Перейти к:
БОЛЕЗНЬ ВИЛЛЕБРАНДА: СОПОСТАВЛЕНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ, КОАГУЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДАННЫХ
https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-3-246-255
Аннотация
Введение. Болезнь Виллебранда (БВ), являющаяся одной из самых распространенных коагулопатий, имеет сложный характер наследования, который, в зависимости от типа заболевания, может быть как доминантным, так и рецессивным.
Цель настоящей работы — сопоставление клинических, коагулогических и молекулярно-генетических данных, полученных при обследовании больных различными типами БВ. Материалы и методы: экзоны гена vWF для 16 больных БВ секвенировали по методу Сэнгера.
Результаты. Всего было выявлено 12 различных мутаций, одна из которых (Pro2527His) ранее в мировой популяции не встречалась. Наиболее распространенной оказалась микроделеция c.2435delC, являющаяся мажорной во многих странах Европы. Она встретилась у 9 больных, 6 из которых имели самый тяжелый рецессивный 3-й тип заболевания (3 гомозиготы). Еще у 2 больных это нарушение сочеталось с миссенс-мутацией Thr791Met, что позволило диагностировать у них достаточно редкий рецессивный вариант БВ — 2N. В целом, данные молекулярно-генетического анализа соответствовали результатам дифференциальной диагностики типа БВ, основанной на клинической картине заболевания и коагулогических характеристиках. Только в одном случае у больной с предполагаемым 1-м типом БВ была выявлена мутация Arg1374Cys, характерная для типа 2 (A/M). Большая часть мутаций была обнаружена в экзонах 18 (преимущественно это была делеция c.2435delC) и 28, что делает эти экзоны наиболее перспективными при поиске мутаций.
Заключение. Начинать поиск мутаций в гене vWF целесообразно с экзонов 18 и 28. Полученные данные могут послужить основой для создания экономичного алгоритма поиска мутаций в гене vWF у отечественных больных БВ.
Для цитирования:
Чернецкая Д.М., Лихачева Е.А., Пшеничникова О.С., Сурин В.Л., Зозуля Н.И. БОЛЕЗНЬ ВИЛЛЕБРАНДА: СОПОСТАВЛЕНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ, КОАГУЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДАННЫХ. Гематология и трансфузиология. 2019;64(3):246-255. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-3-246-255
For citation:
Chernetskaya D.M., Likhacheva E.A., Pshenichnikova O.S., Surin V.L., Zozulya N.I. VON WILLEBRAND DISEASE: CLINICAL, COAGULOGICAL, MOLECULAR AND GENETIC DATA COMPARISON. Russian journal of hematology and transfusiology. 2019;64(3):246-255. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-3-246-255
Введение
Болезнь Виллебранда (БВ) относится к наиболее распространенным наследственным коагулопатиям. По результатам эпидемиологического исследования [1], частота встречаемости индивидов со сниженной плазменной активностью фактора Виллебранда в различных популяциях может достигать 1 %, хотя по оценкам специализированных медицинских центров, основанным на данных комплексного анализа, включающего коагулогические и генетические тесты, частота встречаемости БВ не превышает 1:10 000 [2]. Заболевание вызывается дефицитом или структурно-функциональными нарушениями фактора фон Виллебранда (vWF) — крупного мультимерного гликопротеина, играющего важную роль в поддержании гемостаза. Разные домены этого белка взаимодействуют с фактором свертывания крови VIII (FVIII), гликопротеинами на поверхности тромбоцитов и коллагеном [3]. Ген vWF локализован в прителомерной области короткого плеча 12-й хромосомы (12p13.31), занимает на ней около 178 тпн и состоит из 52 экзонов [4]. Существует также частичная копия этого гена — непроцессированный псевдоген на длинном плече хромосомы 22 (22q11—13), включающий экзоны 23—34 и имеющий гомологию с геном 97 % [5].
Различают первый, второй и третий типы БВ, причем для второго типа выделяют также четыре подтипа заболевания (2A, 2B, 2M и 2N) [6]. Общая и дифференциальная (по типам) диагностика БВ осуществляется на основе определения клинического, лабораторного и молекулярного фенотипов. Геморрагический синдром преимущественно по микроциркуляторному типу варьирует в широких пределах — от легких, малосимптомных, до тяжелых клинических форм. Фенотипы БВ во многом определяются генетическим фоном и зависят от типа мутации, степени экспрессии гена, а также остаточной функциональной активности гликопротеина. В этой связи внутри каждого типа БВ могут наблюдаться субпопуляции с тяжелыми или более легкими проявлениями [7]. При тяжелых формах, преимущественно 3-м типе БВ, помимо кровоточивости из слизистых оболочек, могут возникать гемартрозы. Однако данные о частоте артропатии при БВ немногочисленны [8—10].
При коагулогическом исследовании оценивают антиген vWF (vWF:Ag), активность FVIII (FVIII:C) (она снижается, если снижена активность vWF) и ристоцетин-кофакторную активность (vWF:RCo). Для уточнения типа заболевания исследуют агрегацию тромбоцитов, индуцированную ристоцетином, и профиль мультимеров vWF с помощью электрофореза в агарозном геле.
Наиболее распространена БВ 1-го типа, она составляет от 55 до 70 % всех диагностированных случаев. Чаще всего при этом варианте заболевания наблюдается снижение количества vWF без нарушения его функций. Самая редкая (1—3 %) и тяжелая форма БВ 3-го типа характеризуется практически полным отсутствием vWF. Поскольку одной из функций vWF является связывание с FVIII и его защита от преждевременного протеолиза, у больных БВ 3-го типа наблюдается не только отсутствие vWF, но и очень низкое значение FVIII:C.
При БВ 2-го типа наблюдаются качественные дефекты vWF, которые у большинства больных выражаются в непропорциональном снижении vWF:RCo (или vWF:CB) по отношению к vWF:Ag. Для диагностики подтипов БВ типа 2 используют анализ структуры мультимеров vWF.
У больных БВ типа 2A наблюдаются изолированный дефицит высокомолекулярных мультимеров vWF и сниженная vWF- зависимая адгезия тромбоцитов.
Тип 2B БВ включает различные варианты качественного дефекта vWF, выражающиеся в его повышенном сродстве к рецептору гликопротеину Ib-тромбоцитов.
Тип 2М БВ включает различные варианты качественного дефекта vWF, выражающиеся в снижении vWF-зависимой адгезии тромбоцитов без изолированного дефицита высокомолекулярных мультимеров vWF. Функциональный дефект обусловлен мутациями, в результате которых происходит нарушение связывания vWF с тромбоцитами или субэндотелием.
Тип 2N БВ (Нормандия) был впервые описан в 1990 г. [11]. У больных с БВ типа 2N имеется дефект vWF в месте связывания с В результате этого не может образоваться комплекс vWF—FVIII. Данный вариант БВ определяют с помощью теста связывания vWF с FVIII [12]. У многих больных с данным вариантом БВ ранее диагностировали гемофилию А легкой или умеренной степени тяжести (FVIII:C составляет 5—22 %) [13].
Анализ мутаций в гене vWF позволяет не только верифицировать диагноз БВ, но и способствует уточнению типа заболевания, поскольку генные дефекты, соответствующие различным типам и подтипам БВ, различаются по своему характеру и локализации [14, 15]. Так, для БВ 1-го и 3-го типов характерны «тяжелые» мутации, приводящие к полному отсутствию функционального белка (нонсенс-мутации, frameshift-мутации, мутации в канонических динуклеотидах сайтов сплайсинга) и рассеянные по всему пространству гена, тогда как при 2-м типе (кроме рецессивных вариантов 2A и 2N) встречаются только приводящие к аминокислотным заменам миссенс-мутации, причем преимущественно в самом большом экзоне 28 гена vWF (1399 пн), кодирующем домены А1 и А2, отвечающие за мульти- меризацию белка. Варианты БВ 3-го типа и подтипа 2N наследуются рецессивно, и, следовательно, для их проявления необходимо наличие мутаций в обоих аллелях гена vWF. Для подтипов 2В и 2М характерно доминантное наследование, то есть достаточно нарушения только в одном из аллелей. Тип 1 и подтип 2A в генетическом плане более сложны и могут иметь оба варианта наследования [14].
Цель настоящей работы — сопоставление клинических, коагулогических и молекулярно-генетических данных, полученных при обследовании российских больных различными типами БВ.
Больные и методы
Больные
В исследование было включено 15 больных с установленным диагнозом БВ и один больной с генетически не подтвердившимся первичным диагнозом гемофилия А. Критериями диагноза БВ были: клинические проявления геморрагического синдрома, семейный анамнез и снижение vWF:RCo. Диагностический алгоритм выполнялся в соответствии с Национальными клиническими рекомендациями Российской Федерации [16]. Характеристика больных: 4 больных 1-м типом БВ (25 %), 5 больных 2-м типом БВ (31 %), 6 больных 3-м типом БВ (37 %), один больной, у которого первоначально был установлен диагнозом легкой формы гемофилии А (7 %); средний возраст (лет) 47 (21—71), средняя масса тела (кг) 72 (48—90); пол м/ж 5/11. Больные старше 40 лет составили 69 % (11/16). Проводилась оценка клиникоанамнестических данных, результатов исследования свертывающей системы крови и генеалогических данных. Тяжелое проявление болезни наблюдалось у 50 % больных, средняя частота геморрагических эпизодов по микроциркуляторному типу была 3—4 раза в месяц. У одной больной 3-м типом БВ в анамнезе было тотальное эндопротезирование коленного сустава. Коморбид- ные состояния у 11 больных старшей возрастной группы: заболевания желудочно-кишечного тракта были у 27 % (3), онкологические заболевания — у 9 % (1), аутоиммунные заболевания — у 9 % (1), кардиальная патология — у 27 % (3).
С гемостатической целью применялись концентраты FVIII, сбалансированные по vWF в соотношении FVIII/vWF (500/1200); FVIII/vWF (450/400). Шесть больных получали лечение в профилактическом режиме 40 МЕ/кг массы тела два раза в неделю. Десяти больным лечение проводилось концентратами FVIII+vWF по необходимости в стандартных терапевтических дозах.
Коагулогические тесты
Определение FVIII:C, vWF:RCo выполнялось одностадийным клоттинговым методом; vWF-Ag — методом иммуноферментного анализа; агрегацию тромбоцитов, индуцированную ристоцетином, определяли оптическим методом. Оценивали соотношение vWF:RCo/vWF:Ag, значение данного показателя >0,7 соответствует 1-му типу БВ, до 0,7 — 2-му типу БВ.
Анализ мутаций в гене vWF
ДНК выделяли из периферической крови фенол- хлороформным методом. ПЦР проводили с использованием набора PCR Master Mix (2x) ((Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Нуклеотидные последовательности праймеров, температура отжига при ПЦР и использование бетаина (1/5 объема реакционной смеси) для амплификации GC-богатых фрагментов приведены в таблице 1. Очистку ПЦР продуктов для секвенирования проводили при помощи системы Wizard® PCR Preps DNA Purification System (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Олигонуклеотидные праймеры синтезировали в ЗАО «Синтол» (Москва). Секвенирование проводили в ЦКП «Геном» ИМБ РАН с помощью набора реактивов BigDye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, США) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100Avant (Applied Biosystems, США).
Найденные мутации анализировали с использованием баз данных EAHAD (https://grenada.lumc.nl/LOVD2/VWF/home.php?select_db=VWF) и HGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php).
Для определения патогенности новой мутации (Pro2527His) использовались следующие ресурсы: Mutation Taster, Provean, SIFT и PolyPhen.
Результаты
В данной работе проведен анализ мутаций в гене vWF у 15 больных БВ. В исследование был также включен больной, у которого первоначально была диагностирована легкая форма гемофилии А (FVIII 3,8 %), но при полном анализе гена F8 не найдено никаких отклонений от нормы. Исследовали структуру 23 эк- зонов из 52 (табл. 1), в которых сосредоточено около 90 % известных к настоящему времени мутаций в гене vWF. Патологические варианты гена vWF были выявлены у всех 16 больных (табл. 2, 3).
Таблица 1. Системы праймеров, использованные для амплификации и секвенирования гена vWF
Table 1. Primer sets used for amplification and sequencing of vWF gene
Номер экзона Exon number | Система праймеров Primer set | Позиция в гене vWF GeneBank NCBI NG_009072 Position in vWF gene GeneBank NCBI NG_009072 | Тотж , °С Tann , °С | Бетаин Betain |
---|---|---|---|---|
3 | CTGATGGTCCCAGTTGTGCC TTCCGCTCAGACACTGTCCT | 3275-3294 3660-3581 | 65 | - |
4-5 | GCTGAGAAAAGGTTACGTAGA GAAGGCATGTTAGTGAAGGTT | 13608-13628 14381-14361 | 62 | - |
7 | AAGTCTCAGTGCCACACTCA CACAGCCCCGAAGCACCCTA | 49052-49071 49422-49403 | 65 | - |
11-12 | TGCAGTTTTGGGGAAGGGCA GTTGAGAAGGAGGGTGCTAA | 59291-59310 60494-60475 | 65 | - |
18 | GATGCCCTCCCAGTCCCACA CTCACTCATCCCTGCCTACA | 8004-80064 80444-80425 | 65 | + |
19 | GCTGGAGGAGGGCTTTAGAT TGGAGGCAAGTGCGGAAGGT | 88117-88136 88375-88356 | 62 | - |
25 | CCAGACTAAGAGCCAGAGTTCC CATCCAGTCCCTACTAACACT | 100817-100838 101170-101150 | 65 | + |
26-27 | CCAACATTATCTCCAGATGGC TTACCCAAAACCTAGTCTCTAA | 101674-101694 102853-102832 | 62 | + |
28 | CAGAAGTGTCCACAGGTTCT GCAGATGCATGTAGCACCAA | 104871-104890 106380-106361 | 62 | + |
29-31 | CACGCCCTGCAGATCCTATT AAAGTAACCCCAGCCCACTT | 107705-107724 108666-108647 | 62 | + |
33–34 | CTCATGTCCCTATGTCTCCA CCTGCTCTACTTTTCTGCACA | 112383-112402 114134-113114 | 62 | + |
36-37 | TGCAGGAACTCTCGGTAACT GGCACAGAGAGGCTGAGCAA | 129981-130000 130878-130859 | 65 | + |
42 | GCACCCTATAGCATAGCTGA CATGAGGAGCACATGTTGCT | 142604-142623 143025-143006 | 65 | - |
43 | GGTGCTAACTCACCGCTTGT ACCCTTCCTAAGATGCCCTC | 148346-148365 148634-148615 | 62 | + |
45 | CGTCTAGAAACCACCTTCCT TCGGTCCTATCCATTTCCCT | 155181-155200 155577-155558 | 65 | + |
52 | CCAGAGCCCTGCCTAAGCCA CCTGCCCACCGTTGCCATCT | 175400-175419 180843-180824 (NG_009072.1) | 65 | + |
Таблица 2. Коагулогические и генетические характеристики больных БВ
Table 2. Coagulogical and genetic characteristics of vWD patients
Номер больного Patient's No. | Тип БВ по фенотипу vWD type by phenotype | Коагулогические тесты Coagulogical tests | Экзон Exon | Мутация Mutation | Тип БВ по генотипу VWD type by genotype |
---|---|---|---|---|---|
1 | 1 | FVIII 7,9 % vWF:RCo 21 % AgVWF 7,9 % RIPA 37 % | 45 | c.7580 C>A Pro2527His | ? |
2 | 2 | FVIII 22,6 % vWF:RCo 6,23 % AgVWF 14 % RIPA 88 % | 26 | c.3437 A>G Tyr1146Cys | 2A |
3 | 1 | FVIII 28 % vWF:RCo 12,6 % AgVWF 18 % RIPA 69 % | 28 | c.4120 C>T Arg1374Cys | 2A/2M |
4 | 3 | FVIII 10,1 % vWF:RCo 3 % AgVWF 3 % RIPA 5 % | 18 28 | c.2435delC c.4975 C>T Arg1659X | 3 |
5 | 1 | FVIII 3,3 % vWF:RCo 21,1 % AgVWF 6,5 % RIPA 4 % | 18 37 | c.2435delC c.6532 G>T Ala2178Ser | 1 rec |
6 | 3 | FVIII 3,6 % vWF:RCo 1,21 % AgVWF 3,8 % RIPA 6 % | 18 18 | c.2435delC c.2435delC | 3 |
7 | 2 | FVIII 55 % vWF:RC 6 % AgVWF 34 % RIPA 29 % | 28 | c.4825 G>A Gly1609Arg | 2A |
8 | 3 | FVIII 6,7 % vWF:RCo 2,2 % AgVWF 0 % RIPA 10 % | 18 18 | c.2435delC c.2435delC | 3 |
9 | 2 | FVIII 13 % vWF:RCo 109 % Ag VWF 27,5 % RIPA 92 % | 18 18 | c.2435delC c.2372 C>T Thr791 Met | 2N |
10 | 3 | FVIII 9,25 % vWF:RCo 3,5 % AgVWF 0,8 % RIPA 6 % | 18 | c.2435delC | 3 |
11 | 2 | FVIII 105 % vWF:RCo 16,4 % Ag vWF 48,4 % RIPA 80 % | 28 | c.4790 G>A Arg1597Gln | 2A |
12 | 2 | FVIII 53,6 % vWF:RCo 4,5 % AgVWF 571 % RIPA 89 % | 28 | c.4517 C>T Ser1506Leu | 2A |
13 | 3 | FVIII 3,5 % vWF:RCo 2,1 % Ag VWF 2,7 % RIPA 11 % | 18 25 | c.2435delC c.3301 T>C Cys1101Arg | 3 |
14 | 1 | FVIII 20,9 % vWF:RCo 2,21 % AgVWF 1,4 % RIPA 17 % | 7 | c.817 C>T Arg273Trp | ? |
15 | 3 | FVIII 2,5 % vWF:RCo 1,4 % AgVWF 2,1 RIPA 11 % | 18 18 | c.2435delC c.2435delC | 3 |
16 | Гемофилия А | FVIII 3,8 % | 18 18 | c.2435delC c.2372 C>T Thr791 Met | 2N |
Примечание. Норма FVIII (50-120 %) vWF:RCo (50-150 %) vWF-Ag (50-150 %) RIPA (80-100 %).
Note. Norm of FVIII (50-120 %) vWF:RCo (50-150 %) vWF-Ag (50-150 %) RIPA (80-100 %).
Таблица 3. Мутации в гене vWF, выявленные у больных БВ
Table 3. Mutations in vWF gene identified in vWD patients
Примечание. (3)* — трое больных являлись гомозиготами по данной мутации.
Note. (3)* — three patients were homozygous by this mutation.
Микроделеция c.2435delC, локализованная в экзоне 18, оказалась в исследованной выборке больных самой распространенной, она трижды встретилась в гомозиготном состоянии (№ 6, 8 и 15) и шесть раз — в гетерозиготном (№ 4, 5, 8, 10, 13 и 16). У больных № 9 и 16 эта мутация сочеталась с миссенс-мутацией c.2372 C>T в том же экзоне.
В экзоне 28 выявили пять различных мутаций. У больного № 4 найдена не только мутация c.2435delC в 18-м экзоне, но и c.4975 C>T в 28-м экзоне. В гетерозиготном состоянии в этом экзоне найдены мутации: c.4120 C>T у больного № 3, c.4825 G>A у больного № 7, c.4790 G>A у больного № 11 и c.4517 C>T у больного № 12.
В пяти экзонах было обнаружено по одной мутации. У больного № 2 в 26-м экзоне c.3437 A>G, у больного № 14 в 7-м экзоне c.817 C>T. У больных № 5 и 13 мутация c.2435delC была дополнена гетерозиготными мутациями в других экзонах: в 37-м с.6532 и 25-м c.3301 T>C соответственно.
Отдельный интерес представляет мутация с.7580 C>A у больного № 1 в экзоне 45. Она не встречалась ранее в литературе, поэтому для определения патогенности найденной вариации использовали различные системы анализа белковых структур, которые дали следующие результаты: Mutation Taster (disease causing: p = 0,799), Provean (neutral: score —2,38), SIFT (damaging: score 0,018) и PolyPhen (HumDiv probably damaging: score 1,000, HumVar probably damaging: score 0,972). Таким образом, три из четырех использованных программ указали на патогенность найденной замены, а в системе Provean полученный коэффициент был близок к границе между нейтральностью и патогенностью.
Обсуждение
В соответствии с клинической картиной заболевания и коагулогическими характеристиками, у 4 больных был определен тип 1 БВ, у 5 — тип 2 и у 6 — тип 3. У больных БВ 3-го типа наблюдалось тяжелое течение болезни с высокой частотой геморрагических эпизодов и определялись низкие значения vWF-Ag (0—3,8 %) и vWF:RCo (1,21—3,5 %). У всех 6 больных была найдена одна и та же микроделеция в экзоне 18 c.2435delC, приводящая к синтезу сильно укороченного нефункционального белка, причем у 3 больных в гомозиготном состоянии (№ 6, 8 и 15).
В группе больных, у которых мутации выявлены в гомозиготном состоянии, наиболее выраженное поражение опорно-двигательного аппарата наблюдалось у больной № 6 (рис. 1). Дебют геморрагического синдрома у нее возник в раннем детском возрасте, а с 4 лет наблюдались рецидивирующие гемартрозы коленных суставов с последующим формированием тяжелой артропатии. В возрасте 39 лет было произведено тотальное эндопротезирование левого коленного сустава. Кроме того, у больной в анамнезе были меноррагии и апоплексия яичников.
Рисунок 1. А — генеалогические данные больной БВ (№ 6) с 3-м типом БВ Б — рентгенологические снимки левого коленного сустава больной с признаками гемартроза
Figure 1. А — pedigree of the patient №6 with WD 3 type. Б — Roentgenograms of the left knee-joint of the patient with hemarthrosis signs
Мутация с.2435delC широко распространена в странах Балтии, но найдена также и в других европейских популяциях [17, 18]. У больной № 4 она встретилась в сочетании с нонсенс-мутацией Arg1659X, также приводящей к синтезу укороченного нефункционального белка и являющейся мажорной в Финляндии [19], а у больной № 13 — в сочетании с миссенс-мутацией Cys1101Arg в области гена vWF, кодирующей домен D3. Замены цистеина в домене D3 обычно приводят к нарушению мультимеризации vWF.
Кроме того, данная микроделеция в сочетании с другими мутациями была выявлена у больных БВ 1-го (№ 5) и 2-го (№ 9) типов, а также у больного, у которого первоначально были диагностирована гемофилия А (№ 16). У больного № 10 мутация c.2435delC оказалась в гетерозиготном состоянии и других мутаций не найдено. Возможно, у него есть дополнительная мутация в одном из экзонов, не охваченных в данном исследовании. У больной № 5 микроделеция c.2435delC была идентифицирована в сочетании с миссенс-мутацией Ala2178Ser. Низкие уровни vWF-Ag (6,5 %) и активности FVIII (3,3 %) в сочетании с высокой остаточной vWF:RCo (21,1 %) свидетельствуют в данном случае в пользу редкой рецессивной формы БВ 1-го типа. У этой больной наблюдался геморрагический синдром (меноррагии, длительные кровотечения после удаления зубов), и по поводу поликистоза яичников, полипов эндометрия, внематочной беременности ей выполнялись оперативные вмешательства на фоне гемостатической терапии концентратом FVIII, сбалансированным по vWF. К настоящему времени отмечается отсутствие геморрагического синдрома, специфическая гемостатическая терапия не требуется.
У больной № 9 и больного № 16 вторым дефектом была миссенс-мутация Thr791Met, относящаяся к группе рецессивных вариантов vWF, при которых нарушено связывание с FVIII [20]. Таким образом, оба этих случая можно классифицировать как БВ типа 2N. У многих больных данным вариантом БВ ранее диагностировали гемофилию А легкой или умеренной степени тяжести [13, 21]. У больной № 9 наблюдалась клиническая картина рецидивирующих десневых кровотечений, длительных луночковых кровотечений после удаления зубов, меноррагий, послеоперационных (аппендэктомия) гематом. Диагноз БВ был верифицирован в возрасте 23 лет. Амбулаторно наблюдается в НМИЦ гематологии с 1994 г. Отмечено волнообразное течение заболевания с отсутствием клинических проявлений до 6 мес. В настоящее время, учитывая сопутствующий множественный генерализованный пародонтит, больной планируется хирургическая санация полости рта на фоне гемостатической терапии концентратом FVIII/vWF (450/400) (нагрузочная доза 70 МЕ/кг, поддерживающая доза 25 МЕ/кг).
Дифференциальная диагностика БВ по типам и подтипам довольно часто представляет собой непростую задачу, особенно это относится к 1-му типу заболевания, которое может иметь как доминантную, так и рецессивную форму наследования. У больной № 14 с предполагаемым 1-м типом БВ на настоящий момент времени выявлена только миссенс-мутация Arg273Trp в гетерозиготном состоянии. Известно, что гомозиготность по этому генетическому дефекту приводит к нарушению мультимеризации и секреции vWF и ассоциируется с 3-м типом заболевания [22, 23]. Наблюдающиеся крайне низкие показатели vWF:RCo (2,21 %) и vWF-Ag (1,4 %) предполагают возможное наличие у больной нарушения и во втором аллеле, и в данном случае необходимо полное исследование гена vWF.
У больной № 3 выявлена в гетерозиготной форме миссенс-мутация Arg1374Cys, которую ранее относили к 1-му типу БВ, но затем было показано, что она соответствует 2А/2М типам заболевания [24, 25]. Данное нарушение локализовано в домене А1 и вызывает аберрантную мультимеризацию белка.
У больного № 1 с предполагаемым 1-м типом БВ была обнаружена в гетерозиготном состоянии миссенс-мутация Pro2527His, единственная из найденных нами в данном исследовании мутаций, не описанная в литературе. Локализованные в соседних участках домена С1 замены Gln2520Pro и Gly2518Ser нарушают мультимеризацию белка и соответствуют 1-му типу БВ [25]. По нашим данным, она оказалась патогенной. Основные геморрагические проявления у этого больного представляли собой рецидивирующие носовые кровотечения, кроме того, возникали кровоизлияния в склеру глаз на фоне подъема АД до 130/90 мм рт. ст. В возрасте 62 лет после операции уретеролитоэкстракции возникла гематурия. При обследовании был верифицирован диагноз БВ 1-го типа и диагностирована моноклональная гаммапатия. Секреция белка Бенс-Джонса не выявлена. Больной получает гемостатическую терапию концентратом FVIII/vWF (450/400) в профилактическом режиме 2700 МЕ х 2 раза в неделю.
У 4 больных БВ 2-го типа были выявлены в гетерозиготном состоянии известные доминантные миссенс- мутации, нарушающие мультимеризацию vWF. В трех случаях (№ 7, 11 и 12) они были найдены в экзоне 28, где чаще всего встречаются нарушения, приводящие к БВ 2-го типа [14]. Все три мутации (Ser1506Leu, Arg1597Gln, Gly1609Arg) были локализованы в области гена, кодирующей домен А2. У больной № 2 мутация Tyr1146Cys была найдена в экзоне 26, кодирующем домен D3.
Таким образом, в данном исследовании были определены мутации в гене vWF у 16 больных БВ. Всего было выявлено 12 различных мутаций, одна из которых (Pro2527His) оказалась новой. Наиболее распространенной в отечественной популяции является микроделеция c.2435delC, встретившаяся у 9 из 16 больных преимущественно с 3-м типом заболевания, причем у 3 больных — в гомозиготном состоянии. В целом, данные молекулярно-генетического анализа соответствовали результатам дифференциальной диагностики типа БВ, основанной на клинической картине заболевания и коагулогических характеристиках. Только в одном случае у больной предполагаемым 1-м типом БВ была выявлена мутация, характерная для типа 2 (A/M), и еще в 2 случаях уточнен подтип 2-го типа заболевания (2N). Из 24 найденных мутаций 14 пришлись на эк- зон 18 (преимущественно это была делеция c.2435delC) и еще 5 — на экзон 28. Из этих результатов следует, что начинать поиск мутаций в гене vWF целесообразно с экзонов 18 и 28. Полученные данные могут послужить основой для создания экономичного алгоритма поиска мутаций в гене vWF у отечественных больных БВ.
Список литературы
1. Rodeghiero F., Castaman G., Dini E. Epidemiological investigation of the prevalence of von Willebrand’s disease. Blood. 1987; 69: 454–9.
2. Werner E.J., Broxson E.H., Tucker E.L. et al. Prevalence of von Willebrand disease in children: a multiethnic study. J Pediatr. 1993; 123: 893–8.
3. Zimmerman T., Ruggeri Z. Von Willebrand disease. Human Pathology. 1987; 18(2): 140–52. DOI: 10.1016/S0046-8177(87)80332-5
4. Mancuso D.J., Turley E.A., Westfi eld L.A. et al. Structure of the gene for human von Willebrand factor. J Biol Chem. 1989; 264(33): 19514–27.
5. Mancuso D.J., Tuley E.A., Westfi eld L.A. et al. Human von Willebrand factor gene and pseudogene: structural analysis and differentiation by polymerase chain reaction. Biochemistry. 1991; 30(1): 253–69. DOI: 10.1021/bi00215a036
6. Sadler J. A Revised Classifi cation of von Willebrand Disease. Thromb Haemost. 1994; 72(04): 520–5. DOI: 10.1055/s-0038-1642471
7. Federici A.B., Castaman G., Thompson A., Berntorp E. Von Willebrand’s disease: clinical management. Haemophilia. 2006; 12(3): 152–8.
8. Federici A.B., Mannucci P.M. Diagnosis and management of von Willebrand diasease. Haemophilia. 1999; 5(2): 28–37.
9. Blomback M., Eikenboom J., Lane D. et al. Von Willebrand disease biology. Haemophilia. 2012; 18(4): 141–7.
10. Баркаган З.С. Болезнь Виллебранда. В кн.: Руководство по гематологии. Ред. Воробьев А.И. М.: Ньюдиамед. 2005; 3: 71–3.
11. Drewke E., Krey S., Schneppenheim R., Budde U. A variant of von Willebrand disease (Type 2N) resembling phenotypically mild or moderately severe haemophilia. Infusionsther Transfusionsmed. 1995; 22 (1): 48–50.
12. Папаян Л.П., Головина О.Г. Вариантные формы болезни Виллебранда. Терапевтический архив. 1990; 7: 86–92.
13. Mazurier C. Von Willebrand disease masquerading as haemophilia A. Thromb. Haemost. 1992; 67: 391–6.
14. Goodeve A.C. The genetic bases of von Willebrand disease. Blood Reviews. 2010; 24: 123–34. DOI: 10.1016/j.blre.2010.03.003
15. Flood V.H. New insights into genotype and phenotype of VWD. Hematology. 2014; 2014(1): 531–5. DOI: 10.1182/asheducation-2014.1.531
16. Лихачева Е.А., Полянская Т.Ю., Зоренко В.Ю. и др. Клинические рекомендации по диагностике и лечению болезни Виллебранда. М.: Национальное гематологическое общество, 2014.
17. Zhang Z.P., Falk G., Blombäck M. et al. A single cytosine deletion in exon 18 of the von Willebrand factor gene is the most common mutation in Swedish vWD type III patients. Hum Mol Genet. 1992; 1(9): 767–8.
18. Schneppenheim R., Krey S., Bergmann F. et al. Genetic heterogeneity of severe von Willebrand disease type III in the German population. Hum Genet. 1994; 94 (6): 640–52.
19. Jokela V., Lassila R., Szanto T. et al. Phenotypic and genotypic characterization of 10 Finnish patients with von Willebrand disease type 3: discovery of two main mutations. Haemophilia. 2013; 19(6): 344–8. DOI: 10.1111/hae.12225
20. Gaucher C., Jorieux S., Mercier B. et al. The “Normandy” variant of von Willebrand disease: characterization of a point mutation in the von Willebrand factor gene. Blood. 1991; 77(9): 1937–41.
21. Casonato A., Galletta E., Sarolo L., Daidone V. Type 2N von Willebrand disease: Characterization and diagnostic diffi culties. Haemophilia. 2018; 24(1): 134–40. DOI: 10.1111/hae.13366
22. Allen S., Abuzenadah A.M., Hinks J. et al. A novel von Willebrand diseasecausing mutation (Arg273Trp) in the von Willebrand factor propeptide that results in defective multimerization and secretion. Blood. 2000; 96(2): 560–8.
23. Bowman M., Tuttle A., Notley C. et al. The genetics of Canadian type 3 von Willebrand disease: further evidence for co-dominant inheritance of mutant alleles. J Thromb Haemost. 2013; 11(3): 512–20. DOI: 10.1111/jth.12130
24. Hilbert L., Gaucher C., Mazurier C. Identifi cation of two mutations (Arg611Cys and Arg611His) in the A1 loop of von Willebrand factor (vWF) responsible for type 2 von Willebrand disease with decreased platelet-dependent function of vWF. Blood. 1995; 86(3): 1010–8.
25. Goodeve A., Eikenboom J., Castaman G. et al. Phenotype and genotype of a cohort of families historically diagnosed with type 1 von Willebrand disease in the European study, Molecular and Clinical Markers for the Diagnosis and Management of Type 1 von Willebrand Disease (MCMDM-1VWD). Blood. 2007; 109(1): 112–21.
26. Gadisseur A., Berneman Z., Schroyens W. et al. Laboratory diagnosis of von Willebrand disease type 1/2E (2A subtype IIE), type 1 Vicenza and mild type 1 caused by mutations in the D3, D4, B1–B3 and C1–C2 domains of the von Willebrand factor gene. Role of von Willebrand factor multimers and the von Willebrand factor propeptide/antigen ratio. Acta Haematol. 2009;121(2- 3):128–38. Doi: 10.1159/000214853.
27. James P.D., Notley C., Hegadorn C. et al. The mutational spectrum of type 1 von Willebrand disease: Results from a Canadian cohort study. Blood. 2007; 109(1):145–54.
28. Pérez-Casal M., Daly M., Peake I. et al. A de novo mutation in exon 28 of the von Willebrand factor gene in a patient with type IIA von Willebrand’s disease coincides with an MboI polymorphism in the von Willebrand factor pseudogene. Hum Mol Genet. 1993;2(12):2159–61.
29. Ginsburg D., Konkle B.A., Gill J.C. et al. Molecular basis of human von Willebrand disease: analysis of platelet von Willebrand factor mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989;86(10):3723–7.
30. Donnér M., Kristoffersson A.C., Berntorp E. et al. Two new candidate mutations in type IIA von Willebrand’s disease (Arg834-->Gly, Gly846-->Arg) and one polymorphism (Tyr821-->Cys) in the A2 region of the von Willebrand factor. Eur J Haematol. 1993;51(1):38–44.
31. Cumming A., Grundy P., Keeney S. et al. An investigation of the von Willebrand factor genotype in UK patients diagnosed to have type 1 von Willebrand disease. Thromb Haemost. 2006;96(5):630–41.
Об авторах
Д. М. ЧернецкаяРоссия
научный сотрудник лаборатории генной инженерии,
125167, Москва
Е. А. Лихачева
Россия
Научно-консультативный отдел коагулопатий, кандидат медицинских наук, врач-гематолог,
125167, Москва
О. С. Пшеничникова
Россия
старший научный сотрудник лаборатории генной инженерии,
125167, Москва
В. Л. Сурин
Россия
старший научный сотрудник лаборатории генной инженерии,
125167, Москва
Н. И. Зозуля
Россия
врач-гематолог, заведующая научно-консультативным отделом коагулопатий,
125167, Москва
Рецензия
Для цитирования:
Чернецкая Д.М., Лихачева Е.А., Пшеничникова О.С., Сурин В.Л., Зозуля Н.И. БОЛЕЗНЬ ВИЛЛЕБРАНДА: СОПОСТАВЛЕНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ, КОАГУЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДАННЫХ. Гематология и трансфузиология. 2019;64(3):246-255. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-3-246-255
For citation:
Chernetskaya D.M., Likhacheva E.A., Pshenichnikova O.S., Surin V.L., Zozulya N.I. VON WILLEBRAND DISEASE: CLINICAL, COAGULOGICAL, MOLECULAR AND GENETIC DATA COMPARISON. Russian journal of hematology and transfusiology. 2019;64(3):246-255. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-3-246-255