Тромбозы у больных наследственной гипофибриногенемией

Введение

В большинстве случаев у больных с наследственным дефицитом фибриногена клинические проявления представлены малоинтенсивными или жизнеугрожающими кровотечениями, а при незначительном уменьшении концентрации фибриногена в плазме у них может не быть клинических проявлений [1–5]. Однако клиническая картина наследственного дефицита фибриногена может быть представлена и тромбозами [6–8]. Это определяется многофункциональной ролью фибриногена [8–11]. Прокоагулянтные свойства фибриногена обусловлены формированием прочного нерастворимого сгустка, антикоагулянтные — действием в качестве антитромбина (антитромбин I) [12–14]. Фибриноген, наряду с тромбином, является регулятором коагуляционного каскада, тромбоцитарного гемостаза, участником фибринолитического процесса. Артериальные и венозные тромбозы разной локализации описаны при различных вариантах наследственного дефицита фибриногена: при афибриногенемии (концентрация фибриногена плазмы < 0,1 г/л — следы), гипофибриногенемии (концентрация фибриногена плазмы < 1,8 г/л), гиподисфибриногенемии (уменьшение концентрации фибриногена плазмы в сочетании c изменением его структуры) [15–24]. Более того, дисфибриногенемия некоторыми авторами рассматривается как тромбофилия, т. к. у 20 % больных дисфибриногенемия проявляется тромбозами [24][25]. Основными патогенетическими механизмами тромбообразования при наследственных дефицитах фибриногена предполагаются высокая концентрация циркулирующего тромбина ввиду дефицита субстрата и отсутствие достаточной инактивации тромбина из-за отсутствия несубстратного связывания с сайтами фибрина. Высокая концентрация циркулирующего тромбина приводит к активации и агрегации тромбоцитов, секреции фактора роста гладкомышечных клеток и гиперплазии интимы. Патогенез тромбозов также связан с нарушением процессов полимеризации фибрина, деградации фибрина плазмином и изменением свойств сгустка, приводящих к легкой фрагментации [6][15].

В связи с таким разнонаправленным разнообразием клинических проявлений комитетом по стандартизации Международной ассоциации по тромбозу и гемостазу в 2018 г. была пересмотрена и принята новая классификация наследственных нарушений образования фибриногена, основанная на клинических и лабораторных данных и включающая формы наследственного дефицита фибриногена, проявляющиеся тромбозами [26]. Такой дифференциальный подход принципиален, так как позволяет быть настороженным врачу в отношении как кровотечений, так и тромбозов, и продумывать тактику лечения этих больных. Однако в развитии тромбозов могут принимать участие и другие наследственные и приобретенные факторы.

Цель настоящего исследования — охарактеризовать выявленные мутации в генах фибриногена и проанализировать протромботические факторы у больных наследственной гипофибриногенемией и тромбозами.

Материалы и методы

В отделении коагулопатий ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России под наблюдением состоят 49 больных с наследственным дефицитом фибриногена. Диагноз указанным больным установлен на основании клинических и анамнестических данных, определения концентрации фибриногена клоттинговым методом. Наследственный характер заболевания подтвержден либо генетическим исследованием, либо семейным обследованием, когда у одного из родителей или сиблингов больного также определялось низкое содержание фибриногена в плазме. У 46 из 49 больных анамнез не отягощен тромботическими событиями, тогда как у 3 больных были тромбозы в анамнезе. Эти больные и составили группу исследования.

У больной В. диагноз наследственного дефицита фибриногена установлен в возрасте 31 года на основании клинических данных (кровотечение после лапароскопического гинекологического вмешательства, кровотечение после экстракции зуба), лабораторных данных (уменьшение концентрации фибриногена плазмы), данных семейного обследования (у родного брата также концентрация фибриногена плазмы значительно меньше нормы). Катетер-ассоциированный тромбоз медиальной и латеральной подкожных вен левой верхней конечности случился в возрасте 30 лет при проведении трансфузионной терапии после оперативного вмешательства.

У больной Ш. диагноз наследственного дефицита фибриногена установлен в возрасте 27 лет на основании клинических данных (экхимозы, кровотечение после родов), лабораторных данных (значительное уменьшение концентрации фибриногена плазмы), данных семейного обследования (у родной сестры также концентрация фибриногена плазмы значительно меньше нормы). Тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА) диагностирована в возрасте 26 лет.

Больному Б. диагноз наследственного дефицита фибриногена установлен в возрасте 68 лет на основании лабораторных данных (значительное уменьшение концентрации фибриногена плазмы) и данных семейного обследования (у сына концентрация фибриногена плазмы также меньше нормы). Анамнез по кровоточивости у данного больного не отягощен. Тромбоз общей бедренной вены, поверхностной бедренной вены, подколенной вены с обеих сторон состоялся у него в возрасте 60 лет.

Для проведения молекулярно-генетического анализа использовали ДНК, выделенную из ядерных клеток периферической крови, взятой в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА. ДНК выделяли стандартным фенол-хлороформным методом. Определение последовательности ДНК генов альфа-, бета- и гамма-цепей фибриногена (FGA, FGB, FGG) проводили секвенированием по методу Сэнгера и определением первичной структуры всех функционально значимых участков, включающих промоторную область, кодирующие участки, экзон-интронные сочленения и сигнал полиаденилирования. Амплификацию проводили с помощью праймеров, разработанных в лаборатории генной инженерии. Для цепей фибриногена существуют две нумерации, первая из них начинается с первой аминокислоты исходно синтезируемого белка, а вторая — с первой аминокислоты зрелого белка, который образуется после отщепления сигнального пептида; в случае гамма-цепи фибриногена разница между двумя системами нумерации составляет 26 аминокислот. Далее будет использоваться нумерация, начинающаяся с первой аминокислоты исходного белка.

Определение фибриногена по Клауссу проводили клоттинговым методом на анализаторе «Sysmex CA-600» согласно инструкциям производителя (Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmb, Германия) с помощью реагента «Dade Thombin Reagent», содержащего лиофилизированный бычий тромбин. Результат рассчитывается анализатором путем определения концентрации фибриногена в плазме (г/л) по калибровочной кривой и времени свертывания разведенной эталонной плазмы. Наличие фибриногена в плазме также определяли с помощью метода иммунофиксации в геле агарозы с использованием моноспецифической антисыворотки (тест-система «Hydragel 4IF», Sebia, Франция); антисыворотки «Аnti-Human Fibrinogen» (Dako Inc, Дания). Ориентировочную оценку количества фибриногена проводили по результатам электрофореза плазмы с выделением фракции фибриногена и последующей денситометрией (тест-система «Capillarys Protein (E) 6», Sebia, Франция).

Поиск протромботических факторов включал сбор анамнестических данных с учетом сопутствующих заболеваний, перенесенных операций, гормональной терапии, вредных привычек, а также проведение лабораторных исследований: определение активности естественных антикоагулянтов (антитромбина III (АТ III), протеина С, протеина S), волчаночного антикоагулянта (ВАК), концентрации антифосфолипидных антител (антител классов G и M к кардиолипину, бета-2-гликопротеину, фосфолипидам, аннексину V, фосфатидилсерину), концентрации гомоцистеина, генетических маркеров тромбофилии.

С целью проведения тестов для определения активности АТ III, протеина С, протеина S, ВАК и концентрации гомоцистеина в плазме использовали реактивы Hemosil (IL), анализ проводили на приборе «ACL TOP 700» (Werfen). Активность АТ III и протеина С в плазме определяли хромогенным методом. Активность протеина S и концентрацию гомоцистеина в плазме определяли иммунотурбидиметрическим методом. ВАК оценивали с использованием клоттинговых тестов, основанных на применении яда гадюки Рассела и кварцевого активатора. Антитела к бета-2-гликопротеину и кардиолипину классов M и G определяли хемилюминесцентным двухстадийным иммуноферментным методом на приборе «ACL AcuStar IL» с использованием оригинальных реактивов.

Результаты

Молекулярное исследование позволило выявить изменение первичной структуры в гене гамма-цепи фибриногена (FGG) у всех исследуемых больных. У больной В. найдена делеция g.2653_2684+211del, p.(Asp167Glufs*2), удаляющая 32 концевых нуклеотида пятого экзона гена FGG и приводящая к образованию стоп-кодона на месте аминокислоты 168. У больной Ш. обнаружена миссенс-мутация c.1140T>A, p.(Cys365Ser). У больного Б. выявлена миссенс-мутация c.1114A>T, p.(Asp356Val). У всех троих больных найденные мутации являются гетерозиготными.

Концентрация фибриногена в плазме у больной В. составила 1 г/л (норма — 1,8–4,0 г/л), у больной Ш. — 0,21 г/л, у больного Б. — 0, 57 г/л.

При иммунофиксации у больной В. определено наличие в плазме следового количества фибриногена. По результатам электрофореза с денситометрией концентрация фибриногена у больной Ш. составила около 1 г/л. У больного Б. данное исследование не проводилось.

Дальнейший лабораторный анализ включал поиск наследственных и приобретенных протромботических факторов. Дефициты естественных антикоагулянтов были исключены у всех больных. У больной В. активность АТ III в плазме составила 101 % (референсные значения — 80–128 %), активность протеина С — 91 % (референсные значения — 70–140 %); у больной Ш.: АТ III — 118 %, активность протеина С — 136 %; у больного Б.: активность АТ III — 116 %, активность протеина С — 124 %. Определение антител к бета-2-гликопротеину, кардиолипину, фосфолипидам было выполнено у всех больных; определение антител к аннексину V и фосфатидилсерину выполнено у 1 больной. Исследование на ВАК проведено у 2 больных. Данные обследования на антифосфолипидный синдром (АФС) представлены в таблице 1.

Поиск генетических предрасполагающих тромботических факторов включал определение полиморфизмов, ассоциированных с высоким и низким риском развития тромбозов (табл. 2).

У всех больных отсутствовали функциональные полиморфизмы в генах F2 (20210 G>А) и F5 (1691 G>А), ассоциированные с высоким риском развития тромбозов. У 2 больных выявлен гетерозиготный полиморфизм FGB (-455 G>А). У 2 больных выявлены гетерозиготные полиморфизмы генов ITGA2 (807 С>Т) и ITGB3 (1565 Т>C). У 2 больных выявлен гетерозиготный полиморфизм PAI–I (-675 5G/5G). При анализе мутаций генов фолатного цикла (MTHFR, MTR, MTRR) у 3 больных обнаружены гетерозиготные полиморфизмы MTHFR (677 С>Т), MTHFR (1298 А>C) и MTR (2756 А>G). Последующий анализ определения концентрации гомоцистеина у 2 больных показал его нормальные значения (табл. 3).

Анализ анамнестических данных позволил выявить, что у больной В. катетер-ассоциированные тромбозы медиальной и латеральной подкожных вен левой верхней конечности состоялись при проведении трансфузионной терапии после выполнения гистероскопии и раздельного диагностического выскабливания. Данное оперативное вмешательство у больной проводили в связи планированием беременности. Сопутствующими заболеваниями больная не страдает, комбинированные оральные контрацептивы (КОК) не использовала, курение отрицала. Анамнестические данные больной Ш. свидетельствовали о приеме КОК, назначенных после родов. ТЭЛА состоялась через год на фоне приема КОК. У больной не было в анамнезе хронических заболеваний или оперативных вмешательств. Анамнез больного Б. отягощен хроническими заболеваниями: сахарным диабетом 2-го типа, гипертонической болезнью. Однако указанные заболевания дебютировали после состоявшегося тромбоза. Оперативное вмешательство по поводу острого аппендицита случилось за 7 лет до тромботического случая.

Обсуждение

Генетическое исследование при дефиците фибриногена в России в настоящее время не является рутинным. Оно позволяет подтвердить наследственный характер заболевания, верифицировать тот или иной молекулярный дефект, который вызвал количественное или качественное изменение фибриногена. Накопление генетических данных представляет особый интерес в контексте выявления корреляции между определенными генетическими дефектами в генах FGA, FGB, FGG и клиническими проявлениями: кровотечениями, тромбозами или их сочетанием. Это является важным для прогнозирования течения заболевания и подбора терапии. По данным Human Gene Mutation Database (HGMD) [27], в гене FGA выявлено 142 генетических дефекта, в FGB — 90, а в гене FGG — 131. Накопленные данные о структуре фибриногена как белка, а также о клинических проявлениях, к которым приводят те или иные мутации, позволили выделить участки белка, наиболее важные для его функционирования. В частности, это так называемые β- и γ-узелки, формируемые соответствующими цепями фибриногена и кодируемые экзонами 5–8 гена FGB и экзонами 5–9 гена FGG. Анализ базы генетических данных Groupe d’Etude sur l’Hémostase dela Thrombose (GEHT) [15] показал, что из 294 мутаций в этих экзонах 108 ассоциировались с кровотечением, 42 — с тромбозами, 23 — и с кровотечениями, и с тромбозами.

Согласно настоящему исследованию, у больной В. выявлена делеция в гене FGG, которая приводит к обрыву синтеза γ-цепи фибриногена. Она не была описана ранее, однако ее расположение в середине гена позволяет предполагать количественный дефект фибриногена, поскольку одна из двух копий гена у больной фактически отсутствует. В двух других случаях были выявлены миссенс-мутации, которые описаны ранее другими исследователями. Замена p.(Cys365Ser), выявленная у больной Ш., описана у женщины с отягощенным анамнезом по кровоточивости и отсутствием тромботических эпизодов [28]. Цистеин в этой позиции необходим для формирования правильной структуры фибриногена, а его замена на серин приводит к синтезу белка с аномальной подвижностью в лабораторных условиях [29]. Замена p.(Asp356Val), выявленная у больного Б., также была описана ранее [30] и упоминалась как фибриноген Ale`s [31] и Milano I [32]. В одном из случаев гетерозиготная мутация не привела к каким-либо клиническим проявлениям [32]; в другом [31] в семье из четырех человек двое гетерозиготных носителей и одна гомозиготная носительница были асимптомны, а в другом случае у гомозиготного носителя произошло два артериальных тромбоза при отсутствии каких-либо кровотечений. Также описано наблюдение гетерозиготного носительства у женщины, у которой в послеродовом периоде развились гематокольпос и синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания [30]. Замена этой аминокислоты приводит к нарушению полимеризации фибрина.

У 2 больных выявленные мутации сочетаются с гетерозиготным полиморфизмом FGB (-455 G>А). В общей популяции этот полиморфизм в регуляторной области гена FGB приводит к повышенной экспрессии белка, что определяет протромботические риски. Гены FGG, в которых были найдены мутации у обследованных больных, и FGB, на экспрессию которого влияет полиморфизм –455 G>А, находятся рядом на хромосоме, но синтезируются независимо друг от друга. Поэтому сложно оценить, как могут взаимодействовать эффекты выявленных мутаций и полиморфизма FGB (-455 G>А).

Дифференциальный диагноз гипофибриногенемии и гиподисфибриногенемии сложен и требует проведения двух лабораторных исследований — клоттингового теста и теста, основанного на определении антигена фибриногена иммунологическими методами. Первый тест определяет функциональную активность фибриногена, второй — концентрацию фибриногена по его антигену. Расхождение результатов тестов свидетельствует о качественных нарушениях структуры фибриногена, то есть о дисфибриногенемии. Соотношение функционального фибриногена к антигену фибриногена менее 0,7 является лабораторным критерием дисфибриногенемии [33–35]. Ввиду отсутствия возможности определения антигена фибриногена, в настоящей работе был использован метод электрофореза с иммунофиксацией с целью подтверждения наличия фибриногена в плазме и ориентировочной оценки его содержания. У больной В. низкие значения концентрации фибриногена в клоттинговом тесте соответствовали следовому количеству фибриногена при проведении иммунофиксации. У больной Ш. содержание фибриногена по данным денситометрии значительно превышало таковое при проведении клоттингового теста, что позволило заподозрить гиподисфибриногенемию. Такие результаты согласуются с результатами генетического анализа, поскольку у больной В. одна из копий гена FGG полностью нефункциональна, в то время как у больной Ш. найдена аминокислотная замена, не приводящая к полному отсутствию синтеза белка.

Анализ анамнестических факторов показал у одной больной наличие взаимосвязи тромбоза с оперативным вмешательством и катетеризацией периферической вены, у другой больной — с приемом КОК. У третьего больного отягощающие заболевания дебютировали через несколько лет после состоявшегося тромбоза, а оперативное вмешательство случилось задолго до него.

При лабораторном исследовании ни у одного из больных не подтвердился АФС, не выявлены мажорные генетические мутации в генах F2 (20210 G>А) или F5 (1691 G>А). Наиболее распространенными генетическими маркерами тромбофилии в этой группе оказались гетерозиготные полиморфизмы в генах FGB (-455 G>А), ITGA2 (807 С >Т) и ITGB3 (1565 Т>C), PAI–I (-675 5G/5G), MTHFR (677 С >Т, 1298 А>C), MTR (2756 А>G).

Таким образом, наследственный дефицит фибриногена не оказывает протекторного действия в отношении развития тромбозов. Более того, наследственный дефицит фибриногена может являться причиной развития тромбозов, что связано с его многофункциональной ролью в системе гемостаза. Патогенез развития тромбозов у больных с наследственным нарушением образования фибриногена многофакторный и может быть связан с определенными специфическими характеристиками основного белкового дефекта и сосуществованием наследственных и приобретенных факторов тромботического риска.