла 0,076 ± 0,008 мкм ².

По мере хранения ЭВ количество пор на единицу площади цитоскелета 2,5 × 2,5 мкм ² уменьшалось (рис. 4 А). Количество пор в контрольный 3-й день хранения было 250 ± 20. К 21-му дню хранения произошло резкое уменьшение количества пор до 100 ± 25 (p < 0,01), а к 42-му дню хранения их количество составляло 50 ± 13 (p < 0,01). Таким образом, за весь период хранения ЭВ количество пор уменьшилось в 3,4 ± 1,1 раза.

Сумма площадей всех пор на фиксированном скане 2,5 × 2,5 мкм ² к концу срока хранения ЭВ практически не изменялась (рис. 4 Б). До 24-го дня суммы площадей пор оставались в пределах 5,0 ± 0,5 мкм ², а количество пор за это время уменьшалось в 1,8 ± 0,4 раза.

Анализ зависимости изменений параметра площади S по мере хранения ЭВ показал, что в начале срока хранения (до 21-го дня) 90 ± 2 % пор имели размеры сети цитоскелета как на 3-й день хранения ЭВ. Затем вплоть до 42-го дня хранения доля контрольных пор монотонно уменьшалась. К 28–35-му дню 50 ± 3 % пор стали отличными от контрольных. Далее к 42-му дню доля пор с контрольными значениями площади S уменьшилась до 30± 7 % (p < 0,01).

Деформационную способность клеток оценивали с помощью модуля Юнга (Е). Для оценки Е регистрировали экспериментальные силовые кривые для каждого эритроцита с помощью атомно-силовой спектроскопии. Гистограммы плотности относительных частот для модуля Юнга на 3-й, 21-й и 42-й дни хранения представлены на рисунке 4 В. В начале срока хранения среднее значение модуля Юнга было равно 9 ± 4 кПа. После 21-го дня хранения модуль Юнга начал расти, и к 42-му дню хранения среднее значение модуля Юнга достигло 27 ± 8,7 кПа.

Детальный анализа изменений жесткости мембран в процессе хранения ЭВ производили на основе функции распределения:

,(1)

где f (E) — нормальный закон распределения Гаусса, которым аппроксимировались гистограммы относительных частот для экспериментальных данных. Доля клеток, у которых модуль Юнга мембран сохранял значения, соответствующие третьему дню хранения, рассчитывалась на уровне 0,98 из функций распределения f (E).

К 21-му дню хранения доля клеток с модулем Юнга 3-го дня хранения составила около 85 ± 5 %, т. е. клетки сохранили жесткость как на третий день хранения. К 42-му дню хранения оставалось 30 ± 3 % контрольных клеток в пакетах № 1, № 3 и 18± 4 % — в пакетах № 2, № 4, т. е. происходило резкое уменьшение доли клеток с модулем Юнга 3-го дня хранения после 21-го дня хранения ЭВ (рис. 4 Г).

Изменение биохимических показателей по мере хранения ЭВ

Во время хранения происходил патологический процесс, который заключался в нарушении функционального состояния натрий-калиевого насоса, что приводило к потере внутриклеточного калия и накоплению натрия в цитоплазме. В норме концентрация калия составляет около 90 мМ внутри эритроцита и 5 мМ — снаружи, а концентрации натрия внутри и снаружи эритроцита составляют 5 мМ и 140 мМ соответственно [25]. По мере хранения соотношение концентраций калия и натрия претерпевало изменения в несколько раз. Полученные данные показали, что концентрация ионов K⁺ во внешнем растворе возрастала от 3,4 ±0,4 до 18 ± 4 мМ от 3-го до 42-го дня соответственно, то есть увеличилась в 4,9 ± 0,2 раза. Для генерирования достаточного количества АТФ и 2,3-дифосфоглицерата по мере хранения эритроцитов в контейнере в состав взвешивающего раствора добавляют глюкозу или декстрозу, которые поддерживают процесс гликолиза. Во взвешивающих растворах концентрация глюкозы составляет более 500 мг/дл (27,55 мМ), что в несколько раз превышает ее нормальную концентрацию [26]. Начальное содержание глюкозы в растворе гемоконсерванта исследуемых контейнеров ЭВ составляло 20 ± 4 мМ, а к концу срока хранения оно падало до 12 ± 3 мМ. С течением времени хранения образующийся при гликолизе лактат накапливался в растворе гемоконсерванта. К 42-му дню концентрация лактата увеличилась с 8 до 20 мМ. Значение pH с 3-го до 42-го дня хранения изменилось от 7,04 ± 0,03 до 6,67 ± 0,05. С помощью спектрофотометрического метода вычислили процентное содержание производных гемоглобина и количество свободного гемоглобина в каждый контрольный день для всех пакетов. Расчет показал, что метгемоглобин не образовывался. К 42-му дню хранения в пакетах № 1 и № 2 гемолиз был 0,49 ± 0,05 и 0,20 ± 0,04 % соответственно. Степень гемолиза в пакетах № 3 и № 4 к концу срока хранения составил 0,55 ± 0,05 и 0,77 ± 0,06 %, а в пакетах № 5 и № 6–0,45 ± 0,05 и 0,52 ± 0,04 % соответственно.

Для оценки взаимосвязи между структурными, механическими характеристиками и биохимическими показателями проведен корреляционный анализ Спирмена. Установлена корреляционная зависимость между данными параметрами (табл. 1): прямая корреляционная связь с концентрацией внеклеточного калия и лактата, обратная корреляционная связь с рН и концентрацией глюкозы.

Время начала существенных изменений (21-й день хранения) конфигурации цитоскелета (S), механических свойств (Е), коррелировало со сроком хранения ЭВ (более 21-го дня) (табл. 1).

Обсуждение

В последнее время все большее внимание трансфузиологов обращено к проблемам физиологического состояния сохраняемых эритроцитов и, следовательно, к качеству переливаемой ЭВ [2]. Согласно нормативным документам [27], качество ЭВ к концу срока ее хранения определяется по степени выраженности гемолиза и измерению общих гематологических показателей. Выраженность гемолиза объективно демонстрирует количество гемолизированных эритроцитов in vitro [28]. При исследовании образцов в данной работе степень выраженности гемолиза была ниже порогового значения, что свидетельствует об удовлетворительном качестве всех исследованных образцов ЭВ к 42-му дню хранения. Однако такой показатель лишь косвенно характеризует конформационные изменения мембран консервированных эритроцитов [17] и не позволяет непосредственно судить о состоянии клеток, сохранивших свою целостность.

При длительном хранении в стандартных условиях форма сохраненных эритроцитов претерпевала трансформацию. Если на третий день хранения преобладали дискоциты, то в конце периода хранения наблюдалось большое количество эхиноцитов и сфероэхиноцитов. Возможно, пусковым механизмом изменения форм клеток явилось появление топологических дефектов в виде зерен [17]. К 42-му дню хранения такие структуры увеличились и объединились в более крупные (рис. 3), что привело к необратимой трансформации формы эритроцитов. В это же время в процессе хранения происходили изменения в сети цитоскелета: филаменты цитоскелета деформировались и разрывались, мелкие поры объединялись в более крупные образования, происходила кластеризация белковых комплексов [29]. К концу срока хранения размеры пор цитоскелета увеличивались в 2 и более раз.

Цитоскелет представляет собой белковую сеть, состоящую в основном из тетрамеров спектрина, которые связаны с белковыми комплексами актина, белка 4.1R, анкирина, а также с тропомиозином, тропомодулином, аддуцином и дематином. Тетрамер спектрина является основным структурным элементом цитоскелета. Он связан с мембраной эритроцитов. Окислительные процессы могут вызывать превращение тетрамеров в димеры [23], приводящие к нарушениям связи «спектрин — полоса 4.1 — полоса 3» [30] «спектрин — анкирин — полоса 3» [23].

До 19–21-го дня жесткость мембраны практически не изменилась и везде была примерно 10 кПа. После 24-го дня жесткость мембраны резко увеличивалась в 2,8 раза.

Причиной морфологической трансформации, роста жесткости мембран, нарушений метаболизма, модификации структуры цитоскелета, угнетения антиоксидантной системы, ухудшения физиологического состояния эритроцитов является оксидативный стресс [31]: рост АФК, уменьшение рН, увеличение содержания калия и лактата в растворе гемоконсерванта.

Таким образом, в процессе длительного хранения ЭВ (до 42 суток, 4 °C, CPD/SAGM) молекулярная структура эритроцитов подвергается необратимым нарушениям. Эти изменения наступают, как правило, после 20–24 дней хранения. Результаты работы могут быть использованы для оценки качества длительно хранящейся ЭВ. Полученные индивидуальные биофизические показатели мембран эритроцитов могут быть полезны при характеристике ряда гематологических заболеваний в качестве новых диагностических методов персонализированной медицины.