Механизмы действия противоопухолевых иммуномодуляторов — от тератогенности к терапии множественной миеломы

Введение

Иммуномодулирующие препараты (immunomodulatory drugs, IMiDs) представляют собой класс химических производных талидомида, обладающих многочисленными иммуномодулирующими, антиангиогенными, противовоспалительными и цитостатическими эффектами при целом ряде онкогематологических заболеваний, включая множественную миелому (ММ) [1]. Структурно IMiDs объединяет наличие имидной группы. Помимо талидомида данный класс препаратов включает его производные: леналидомид, помалидомид, авадомид и ибердомид. Первым IMiD, зарегистрированным в России в 2009 г., был леналидомид. Широкое применение бортезомиба, леналидомида и трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ауто-ТГСК) привело к существенному улучшению общей выживаемости (ОВ) больных ММ. Медиана ОВ больных ММ в России в 2006–2016 гг. составляла уже около 55–59 мес., что превышает аналогичные показатели в конце 1990-х гг. не менее, чем в 2–2,5 раза [2][3]. Понимание механизма противоопухолевого действия IMiDs началось с открытия молекулярных процессов, лежащих в основе тератогенного эффекта талидомида [4].

Цель настоящего обзора — осветить историю вопроса открытия IMiDs и обсудить молекулярные механизмы их терапевтической активности.

Разработка талидомида и выход на фармацевтический рынок

Талидомид (α-N-фталимидо-глутаримид) был синтезирован из глутаминовой кислоты немецкой фармацевтической компанией «Chemie Grünenthal» в 1954 г. и получил широкую известность в результате своей тератогенности. В период с 1956 по 1962 гг. в ряде стран у матерей, принимавших талидомид для устранения таких неприятных симптомов беременности, как бессонница, беспокойство и утренняя тошнота, родилось от 10 000 до 20 000 детей с врожденными уродствами [5]. Около 5000 детей выжили и не умерли в раннем возрасте, но остались инвалидами на всю жизнь. Максимальное количество жертв «талидомидовой трагедии» имело место в ФРГ и Великобритании.

Первоначально талидомид показал себя как мощное седативное средство, отличное по химической структуре от барбитуратов. Вскоре было обнаружено, что талидомид является также эффективным противорвотным агентом. Это стало поводом для того, чтобы использовать его для коррекции утреннего недомогания и тошноты у беременных. Максимально переносимая доза препарата у лабораторных животных выявлена не была, что послужило основанием считать его абсолютно безопасным. Уже через год компания начала неофициально распространять бесплатные образцы препарата среди врачей ФРГ и Швейцарии. Собственный опыт применения позволил сформировать в среде специалистов очень благоприятное впечатление о талидомиде как о безопасном и не вызывающем привыкания седативном и снотворном препарате. В отличие от барбитуратов, для талидомида исключалась вероятность случайной либо с целью суицида передозировки, что также способствовало продвижению этого продукта на рынке [6]. В 1957 г. талидомид официально поступил в продажу в ФРГ под торговым названием «Contergan», а годом позднее — в Великобритании под маркой «Distaval» и под маркой «Softenon» — в других странах Европы. В общей сложности талидомид стал коммерчески доступным в 46 странах на четырех континентах, где он выпускался под 37 торговыми наименованиями. Дополнительных независимых исследований препарата ни в одной стране не проводилось. Талидомид был одним из самых продаваемых в мире лекарств вплоть до 1961 г., когда его начали выводить из торгового оборота [7].

Вскоре после начала широкого применения талидомида стали появляться сообщения о случаях периферической нейропатии, связанных с приемом препарата. Также стали поступать сообщения о серьезных врожденных дефектах, затрагивающих сразу несколько систем новорожденных, которые, правда, изначально никак не связывались с талидомидом или вовсе отрицались. Несмотря на это, талидомид продолжал занимать лидирующие позиции по продажам и в некоторых странах отставал только от аспирина. По всей видимости, никогда уже не будет известно, сколько именно женщин принимали это лекарство.

Вероятнее всего, предотвратить «талидомидовую катастрофу» было невозможно. Что-то подобное должно было произойти. Упаковка и информационный листок к препарату с указанием соответствующих рисков были совсем скромными по сравнению с теми, какие прилагаются к лекарствам сегодня (рис. 1).

Правила доклинических и клинических исследований лекарств в 1950-х гг. серьезно отличались от современных стандартов. Тестирование талидомида соответствовало правовым нормам того времени, а предметом осуждения является отсроченная реакция компании «Chemie Grünenthal» на сообщения о тератогенности препарата.

В 1960 г. компания «Richardson-Merrell» представила пакет документов по талидомиду на рассмотрение Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration, FDA) в США. Пробное применение лекарственного препарата до его лицензирования было обычной практикой, что позволило производителю свободно распространить в США более 2,5 млн таблеток талидомида. Большинство практикующих врачей сходилось во мнении, что препарат вполне безопасный и эффективный. По счастливому стечению обстоятельств, талидомид не был одобрен в США. Доктор Frances Kelsey, получившая досье талидомида для рассмотрения FDA, выразила обеспокоенность по поводу его безопасности. Одним из основных факторов, повлиявших на решение эксперта, было то, что фармацевтическая компания знала о риске нейропатии, но скрыла это от FDA. Доктор Frances Kelsey впоследствии была награждена Президентской премией за выдающиеся заслуги на федеральной гражданской службе, за предотвращение катастрофы с талидомидом в США, которую ей лично вручил John F. Kennedy [7].

В конце 1961 г. почти одновременно немецкий педиатр Widukind D. Lenz из Гамбурга и австралийский гинеколог William McBride из Сиднея обнаружили связь между врожденными пороками детей и тем фактом, что их матери принимали талидомид на ранних сроках беременности [8][9]. В газете «Welt am Sonntag» было опубликовано письмо профессора W. D. Lenz с описанием более 150 случаев талидомидовой эмбриопатии. Через неделю под давлением прессы и регуляторных органов компания «Chemie Grünenthal» начала отзыв талидомида с фармацевтического рынка. Почти одновременно британская компания «Distillers» по следам статьи доктора W. McBride в журнале «Lancet» объявила об отзыве препарата.

«Талидомидовая катастрофа» полностью изменила подходы к тестированию лекарств [10]. Впервые было продемонстрировано, что существуют межвидовые различия в биологических реакциях на отдельные препараты. Мыши, традиционно используемые для проверки действия лекарств, оказались малочувствительными к талидомиду, в отличие, например, от обезьян или кроликов [11]. Почему мыши не чувствительны к талидомиду — очень долго оставалось непонятным. Между тем, доказательства того, что талидомид вызывает врожденные дефекты, не подлежали сомнению. Было показано, что к действию талидомида чувствительны многие виды животных, в том числе приматы, кролики, броненосцы, сумчатые, хомяки, курицы, морские рыбы и даже бактерии [12].

Особенности тератогенного действия талидомида

Талидомид вызывает повреждение формирующегося эмбриона в течение достаточно короткого временного интервала, получившего название «критического периода». Временное окно находится между 20-м и 36-м днями после оплодотворения (рис. 2) [8][13]. Считается, что до и после этого критического периода талидомид явного тератогенного вреда не причиняет. Однако есть указание на то, что использование талидомида до 20-го дня у людей и крыс приводит к выкидышам, а воздействие на плод у крыс в более поздние сроки — к повреждению головного мозга [14][15]. По всей видимости, безопасного периода времени для приема талидомида не существует.

Временное окно тератогенности талидомида было определено в результате сбора анамнеза у родителей детей, пострадавших от талидомида [8][13]. Оказалось, что одной таблетки талидомида в дозе 50 мг, принятой в период «чувствительного временного окна», вполне достаточно, чтобы привести к очевидным врожденным дефектам развития почти в 50 % случаев [16]. Повреждения плода, вызванные талидомидом, касались самых разных органов и частей тела. Чаще всего у детей возникали фокомелии (тюленеобразные конечности) — отсутствие проксимальных и/или средних частей конечности и соответствующих плечевого или тазобедренного суставов, полное отсутствие верхних или нижних конечностей (амелия), отсутствие ушных раковин, дефекты глаз и мимической мускулатуры. Талидомид влияет на формирование сердечно-сосудистой, пищеварительной и мочеполовой систем, а также может приводить к рождению детей с отклонениями умственного развития и аутизмом. В подробном отчете правительства Великобритании в 1964 г. было указано, что у матерей с подтвержденным во время беременности приемом препарата родилось несколько нормальных детей, по крайней мере, не имевших внешних дефектов, однако неизвестно, не возникли ли у них проблемы в более позднем возрасте [17].

«Временное окно» совпадает с периодом быстрого эмбрионального развития. Начиная с 4 недель, наблюдается активная пролиферация клеток, формирование кровеносных сосудов и органогенез, что сопряжено с активацией множества сигнальных путей. Эмбриогенез длится до 10-й недели беременности, пока эмбрион полностью не сформируется, а в оставшемся периоде беременности происходит дальнейший рост и созревание плода. Поскольку талидомид использовался для лечения утреннего недомогания, которое возникало как раз на 4-й неделе и длилось у некоторых женщин до 12 недель, а у других и вовсе на протяжении всей беременности, это совпадало с основными тератогенными событиями. Воздействие талидомида в начале «временного окна» приводит к максимально серьезным повреждениям конечностей, лицевого скелета, гениталий и внутренних органов (рис. 2) [15].

В исследованиях на нечеловекообразных обезьянах было показано, что воздействие талидомида индуцирует разные повреждения среди особей одного помета, т. е. рожденных в одно время одной самкой [18]. Например, у одного животного могут быть дефекты всех 4 конечностей, а у другого — только одной лапы, или наблюдаться лишь аномалия хвоста. Механизм, лежащий в основе подобных различий, не ясен, но объясняет вариабельность тератогенных эмбриопатий у людей.

Возвращение в клиническую практику

В 1964 г. в иерусалимском госпитале Hadassah доктор Jacob Shaskin на свой страх и риск назначил запрещенный препарат талидомид смертельно больному с узловатой формой лепры. Больной страдал от тяжелых воспалительных процессов и в течение нескольких недель не мог нормально спать от невыносимой боли. После глубокого 20-часового сна больной почувствовал себя ощутимо лучше и смог продолжить лечение талидомидом с хорошим долгосрочным эффектом [19]. Позднее ВОЗ провела большое исследование с привлечением 4,5 тыс. больных лепрой, показавшее 99 % эффективность талидомида [20]. В 1998 г., почти через 40 лет после громкой ятрогенной трагедии, FDA зарегистрировала талидомид для лечения лепры, при этом обязав производителя использовать строгие ограничительные меры при назначении препарата.

В 1994 г. из лаборатории доктора Judah M. Folkman вышла статья, в которой было показано, что талидомид подавляет рост сосудов в роговице кролика [21]. Эти результаты совпадали с ранней гипотезой J. M. Folkman [22], заключавшейся в предположении того, что для роста злокачественных опухолей требуется развитие новых кровеносных сосудов (неоангиогенез), и подавление этого процесса может стать одним из направлений противораковой терапии. В те годы J. M. Folkman проводил прикладные исследования в Гарварде и в детской больнице Бостона (США), где руководил отделением биологии сосудов. Почти в то же время, в 1997 г. в клинике университета Арканзаса в Фейетвилле (США) у профессора Bart Barlogie лечился 35-летний мужчина Ira Wolmer, кардиолог по профессии, страдавший тяжелой ММ, которая была диагностирована в 1995 г. Лечение не помогало, и он умирал в результате прогрессии ММ после трех трансплантаций костного мозга и введений экспериментальной вакцины. Никто не исследовал талидомид при ММ до того момента, пока к Bart Barlogie не обратилась миссис Beth Wolmer — жена этого больного, юрист из Манхэттена. Она связалась с профессором J. M. Folkman, а позже уговорила Bart Barlogie тоже позвонить ему и обсудить возможность лечения ее мужа талидомидом. К осени 1997 г. Bart Barlogie получил разрешение на испытание талидомида. Препарат не подействовал, и больной умер в марте 1998 г. Однако уже у второго больного, участвовавшего в исследовании, наступила полная ремиссия [23]. В 1999 г. Bart Barlogie опубликовал результаты исследования талидомида у онкологических больных с рефрактерностью к доступным методам лечения. Талидомид оказался эффективным средством лечения ММ [24]. В 2006 г. FDA одобрило применение талидомида в комбинации с дексаметазоном у больных с рецидивирующей/рефрактерной (Р/Р) ММ.

Открытие цереблона как первичной мишени IMiDs

Более 20 лет в поиске новых лекарств исследователи из лаборатории Hiroshi Handa Токийского медицинского университета проводили работы по определению аффинности серии низкомолекулярных биоактивных соединений к отдельным клеточным таргетным белкам [25]. В ходе проведения этих изысканий в 2010 г. было обнаружено, что непосредственной молекулярной мишенью талидомида является белок цереблон (Cereblon, CRBN) [26]. И хотя цереблон был белком с неизвестной на момент открытия функцией, стало ясно, что он служит субстратным рецептором особого фермента — убиквитинлигазы Е3, содержащей RING-домен (сокращенное название CRL4^CRBN Е3-лигаза). Помимо цереблона, данный ферментный комплекс включает в себя белок, связывающийся с местом повреждения ДНК (DNA damage-binding protein 1, DDB1), куллин-4 (CUL4 А/В) и регулятор куллинов-1 (Regulator of cullins-1, ROC1), часто называемый, как RING box protein-1 (RBX1) [27]. Белок DDB1 работает как адаптер, соединяющий цереблон непосредственно с CUL4. Сам CUL4 является гидрофобным белком, служащим жестким матриксом для данной конструкции, а RBX1 отвечает за полимеризацию убиквитина. RBX1 содержит небольшой цинк-связывающий домен RING (Really Interesting New Gene), который является эволюционно консервативным и необходимым для эмбрионального развития. Вместе CUL4 и RBX1 формируют каталитическое ядро убиквитинлигазы [28]. Схематическое изображение механизма действия IMiDs представлено на рисунке 3.

В физиологических условиях CRL4^CRBN Е3-лигаза участвует в регуляции клеточного цикла, репарации ДНК и репликации хроматина посредством убиквитирования соответствующих таргетных белков [29]. Белки с присоединенными полиубиквитиновыми цепочками подвергаются последующей протеолитической деградации с помощью протеасомы 26S [30]. Для успешной протеолитической деградации белка в протеосоме 26S необходимо, чтобы он был отмечен цепочкой, состоящей не менее чем из четырех молекул убиквитина. Таким образом, действие IMiDs заключается в узко специфичном протеолизе, регулируемым цереблоном. Гиперэкспрессия цереблона с дефектом области связывания с талидомидом у цыплят и аквариумных рыбок Danio rerio нивелирует тератогенность, индуцированную талидомидом [26]. Первоначально предполагалось, что талидомид просто ингибирует активность CRL4^CRBN Е3-лигазы, но впоследствии было установлено, что фермент приобретает способность убиквитировать другие белки (нео-субстаты), нежели те, что направляются на протеолиз в естественном состоянии, когда нет воздействия IMiD [31].

Способы реализации противовоспалительной активности IMiDs менее изучены и по всей видимости не зависят от цереблона. Предполагается, что эффект развивается через воздействие на 3’-UTR область мРНК, кодирующих провоспалительные цитокины с последующим нарушением трансляции соответствующих белков (рис. 3) [32]. Как это точно происходит, до конца не ясно.

Механизм тератогенного действия талидомида

Относительно недавно было показано, что тератогенный эффект талидомида опосредуется через убиквитирование Sal-подобного белка 4 (SALL4) [33]. SALL4 представляет собой фактор транскрипции семейства белков, содержащим в качестве ДНК-связывающего домена мотив цинковые пальцы Cys2/His2-типа [34]. Очень показательно, что мутации гена SALL4 приводят к наследственным заболеваниям, которые имеют поразительное сходство с талидомидной эмбриопатией. Примером подобного состояния является синдром Дуэйна-радиального луча (Duane-radial ray syndrome), проявляющийся врожденным косоглазием с неспособностью глаза двигаться кнаружи (аномалия Дуэна) и вариабельной патологией строения предплечий и кистей рук (например, частичное или полное отсутствие лучевой кости). Синдром наследуется по аутосомно-доминантному типу и может сочетаться с глухотой, изменением строения ушной раковины, поражением сердца и почек, дефектами лицевого скелета [33].

«Классические» IMiDs (талидомид, леналидомид и помалидомид) представляют собой рацемическую смесь R- и S-энантиомеров, поворачивающихся вокруг хирального центра — атома углерода в положении С3 глутаримидного кольца (рис. 4A). S-энантиомер в первую очередь отвечает за тератогенные эффекты, а R-энантиомер обеспечивает фармакологическую активность [35]. Синтез чистого R-энантиомера ничего не решает, поскольку в физиологических условиях происходит взаимное превращение двух форм. Тем не менее оказалось возможным создать конфигурационно неконвертируемые формы IMiDs посредством замены атома водорода в хиральном центре на более стабильный фтор (например, 3-фтор-талидомид), что эффективно ингибирует рацемизацию. S- и R-хирально стабильные иммуномодуляторы демонстрируют разную степень связывания с цереблоном [36].

По результатам кристаллографических исследований установлено, что взаимодействие IMiDs c CRL4^CRBN Е3-лигазой, происходит через специальный рецепторный карман, образованный тремя консервативными остатками триптофана (W) на поверхности цереблона — W380, 386 и 400 [37].

Глутаримидное кольцо любого IMiD стыкуется с бороздками, созданными боковыми цепями аминокислотных этих трех остатков триптофана (рис. 4Б). Фталимидная часть препарата выступает из связывающего домена, меняя конфигурацию цереблона таким образом, что это позволяет ему взаимодействовать с белками нео-субстратами, в частности с SALL4 [36]. S-энантиомерная форма талидомида легче встраивается в связывающий домен цереблона и вызывает тератогенность примерно в 10 раз меньшей концентрации, чем R-вариант данной молекулы [37].

Еще одним нео-субстратом цереблона, определяющим тератогенные эффекты, опосредованные талидомидом, является опухолевый белок p63 [39]. р63 относится к семейству факторов транскрипции p53 и участвует во множестве биологических процессов, включая дифференцировку клеток, апоптоз, онкогенез и процессы старения [40]. В результате воздействия альтернативных промоторов с гена TP63 генерируются транскрипты, кодирующие один из двух ключевых изомеров этого белка TAp63 и ΔNp63. Оба они были идентифицированы в качестве талидомид-зависимых нео-субстратов цереблона у рыбок данио, причем ΔNp63 требовался для нормального развития плавников, а TAp63 — для формирования улитки и развития слуха. Экспрессия обеих форм белка p63 снижалась при воздействии талидомида [39].

Недавно был идентифицирован еще один нео-субстрат цереблона, отвечающий за тератогенность талидомида — продукт гена PLZF (promyelocytic leukemia zinс finger), синоним — ZBTB16 [40]. Первоначально ген PLZF привлек к себе внимание благодаря редкой хромосомной транслокации t (11;17) (q23; q21) с образованием химерного гена PLZF/RARα при остром промиелоцитарном лейкозе [41]. Выключение гена PLZF у мышей приводило у их потомства к дефектам скелета и недоразвитию конечностей [42]. Белок PLZR (подобно SALL4) относится к семейству факторов транскрипции, содержащих мотив цинковые пальцы Cys2/His2-типа, убиквитирование которого в присутствии талидомида или одного из его метаболитов 5-гидрокситалидомида приводило к формированию «тератогенного» фенотипа цыплят с характерным укорочением конечностей [43].

У мелких грызунов талидомид не вызывает тератогенные эффекты [44]. Гомология мышиного CRBN с человеческим составляет примерно 95 %, что позволяет ему легко реагировать с талидомидом и другими IMiDs, однако в результате двух ключевых аминокислотных замен не происходит убиквитинирования и протеолитической деградации ряда важных нео-субстратов, включая SALL4 [39] и PLZF [43][44]. Вместо глутаминовой кислоты 377 цереблона человека (E377) у мыши располагается валин (V), а в позиции валина 388 (V388) — изолейцин (I). В эксперименте с культурой плюрипотентных стволовых клеток человека было показано, что мутация цереблона V388I устраняет индуцированную талидомидом протеолитическую деградацию SALL4 [45]. Обратная мутация I391V у мышей запускала протеолитическую деградацию SALL4 и PLZF, приводя к реализации тератогенного потенциала талидомида у этих животных (рис. 5) [43].

Механизм противоопухолевой активности IMiDs

Наиболее важные и изученные на сегодняшний день нео-субстраты IMiDs для убиквитирования CRL4^CRBN Е3-лигазой представлены в таблице 1.

В 2014 г. две исследовательские группы независимо друг от друга установили, что IMiDs запускают протеасомную деградацию двух В-клеточных факторов транскрипции Ikaros (IKZF1) и Aiolos (IKZF3) [46][47]. J. Krönke и соавт. [46] установили, что леналидомид взаимодействует с CRBN^CRL4 Е3-лигазой и вызывает избирательное убиквитинирование и деградацию IKZF1/3 в культуре миеломных клеток MM1S. Замена одной аминокислоты в Aiolos устраняла ингибирование леналидомидом роста клеток. Кроме того, авторы показали, что стимуляция леналидомидом Т-клеток к продукции интерлейкина-2 (ИЛ-2) также опосредуется истощением IKZF1/3. В свою очередь G. Lu и соавт. [47] обнаружили селективное подавление IKZF1/3 под действием леналидомида в эмбриональных клетках почки.

Ikaros и родственные белки (Aiolos, Helios, Eos, Pegasus) относятся к факторам транскрипции семейства белков IKZF, содержащих мотив цинковые пальцы Cys2His2-типа, и играют ключевую роль в развитии и в дифференцировке клеток [48]. Белки IKZF могут выступать как активаторы, так и ингибиторы транскрипции отдельных генов [49]. Eos и Pegasus представлены в довольно широком спектре тканей, тогда как Ikaros, Helios и Aiolos в основном экспрессируются в клетках иммунной системы. Ikaros и Helios присутствуют также в некоторых неиммунных клетках, в частности в эритроцитах [48]. В ряде исследований была показана роль этих белков в патогенезе некоторых гемалогических опухолей. Например, гиперэкспрессия укороченной формы Ikaros, лишенного в результате мутаций N-терминального мотива ZF, ассоциируется с развитием B-линейного острого лимфобластного лейкоза, что указывает на онкосупрессорную роль этого фактора транскрипции [50]. Подобные находки объясняют риск вторых первичных злокачественных опухолей (по крайней мере гемобластозов) у больных ММ, получающих длительную терапию леналидомидом.

IMiDs обладают выраженной противоопухолевой активностью, которая реализуется посредством прямого ингибировании роста клеток ММ и стимуляции иммунных эффекторных клеток (рис. 6).

Гетеродимер, образуемый Ikaros и Aiolos, в клетках ММ выполняет функцию фактора транскрипции, препятствующего апоптозу, и поэтому его деградация под действием IMiDs вызывает подавление пролиферации и гибель клеток [46][47]. Деплеция Ikaros и Aiolos приводит к подавлению c-Myc и интерферон регулирующего фактора 4 (Interferon regulatory factor 4, IRF4), также известного как MUM1, отвечающих за пролиферацию и выживаемость клеток ММ [51]. Устойчивая экспрессия c-Myc и IRF4 в злокачественных плазматических клетках является следствием активирующих мутаций и накопления эпигенетических изменений. Степень экспрессии c-Myc и IRF4 прогредиентно увеличивается по мере прогрессирования заболевания от моноклональной гаммапатии неясного значения (МГНЗ) к симптоматической миеломе, подтверждая тем самым их роль в патогенезе [52].

Патологическая сигнальная система, в которой IRF4 и c-Myc регулируют друг друга по принципу положительной обратной связи, поддерживает аномальную пролиферацию плазматических клеток [53]. IRF4 связывается с промоторной областью c-Myc и усиливает его экспрессию, а c-Myc в свою очередь активирует ген IRF4. Многочисленные исследования показали, что генетическое или фармакологическое подавление экспрессии IRF4 или c-Myc вызывает остановку клеточного цикла и понижает жизнеспособность клеток ММ. Гены-мишени c-Myc включают регуляторы клеточного цикла (Cdks, циклины и продукты генов E2F), апоптоза и клеточного метаболизма (GLUT1 и др.) [54]. Важно отметить, что большая группа генов (более 200), участвующих в регуляции роста и выживания клеток MM, контролируется непосредственно IRF4. Среди вторичных мессенджеров IRF4 ключевую роль играют Krüppel-подобный фактор 2 (KLF2) и белок, индуцирующий созревание В-лимфоцитов 1 (B-lymphocyte-induced maturation protein-1, BLIMP-1). Помимо того, что KLF2 и IRF4 взаимно усиливают собственную экспрессию, они активируют гистоновую деметилазу KDMA3, которая, в свою очередь, снимает супрессию с промоторных регионов указанных генов (деметилирование). Истощение как KLF2, так и KDMA3 запускает апоптоз и уменьшает адгезию злокачественных плазматических клеток к стромальным элементам костного мозга, подавляя тем самым их жизнеспособность [55]. Blimp-1 и IRF4 регулируют дифференцировку плазматических клеток и необходимы для продукции антител. В случае гиперэкспрессии IRF4 в клетках MM помимо c-Myc отмечается высокая экспрессия Blimp-1 [56].

Ikaros и Aiolos в физиологических условиях подавляют экспрессию CD38 в плазматических клетках посредством ремоделирования нуклеосом и комплекса деацетилаз. IMiD-индуцированная деградация обсуждаемых факторов транскрипции может усиливать экспрессию CD38 на поверхности клеток MM и, таким образом, потенцировать NK-опосредованную антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ) даратумумаба [57].

Активация врожденного противоопухолевого иммунитета

Способность IMiDs усиливать функциональную активность NK-клеток при ММ известна давно. Первоначально предполагалось, что активация NK-клеток происходит опосредованно через ИЛ-2, который вырабатывают Т-лимфоциты [58]. Однако позже было установлено, что леналидомид способен оказывать на NK-клетки прямое действие. В эксперименте леналидомид увеличивал продукцию интерферона-γ (ИФН-γ) NK-клетками, выделенными из крови больных ММ, посредством перестроек кортикального актина иммунологических синапсов. Таким образом, леналидомид повышает проницаемость мембраны для везикул ИФН-γ после активации клетки через рецептор CD16 [59]. Непосредственное усиление активности NK-клеток происходит преимущественно за счет синтеза цитотоксической молекулы гранзима B (GZM-B). Aiolos действует как супрессор гена GZM-B, и поэтому NK-клетки после культивирования с IMiDs приобретают повышенную активность данной протеазы [60].

Важным клеточным компонентом опухолевого микроокружения, участвующем в эволюции МГНЗ в MM, являются цитокин-секретирующие врожденные лимфоидные клетки (innate lymphoid cells, ILCs) [61][62]. ILCs характеризуются эффекторными функциями, сходными с таковыми CD4⁺-Т-хелперов, и делятся на 3 группы (ILC1, ILC2 и ILC3) в зависимости от профиля секретируемых цитокинов [63]. По сравнению со здоровыми донорами у больных МГНЗ в костном мозге выше содержание ILC1, но ниже ILC2. В процессе трансформации МГНЗ в симптоматическую миелому субпопуляционный состав ILCs остается неизменным, но способность продуцировать цитокины значительно снижается. Предполагается, что функциональные нарушения со стороны этого типа клеток могут играть важную роль в патогенезе трансформации. Леналидомид, как оказалось, подавляет Ikaros и Aiolos в ILCs, что было зарегистрировано по усилению секреции ИФН-γ ILC1 [64]. Леналидомид был первым препаратом, с помощью которого была показана возможность затормозить процесс трансформации «тлеющей» миеломы [61].

Дендритные клетки (ДК) — это еще одна категория клеток, задействованных в реализации противоопухолевого иммунного ответа, на которую можно воздействовать с помощью IMiDs. Функционально ДК представляют собой гетерогенную популяцию антигенпрезентирующих клеток костномозгового происхождения, которая играет ключевую роль в инициации адаптивного иммунного ответа. ДК больных с ММ в большинстве случаев являются функционально неполноценными. Они характеризуются слабой экспрессией маркеров созревания и не способны индуцировать пролиферацию аллогенных Т-клеток [65]. Терапия леналидомидом и помалидомидом у больных ММ запускает созревание и стимулирует антиген-презентирующую функцию ДК [66][67]. В процессе культивирования с леналидомидом ДК, выращенных и дифференцированных in vitro из моноцитов костного мозга и крови больных ММ, в них повышается экспрессия маркеров созревания (CD86, HLA-DR и CD209), продукция цитокинов и хемокинов (ИЛ-8, фактора некроза опухоли α (ФНО-α), CCL2, CCL5) и, что особенно важно, способность стимулировать пролиферацию аллогенных Т-клеток [68]. Предполагается, что одним из механизмов активации ДК у больных ММ в процессе терапии леналидомидом является деградация Ikaros [69].

Активация адаптивного противоопухолевого иммунного ответа

В исследованиях in vitro было показано, что культивирование Т-клеток с IMiDs усиливает их пролиферацию, повышает секрецию ИЛ-2 и ИФН-γ и вызывает активацию NK- и NKT-клеток [70]. Модуляция экспрессии гетеродимера IKZF1/3 в Т-клетках может опосредовать многие иммунологические эффекты IMiDs. Ikaros и Aiolos действуют как критические регуляторы гомеостаза Т-клеток, которые определяют их развитие, дифференцировку и активацию [71]. Т-лимфоциты с мутациями Ikaros могут быть гиперчувствительными к сигналам от Т-клеточного рецептора и к стимуляции ИЛ-2 по сравнению с Т-клетками «дикого» типа [72]. По всей видимости, Ikaros и Aiolos обладают способностью регулировать порог чувствительности, необходимый для активации Т-клеток [71].

Исследования на животных и клинические данные неоднозначны. С одной стороны, в процессе терапии IMiDs повышается активность Т-лимфоцитов, реализующих противомиеломную функцию, а с другой стороны, увеличивается популяция регуляторных Т-клеток (Treg) и миелоидных клеток-супрессоров, подавляющих иммунный ответ [73]. Впрочем, последний эффект может быть связан с иммунодепрессивным действием дексаметазона, который часто входит в терапевтические комбинации с леналидомидом и помалидомидом [74]. У больных впервые диагностированной ММ поддерживающее лечение леналидомидом после ауто-ТГСК сопровождалось разнонаправленными плейотропными эффектами, включающими увеличение фракции наивных CD8⁺-T-лимфоцитов и снижение числа терминально дифференцированных Т-клеток; увеличение экспрессии ко-стимулирующих рецепторов на покоящихся Т-клетках и одновременно молекул ингибиторов контрольных точек иммунного ответа LAG-3 на CD4⁺-T-клетках и TIM-3 на CD4⁺- и CD8⁺-T-лимфоцитах. Также в этом исследовании было отмечено увеличение количества Treg со строгим иммуносупрессивным фенотипом [75]. Правда, в тестах in vitro культивирование Treg с леналидомидом или помалидомидом сопровождалось заметным снижением их супрессорной активности [76].

В экспериментальной модели у мышей с выключенным в зрелых T-клетках геном IKZF1 было обнаружено нарушение генерации Treg и направление дифференцировки в сторону Т-хелперов 17-го типа (Th17) [77]. Ikaros-дефицитные Т-клетки в данной экспериментальной модели после активации гиперэкспрессировали гены цитокинов ИЛ-2, ИФН-γ, ФНО-α и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора. Эти данные подтверждают роль Ikaros как ключевого регулятора продукции цитокинов Т-лимфоцитами. Предполагается, что изменение экспрессии и функциональной активности Ikaros может значительно влиять на Т-клеточный компартмент опухолевого микроокружения. В физиологических условиях Ikaros и Aiolos связываются с промоторной областью гена IL-2 и подавляют транскрипцию. Соответственно, деградация этих факторов транскрипции объясняет усиленную продукцию ИЛ-2 Т-лимфоцитами, культивированными с IMiDs [58].

Интригующим выглядит факт снижения в процессе терапии IMiDs экспрессии ингибиторных молекул контрольных точек иммунного ответа. В одном из клинических исследований поддерживающая терапия леналидомидом ассоциировалась со снижением экспрессии отвечающего за подавление иммунного ответа белка PD-1 на CD8⁺-Т-лимфоцитах [78]. В модели ММ у мышей терапия помалидомидом в комбинации с дексаметазоном сопровождалась значительной редукцией экспрессии PD-1 на T-клетках опухолевого микроокружения [79]. Все это может свидетельствовать об активации иммунного ответа, однако нельзя исключать альтернативную версию банального ослабления иммунного подавления Т-клеток опухолью в условиях постепенной элиминации клона плазматических клеток. Фактом редукции PD-1 можно объяснить высокую частоту иммуноопосредованных нежелательных явлений в клинических исследованиях комбинаций леналидомида и помалидомида с анти-PD-1 ингибитором пембролизумабом [80][81]. Скорее всего, выключение PD-1 с помощью двух разных механизмов действительно может сопровождаться чрезмерной активаций иммунного ответа.

Кроме того, длительное использование IMiDs, в том числе в качестве поддерживающей терапии при ММ, может увеличить частоту неконтролируемых иммуноопосредованных эффектов в виде индукции хронических воспалительных и аутоиммунных реакций [82]. Ярким примером подобных проблем является характерное поражение кожи, иногда возникающее в процессе терапии леналидомидом, по всей видимости, протекающих по типу реакции гиперчувствительности замедленного типа [83].

В случае резистентности непосредственно самой опухоли к конкретному IMiD его иммуностимулирующие эффекты в отношении Т- и NK-клеток сохраняются. В частности, у больных ММ с известной резистентностью к леналидомиду при лечении комбинацией леналидомида, циклофосфамида и преднизолона по-прежнему наблюдалась деградация Ikaros и Aiolos в T-, B- и NK-клетках, что значимо для достижения клинического успеха [84]. Эти данные подчеркивают важность иммуномодулирующей активности IMiDs и открывают путь к новым комбинациям препаратов для лечения Р/Р ММ [85].

Помалидомид в терапии Р/Р ММ

Помалидомид — IMiD третьего поколения, одобренный для лечения больных ММ с двойной рефрактерностью — к леналидомиду и ингибиторам протеасом. Препарат продемонстрировал высокую цитотоксическую активность в экспериментальных моделях опухолей, рефрактерных к леналидомиду [86], и в многочисленных клинических исследованиях [87]. Активность леналидомида и помалидомида на несколько порядков выше, чем у талидомида. Основные фармакологические и биологические отличия помалидомида и других IMiDs обобщены в таблице 2.

Леналидомид в терапии миелодиспластического синдрома

Больные миелодиспластическим синдромом (МДС) с делецией del(5q) обладают уникальной чувствительностью к леналидомиду, позволяющей получить цитогенетический ответ в 50 % случаев. Результатом указанной делеции длинного плеча хромосомы 5 является утрата фрагмента ДНК размером 1,5 Мб, кодирующего 6 микро-РНК и 44 гена, в том числе определяющих синтез рибосомного белка Rps14 и фермента казеинкиназы 1α (CK1α). Для МДС с del (5q) характерна гаплонедостаточность гена CSNK1A1, кодирующего CK1α [88].

CK1α была идентифицирована в качестве нео-субстрата леналидомида для убиквитин-опосредованной деградации. CK1α ингибирует p53, образуя стабильную связь с регуляторным белком MdmX [89]. MdmX связывается с N-концевой областью p53 и подавляет его транскрипционную активность [90]. Культивирование с леналидомидом сопровождалось почти полной потерей CK1α в стволовых гемопоэтических клетках человека, полученных от больных МДС с del(5q) [91]. Деградация CK1α в процессе терапии леналидомидом больных МДС приводит к эрадикации опухолевого клона, несущего del(5q) [92]. Другой важной ролью CK1α является регуляция канонического сигнального пути Wnt/β-катенин, осуществляющего контроль пролиферации, дифференциации, миграции и апоптоза клеток. В данном случае CK1α отвечает за многоступенчатое фосфорилирование β-катенина, которое необходимо для последующего убиквитинирования SCFβ-TrCP E3 лигазой и расщепления в протеасоме 26S [93].

Талидомид и помалидомид не запускают протеасомную деградацию CK1α и не эффективны в терапии МДС с del(5q). Таким образом, несмотря на схожую химическую структуру, IMiDs очевидным образом могут иметь как общие, так и уникальные нео-субстраты, определяющие терапевтический профиль конкретного лекарства.

Новое поколение иммуномодулирующих агентов

Основываясь на точном понимании основного механизма действия структурных производных талидомида, следующая за IMiDs серия терапевтических молекул получила название препаратов, модулирующих цереблон E3-лигазу (Cereblon E3 Ligase Modulating Drugs, CELMoDs). Цель разработки новых CELMoDs заключается в необходимости преодолеть резистентность к «классическим» IMiDs и расширить терапевтический спектр за счет воздействия на новые белки-мишени. В настоящее время как минимум 5 препаратов CELMoDs находятся на разных стадиях клинических исследований (рис. 7).

Авадомид (CC-122) структурно наиболее близок к помалидомиду, в связи с чем имеет сходную субстратную специфичность и особенности метаболизма. Помимо традиционных нео-субстратов, таких как IKZ1/3, было установлено, что авадомид индуцирует цереблон-опосредованное убиквитирование и протеосомное расщепление еще одного Zn-содержащего фактора транскрипции ZMYM2 [94]. ZMYM2 хорошо известен благодаря вовлеченности в хромосомные реаранжировки с генами FGFR1 и FLT3 при ряде гематологических опухолей. Образование химерного гена ZMYM2-FGFR1 в результате транслокации t(8;13)(p11; q12) характерно для больных с сочетанием Т-лимфобластной лимфомы, эозинофилии и миелопролиферативного заболевания [95][96]. Другой химерный ген ZMYM2-FLT3 возникает вследствие скрытой инверсии хромосомы 13 при лимфоидных и миелоидных опухолях, протекающих с эозинофилией [97]. Эффективность монотерапии авадомидом была продемонстрирована в исследовании I фазы у Р/Р диффузной В-крупноклеточной лимфомой, в котором общего ответа достигли 29 % больных, включая 11 % полных ремиссий [98]. Продолжаются исследования авадомида в комбинации с анти-PD1 антителами при метастатической меланоме и распространенных стадиях гепатоцеллюлярного рака [94].

Ибердомид (CC-220) — самый продвинутый на сегодняшний день CELMoDs, дошедший до старта нескольких клинических исследований III фазы. Препарат обладает повышенной аффинностью связывания с цереблоном и противоопухолевой активностью на миеломных клеточных линиях с рефрактерностью к леналидомиду и помалидомиду [99]. Ибердомид имеет существенные отличия химической структуры от IMiDs (рис. 7) и может иметь оригинальный спектр убиквитилируемых нео-субстратов. В комбинации с дексаметазоном (исследование Ib/IIa фазы) у больных с Р/Р ММ частота общего ответа составила 35,3 % у больных с рефрактерностью к леналидомиду и помалидомиду и 29,6 % у больных с рефрактерностью к помалидомиду и даратумумабу [100]. Предварительные данные по комбинациям ибердомида с даратумумабом (IberDd), бортезомибом (IberVd) и карфилзомибом (IberKd) у больных с Р/Р ММ, полученные в исследовании CC-220-MM-001 (фаза I/II), обнадеживают [101]. Ибердомид продемонстрировал активность у больных системной красной волчанкой (54,3 % ответов против 34,9 % в группе плацебо; р = 0,011), эффективно подавляя продукцию аутоантител [102]. Препарат близок к клинической регистрации в качестве противомиеломного агента.

Мезигдомид (CC-92480) в эксперименте продемонстрировал противоопухолевую активность в отношении клеточных линий ММ, рефрактерных к леналидомиду и помалидомиду с крайне низкой остаточной экспрессией цереблона (механизм формирования резистентности) [103]. В дозо-эскалационном исследовании CC-92480-MM-001 (фаза I) была набрана крайне неблагоприятная когорта больных с Р/Р ММ (n = 74) c медианой линий предшествующей терапии, равной 6, наличием экстрамедуллярных поражений в 37 % случаев, рефрактерностью к помалидомиду — 79 %, ингибиторам протеасом — 74 % и анти-CD38–70 %. Частота общего ответа на терапии CC-92480 в комбинации с дексаметазоном составила 21 % по всей группе и 48 % — в подгруппе больных, получивших финальный дозовый режим назначения препарата (1,0 мг в дни 1–21/28) [104].

CC-90009 отличается от «классических» IMiDs таргетной активностью в отношении гидралаз GSPT1 (G1 To S Phase Transition 1) и GSPT2, которые гидролизуют гуанозинтрифосфат (ГТФ) и выполняют роль регуляторов завершения трансляции [105, 106]. В исследовании CC-90009-AML-001 (фаза I) препарат был протестирован в группе больных с рефрактерными случаями МДС высокого риска и острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) и продемонстрировал многообещающую активность в качестве моноагента. В общей сложности было пролечено 49 больных, у 4 из которых была достигнут полный или более глубокий ответ [107]. CC-90009 продолжает исследоваться при МДС и ОМЛ, в том числе в комбинации с гипометилирующими агентами, венетоклаксом и ингибитором FLT3 гилтеритинибом [94].

СС-885 — еще один новый CELMoDs, обладающий помимо ММ потенциальной активностью против солидных опухолей и ОМЛ. В качестве нео-субстратов CC-885 для таргетного убиквитирования были идентифицированы белки GSPT1 [106], BNIP3L [108] и циклин-зависимой киназы CDK4 [109]. BNIP3L является регулятором митофагии (механизм элиминации дисфункциональных митохондрий) и апоптоза, как оказалось, имеющим важное значение в патогенезе ОМЛ [110]. Публикации по данному препарату пока ограничены доклиническими исследованиями.

Таким образом, понимание молекулярной биологии активности IMiDs стало основой создания серии новых лекарственных препаратов, направленных на активацию убиквитин-опосредованной деградации таргетных клеточных белков. Логичным продолжением клинического успеха «классических» противоопухолевых иммуномодуляторов стал новый класс терапевтических молекул CELMoDs (ибердомид, авадомид и др.), ориентированных на преодоление сформировавшейся рефрактерности к IMiDs и расширение спектра уникальных нео-субстратов и поддающихся, таким образом, лечению болезней. С помощью молекулярной технологии убиквитин-опосредованной деградации белков можно разорвать патологические сигнальные цепи, обеспечивающие рост и выживание опухолевых клеток, активировать иммунный ответ и подавить секрецию провоспалительных цитокинов. При этом можно фармакологически инактивировать «трудно уязвимые» белки, которые не имеют никаких специфических детерминант для связывания малых молекул или распознавания моноклональными антителами. Регулируемая с помощью IMiDs и CELMoDs протеасомная деградация таргетных белков представляется инновационной парадигмой создания новых лекарств для лечения онкологических и иммуновоспалительных заболеваний.