ПРИМЕНЕНИЕ РОТАЦИОННОЙ ТРОМБОЭЛАСТОМЕТРИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ДЕФИЦИТА ФАКТОРОВ СВЕРТЫВАНИЯ И КОНТРОЛЯ ГЕМОСТАТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ НАСЛЕДСТВЕННЫМИ КОАГУЛОПАТИЯМИ

Введение

Ротационная тромбоэластометрия (РОТЭМ) позво­ляет оценить нарушения гемостаза у больных в крити­ческих состояниях, выбрать тот или иной метод лече­ния, мониторировать его эффективность [1]. РОТЭМ является point-of-care тестированием, т.е. исследованием, которое проводится по месту лечения, медицинским персоналом, не имеющим лабораторного образования [2]. Для его выполнения не требуется центрифугиро­вать кровь, а результаты могут быть получены в течение короткого промежутка времени. В отличие от тради­ционных коагулогических тестов, с помощью РОТЭМ оценивают не активность отдельных факторов сверты­вающей или противосвертывающей систем, а систему гемостаза в целом как результат взаимодействия этих факторов [3]. Метод позволяет графически предста­вить процесс образования и лизиса сгустка и с помо­щью соответствующих активаторов дифференцирован­но оценивать внешний и внутренний пути свертывания крови. В тесте INTEM после предварительной рекаль­цификации с помощью реагента star-tem добавляется реактив in-TEM, содержащий фосфолипиды, выделен­ные из мозга кроликов, и эллаговую кислоту. То есть, по сути, это реагент активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), инициирующий внутренний путь свертывания. Таким образом, в тесте INTEM свертывание по внутреннему пути запускает­ся эллаговой кислотой на фосфолипидах, введенных в образец крови. В тесте EXTEM после реагента startem добавляется реактив ex-TEM, содержащий фосфо­липиды, тканевой фактор, запускающий свертывание по внешнему пути, и гепариназу, которая нивелирует возможное действие присутствующего гепарина. Таким образом, тесты EXTEM и INTEM можно использовать как скрининг для выявления нарушений свертывания крови по внешнему и/или внутреннему путям сверты­вания. При выявлении гипокоагуляции в тесте INTEM можно с помощью теста HEPTEM исключить или под­твердить действие гепарина. При наличии в крови ге­парина гипокоагуляция будет устранена добавлением гепариназы, при дефиците факторов свертывания кро­ви она сохранится. Дефицит фактора, который при­вел к гипокоагуляции, выясняется обычно с помощью коагулогических тестов, при которых количественно оценивается активность факторов в плазме крови. Од­нако далеко не во всех стационарах есть лаборатории, которые могут определять дефицит отдельных факто­ров свертывания, прежде всего при врожденных коагулопатиях. Подобные больные, поступая в стационар для планового или экстренного хирургического вме­шательства или в связи с геморрагическим синдромом, часто либо не получают адекватной помощи и перена­правляются в другие специализированные стационары, либо их лечат трансфузиями плазмы, которые не всегда эффективны.

Простота, удобство и информативность вискоэла­стичных методов оценки гемостаза способствовали их широкому распространению в клинической практике. Они востребованы для выявления нарушений гемо­стаза и мониторинга проводимой гемостатической те­рапии в акушерстве и гинекологии [4—6], интенсивной терапии и анестезиологии [7—10], сердечно-сосудистой хирургии [11—14], травматологии [15—18], при транс­плантации печени [1, 19, 20]. Учитывая их большое значение, приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 15 ноября 2012 г. № 919 н ре­гламентировано обязательное наличие тромбоэластографа или тромбоэластометра в отделениях анестези­ологии-реаниматологии [21].

В этой связи представляется актуальным адаптиро­вать метод РОТЭМ, доступный в большинстве стаци­онаров, для определения дефицита отдельных факто­ров свертывания крови и мониторинга проводимой целенаправленной гемостатической терапии.

Цель настоящей работы — изучить возможность использования ротационной тромбоэластометрии для диагностики врожденного дефицита отдельных факторов свертывания крови и мониторинга эффек­тивности и безопасности проводимой при этих коагулопатиях гемостатической терапии.

Материалы и методы

Работа состояла из двух этапов. Задачей первого эта­па была разработка алгоритма определения дефицита отдельных факторов свертывания крови с помощью РОТЭМ. Задача второго этапа — показать на кли­нических примерах, как с помощью РОТЭМ можно диагностировать дефицит отдельных факторов свер­тывания крови и мониторировать эффективность и безопасность гемостатической терапии при этих коагулопатиях.

В исследование было включено 9 больных (4 мужчин и 5 женщин) в возрасте от 15 до 54 лет с врожденным дефицитом различных факторов свертывания кро­ви (FV, FVII, FVIII, FIX, FXI и FXII). У 8 больных плазменная активность дефицитного фактора не пре­вышала 1 %, у 1 больной плазменная активность FV составила 1,7 %.

Для исследований гемостаза кровь у больных полу­чали путем венепункции одной из периферических вен и собирали в пробирки S-Monovette с 3,2 % раствором цитрата натрия в соотношении 1 часть раствора ци­трата натрия, 9 частей крови. Для выполнения тестов на РОТЭМ использовали цельную цитратную кровь. Для выполнения коагуляционных тестов получали бедную тромбоцитами плазму. Бедную тромбоцита­ми плазму приготовляли путем центрифугирования цитратной крови со скоростью 1200 g (3000 об./мин) в течение 15 мин при температуре 15—25 °C. АЧТВ определяли в условиях стандартной активации ка­олином и фосфолипидами. Исследование выполня­ли на автоматическом коагулометре Sysmex CA-600 фирмы Sysmex Corporation (Япония) с использовани­ем Pathromtin* SL фирмы Siemens Healthcare (Герма­ния) [22].

Протромбиновое время (ПВ) определяли с тромбопластином, стандартизованным по международному индексу чувствительности (МИЧ 1,1) с расчетным показателем, выраженным в %, рассчитывали между­народное нормализованное отношение (МНО). Иссле­дование выполняли на автоматическом коагулометре Sysmex CA-600 фирмы Sysmex Corporation (Япония) с использованием реагента ThromoborelR S фирмы Siemens Healthcare (Германия).

Концентрацию фибриногена в плазме определяли по Клауссу. Исследование выполняли на автомати­ческом коагулометре Sysmex CA-600 фирмы Sysmex Corporation (Япония) с использованием реагента DadeR Thrombin Reagent фирмы Siemens Healthcare (Германия).

Определение активности факторов свертывания крови выполняли на автоматическом коагулометре Sysmex CA-600 фирмы Sysmex Corporation (Япония) одностадийным клоттинговым методом с использо­ванием субстратных (дефицитных) образцов плазмы, лишенных одного из факторов свертывания крови. Исследование выполняли c использованием реагентов Coagulation Factors Deficient Plasma фирмы Siemens Healthcare (Германия).

Тромбоэластометрию выполняли на 4-каналь­ном анализаторе ROTEM delta фирмы Pentapharm GmbH (Германия). В исследовании были использо­ваны пять основных тестов: EXTEM (внешний путь свертывания), INTEM (внутренний путь свертыва­ния), FIBTEM (контроль полимеризации фибрина), HEPTEM (мониторинг гепарина). Тесты выполняли согласно рекомендациям производителя. При прове­дении анализа использовали автоматическое пипетирование цельной цитратной крови в комбинации с различными специфическими реагентами. При по­становке тестов для исследования использовали образ­цы стандартной плазмы (Standard human plasma, FII 100 %, FV 90 %, FVII 90 %, FVIII 85-93 %, FIX 94 %, FX 101 %, FXI 90 %, FXII 97 %, FXIII 121 %, Siemens Healthcare Diagnostic Products GmbH, Германия) и де­фицитной по одному из факторов свертывания плазмы (Coagulation Factor Deficient Plasma, Siemens Healthcare Diagnostic Products GmbH, Германия).

Результаты

Поскольку РОТЭМ позволяет выявить наруше­ния как внутреннего, так и внешнего пути сверты­вания с помощью соответствующих тестов INTEM и EXTEM, они были использованы как скринин­говые тесты для выявления коагулопатии (рис. 1).

В зависимости от выявленной гипокоагуляции в INTEM или EXTEM выполнялись тесты HEPTEM и/или FIBTEM для исключения таких причин гипо­коагуляции, как гипофибриногенемия и/или наличие гепарина в образце крови. Значения теста FIBTEM_MCF >9 мм и отсутствие укорочения HEPTEM_ct по срав­нению INTEM_ct позволяли исключить гипофибриногенемию и действие гепарина как причины гипокоагуляции. Дальнейшие исследования были направлены на вы­явление дефицита отдельных факторов свертывания крови (рис. 1).

Принцип выявления дефицита отдельных факто­ров свертывания с помощью РОТЭМ был одинаков для каждого фактора. При выявлении удлинения в тестах внешнего пути (EXTEM) и/или внутреннего пути свертывания (INTEM), исследуемую цитратную кровь смешивали в соотношении 2:1 со стандартной плазмой, в которой активность всех факторов сверты­вания была в норме, и с дефицитной по одному из ис­следуемых факторов плазмой (рис. 2).

После чего повторяли тесты EXTEM и/или INTEM в зависимости от участия исследуемого фактора в каскаде свертывания. При наличии дефицита одно­го из факторов свертывания в тесте, выполненном со смесью цельной крови и стандартной плазмой, пара­метр CT укорачивался в тесте EXTEM и/или INTEM, а в пробе со смесью цельной крови и плазмой, дефи­цитной по исследуемому фактору, интервал СТ сохра­нялся удлиненным либо даже увеличивался еще боль­ше вследствие дилюции.

Удлинение только EXTEM_ct выявляется при дефиците FVII

Для подтверждения дефицита FVII на одном канале тромбоэластометра выполняли тест EXTEM из пробир­ки, содержавшей смесь двух частей цельной цитратной исследуемой крови и одной части стандартной плазмы, а на другом канале выполняли тест EXTEM из пробир­ки, содержавшей смесь двух частей цельной цитратной исследуемой крови и одной части плазмы, дефицитной по FVII. При дефиците FVII в тесте, выполненном со смесью крови с дефицитной плазмой, сохранялось удли­нение EXTEM , а в тесте со смесью крови со стандарт­ной плазмой происходила нормализация EXTEM_ct.

Одновременное удлинение EXTEM_ct и INTEM_ct выявляется при тяжелом дефиците FV

Для определения дефицита FV на двух каналах РОТЭМ выполняли тесты EXTEM и INTEM из про­бирки, содержавшей смесь двух частей цельной ци- тратной исследуемой крови и одной части стандартной плазмы, а на других двух каналах — тесты EXTEM и INTEM из пробирки, содержавшей смесь двух частей цельной цитратной исследуемой крови и одной части плазмы, дефицитной по FV. При дефиците FV в тестах EXTEM и INTEM, выполненных со смесью крови с де­фицитной плазмой, сохранялось удлинение EXTEM_ct и INTEM_ct, а в тестах EXTEM и INTEM, выполненных со смесью исследуемой крови со стандартной плазмой, происходила нормализация EXTEM_ct и INTEM_ct

Удлинение только INTEM_ct возникает при дефиците FVIII, FIX, FXI и FXII

Для выявления дефицита FVIII на одном канале РОТЭМ выполняли тест INTEM из пробирки, со­державшей смесь двух частей цельной цитратной ис­следуемой крови и одной части стандартной плазмы, а на другом канале выполняли тест INTEM из пробир­ки, содержавшей смесь двух частей цельной цитратной исследуемой крови и одной части плазмы, дефицитной по FVIII. При дефиците FVIII в тесте INTEM, выпол­ненном со смесью крови с дефицитной плазмой, сохра­нялось удлинение INTEM_ct, а в тесте INTEM, выпол­ненном со смесью исследуемой крови со стандартной плазмой, происходила нормализация INTEM_ct.

Для выявления дефицита FIX на одном канале РОТЭМ выполняли тест INTEM из пробирки, со­державшей смесь двух частей цельной цитратной ис­следуемой крови и одной части стандартной плазмы, а на другом канале выполняли тест INTEM из пробир­ки, содержавшей смесь двух частей цельной цитратной исследуемой крови и одной части плазмы, дефицитной по FIX. При дефиците FIX в тесте INTEM, выполнен­ном со смесью крови с дефицитной плазмой, сохраня­лось удлинение INTEM_ct, а в тесте INTEM, выпол­ненном со смесью исследуемой крови со стандартной плазмой, происходила нормализация INTEM_ct

Для выявления дефицита FXI на одном канале РОТЭМ выполняли тест INTEM из пробирки, со­державшей смесь двух частей цельной цитратной ис­следуемой крови и одной части стандартной плазмы, а на другом канале выполняли тест INTEM из пробир­ки, содержавшей смесь двух частей цельной цитратной исследуемой крови и одной части плазмы, дефицитной по FXI. При дефиците FXI в тесте INTEM, выполнен­ном со смесью крови с дефицитной плазмой, сохраня­лось удлинение INTEM_ct, а в тесте INTEM, выпол­ненном со смесью исследуемой крови со стандартной плазмой, происходила нормализация INTEM_ct

Для выявления дефицита FXII выполняли на одном канале РОТЭМ выполняли тест INTEM из пробирки, содержавшей смесь двух частей цельной цитратной ис­следуемой крови и одной части стандартной плазмы, а на другом канале выполняли тест INTEM из пробир­ки, содержавшей смесь двух частей цельной цитратной исследуемой крови и одной части плазмы, дефицит­ной по FXII. В тесте INTEM, выполненном со смесью крови с дефицитной плазмой, сохранялось удлинение INTEM_ct, а в тесте INTEM, выполненном со смесью исследуемой крови со стандартной плазмой, происхо­дила нормализация INTEM_ct

Ниже приведены примеры диагностики дефицита факторов у больных врожденными коагулопатиями.

Диагностика дефицита FVII

Больной О., 28 лет, страдает гипопроконвертинеми- ей. Заболевание протекает с геморрагическим синдро­мом в виде желудочно-кишечных и носовых кровотече­ний. Основные показатели системы гемостаза: АЧТВ 31 с, протромбин по Квику 14,5 %, МНО 4,6, фибри­ноген 2,3 г/л, плазменная активность FVII 1,7 %. В те­сте INTEM не выявлено отклонений от нормы, в те­сте EXTEM выявлено удлинение EXTEM_ct до 809 с (норма до 79 с), в тесте FIBTEM показатель MCF был в пределах нормы (12 мм), что исключило гипофибриногенемию как причину гипокоагуляции (рис. 3).

В тесте EXTEM, выполненном со смесью цельной цитратной крови со стандартной плазмой, EXTEM_ct сократился до 75 с, а в тесте EXTEM, выполнен­ном со смесью цельной цитратной крови с плазмой, дефицитной по FVII, EXTEM_ct остался удлинен­ным до 490 с, что свидетельствует об изолирован­ном дефиците FVII. На рисунке 4 представлен тест EXTEM при постановке со смесью цельной крови больного с дефицитом FVII со стандартной плаз­мой и смесью цельной крови больного с дефицитом FVII и плазмой, дефицитной по FVII. Происходит нормализация СТ в смеси со стандартной плазмой и сохраняется гипокоагуляция в смеси с дефицит­ной плазмой (рис. 4).

Оценка эффективности гемостатической терапии у больной гипопроконвертинемией

Больной З., 27 лет, страдающей гипопроконвертинемией, выполнено лапароскопическое удаление кисты яичника. До и после оперативного вмешательства вы­полнялись коагулогические исследования, измерялась плазменная активность FVII, выполнялась тромбоэла- стометрия. Как видно из таблицы 1, до введения реком­бинантного активированного фактора свертывания VII (rFVIIa) отмечалось выраженное удлинение EXTEM_ct до 405 с. После введения rFVIIa у больной уменьшился EXTEM_ct с 405 до 71 с, т.е. до нормы, и лишь через 12 ч возникли показания к повторному введению rFVIIa (удлинение EXTEM_ct до 116 с), хотя активность FVII в плазме была при этом 39 %, а МНО 1,23.

Таким образом, использование РОТЭМ позволило контролировать гемостаз во время операции и в после­операционном периоде и принять решение о повтор­ном введении rFVIIa.

Диагностика дефицита FV

Больная Д., 18 лет, врожденный дефицит FV у нее был выявлен в возрасте 7 лет. Геморрагический син­дром проявляется маточными кровотечениями, гема­томами различной локализации (плазменная актив­ность FV 0,5 %, АЧТВ 200 с, протромбин по Квику 10,7 %). В тесте ЕХТЕЖ выявлено удлинение СТ до 1953 с (норма до 79 с), в тесте INTEM — удлинение СТ до 1415 с (норма до 240 с). Показатель FIBTEM_mcf 17 мм позволил исключить дефицит фибриногена. Со­храняющееся удлинение СТ до 1069 с в тесте НЕРТЕМ позволило исключить действие гепарина как причины гипокоагуляции (рис. 5).

При выполнении тестов со смесью цельной цитрат - ной крови со стандартной плазмой интервал EXTEM_ct укоротился до 79 с, INTEM_ct — до 202 c, т.е. нормали­зовались. При выполнении тестов со смесью цельной цитратной крови с плазмой, дефицитной по FV, сохра­нилось патологическое удлинение EXTEM_ct до 475 с и INTEM_ct до 1060 с, что подтвердило дефицит FV (рис. 6).

Оценка эффективности гемостатической терапии у больной с дефицитом FV

Больной И., 21 года, с врожденным дефицитом FV (плазменная активность FV 0,5 %) была выполнена имплантация венозной порт-системы. Коррекция ги­покоагуляции проводилась трансфузией свежезаморо­женной плазмы (СЗП) и концентратом тромбоцитов. В таблице 2 представлены основные коагулогические показатели и результаты тромбоэластометрии до и по­сле заместительных трансфузий. Особенностью дан­ного клинического примера являлось то, что у больной в анамнезе были эпизоды венозных тромбозов после лечения СЗП. Поэтому основной задачей лечения было компенсировать гипокоагуляцию таким образом, что­бы избежать гиперкоагуляции. До операции отмеча­лось выраженное удлинение EXTEM_ct до 484 с (норма до 79 с). После трансфузии СЗП и концентрата тромбо­цитов у больной уменьшился EXTEM_ct до 116 с, актив­ность FV в плазме стала 19,5 %, МНО — 1,58 (табл. 2). Установлена порт-система без осложнений.

Пример 5. Диагностика дефицита FVIII

Больному А., 32 лет, диагноз гемофилия А был установ­лен в детском возрасте. В анамнезе отмечались рецидиви­рующие гемартрозы, кровотечения после экстракции зу­бов. Плазменная активность FVIII составляла 0,7-1,5 %. При настоящем обследовании в результате профилак­тической гемостатической терапии концентратом FVIII: АЧТВ 57 с, протромбин по Квику 110 %, фибриноген 2,4 г/л, активность FVIII 11 %. При обследовании в соот­ветствии с алгоритмом диагностики дефицита факторов свертывания с помощью РОТЭМ (рис. 1) в тесте EXTEM не выявлено отклонений от нормы, в тесте INTEM выяв­лено удлинение СТ до 872 с (норма до 240 с) (рис. 7).

Сохранение гипокоагуляции в тесте НЕРТЕМ исключило влияние гепарина (рис. 7). При выполне­нии теста INTEM со стандартной плазмой и плазмой, дефицитной по FVIII, выявлено укорочение INTEM_ct до 232 с в пробе со стандартной плазмой и сохране­ние удлинения INTEM_ct до 1929 с в пробе с плазмой, дефицитной по FVIII (рис. 8), что подтвердило дефи­цит FVIII. Дальнейшее увеличение INTEM_ct в про­бе с дефицитной плазмой можно объяснить дилюцией и уменьшением концентрации FVIII.

Диагностика дефицита FIX

Больной И., 15 лет, с рождения возникали спонтанные внутримышечные гематомы, носовые кровотечения, ге­мартрозы обоих коленных суставов. Диагностирована гемофилия В, тяжелая форма (FIX <1 %). При настоящем обследовании АЧТВ 151 с, протромбин по Квику 71 %, фибриноген 2,9 г/л, плазменная активность FIX 0,5 %. При обследовании в соответствии с алгоритмом диагно­стики дефицита факторов свертывания (рис. 1) в тесте EXTEM не выявлено отклонений от нормы, выявлено удлинение INTEM_CT до 505 с (норма до 240 с) (рис. 9).

С помощью теста НЕРТЕМ было исключено дей­ствие гепарина. При исследовании цельной крови со стандартной плазмой INTEM — 185 с, в тесте с де­фицитной плазмой INTEM_ct — 485 с (рис. 10), что под­твердило диагноз гемофилии В.

Диагностика дефицита фактора свертывания XI

Больная К., 44 лет, страдает гемофилией С (дефи­цит XI). Жалоб на спонтанную кровоточивость не предъ­являла, считала себя здоровой. Диагноз был установлен при обследовании перед хирургическим вмешатель­ством: АЧТВ удлинено до 90 с, протромбин по Квику 92 %, фибриноген 3,3 г/л, активность FXI составила 0,7 %. При обследовании в соответствии с алгоритмом диагностики дефицита факторов свертывания (рис. 1) в тесте EXTEM не выявлено отклонений от нормы, вы­явлено удлинение INTEM_CT до 472 с (норма до 240 с).

С помощью теста НЕРТЕМ было исключено дей­ствие гепарина. При исследовании цельной крови больной со стандартной плазмой INTEM_CT составил 203 с, в то время как в тесте с дефицитной плазмой INTEM_ct — 637 с (рис. 12), что подтвердило наличие дефицита FXI как причины гипокоагуляции.

Диагностика дефицита FXII

Больная Д., 47 лет, страдает болезнью Хагемана (де­фицит FXII). Заболевание впервые диагностировано в возрасте 37 лет, когда накануне оперативного вмеша­тельства было выявлено удлинение АЧТВ до 86 с, ак­тивность FXII составляла менее 1 %. В соответствии с алгоритмом диагностики дефицита факторов свер­тывания (рис. 1) в тесте ЕХТЕМ не выявлено отклоне­ний от нормы, выявлено удлинение INTEM_ct до 1681 с (норма до 240 с) (рис. 13).

С помощью теста НЕРТЕМ было исключено дей­ствие гепарина. При исследовании цельной крови больной со стандартной плазмой INTEM_ct нормали­зовался — 243 с, в то время как в тесте с плазмой, де­фицитной по FXII, INTE^P_t остался удлиненным — 694 с (рис. 14), что подтвердило дефицит FXII.

Оценка эффективности гемостатической терапии у больного с врожденным дефицитом FXII

Больному В., 54 лет, с диагнозом болезнь Хагемана, выполнено эндопротезирование коленного сустава.

До операции в коагулограмме: АЧТВ 164 с, концентра­ция фибриногена 3,8 г/л; протромбин по Квику 90 %, МНО 1,06; плазменная активность FXII 1 %. При ис­следовании методом РОТЭМ цельной крови удлине­ние INTEM 933 с (рис. 15).

Рисунок 15. INTEM_cr у больного болезнью Хагемана до начала гемостатической терапии

Figure 15. INTEM_cr in patient with Hageman's disease before hemostatic treatment

После трансфузии СЗП в коагулограмме АЧТВ со­кратилось до 45 с. При исследовании методом РОТЭМ после терапии СЗП уменьшился до нормальных зна­чений INTEM_ct 193 с (рис. 16). В послеоперационном периоде каких-либо геморрагических и тромботиче­ских осложнений не наблюдалось.

Обсуждение

К наследственным (врожденным) коагулопатиям от­носятся моногенные коагулопатии, которые вызваны дефицитом плазменных белков, участвующих в гемо­стазе [23]. Наиболее распространенным заболеванием в этой группе является гемофилия, редкие наследст­венные коагулопатии включают дефицит FI, FII, FV, FVII, FX, FXI, FXII. Причиной их развития является, как правило, рецессивное наследование уникального или редких нуклеотидных изменений в генах, коди­рующих коагуляционные факторы, или в белках, не­обходимых для посттрансляционных модификаций данных факторов. Эти заболевания наиболее распро­странены в этнических группах, в которых приняты близкородственные браки, вследствие вероятности го­мозиготного носительства дефекта гена [23]. До недав­него времени описания редких когулопатий состояли из исследований случай-контроль или малочисленных когортных исследований. Однако в последние годы появилось несколько специфических регистров. К ним можно отнести регистр Европейской сети редких ге­моррагических заболеваний (European Network of the Rare Bleeding Disorders) [24], североамериканский регистр [25], английский (UKHDCO, www.ukhdco.org), итальянский (http://www.aiceonline.it), швейцар­ский (www.aekreg.ch), бразильский и международ­ный (htttp://www.factorxi.org) регистры [26, 27]. Ин­цидентность этих редких врожденных коагулопатий колеблется от 1 : 500 000 до 1 : 2 000 000 населения [26]. Даже среди остальных врожденных коагулопа- тий редкие нарушения свертывания крови встреча­ются нечасто. По данным итальянского регистра [28], в который в 2016 г. было включено 10 300 больных орфанными нарушениями свертывания крови, а именно гемофилией, болезнью Виллебранда и дефицитом от­дельных факторов свертывания, больные с дефицитом отдельных факторов составляли всего 2093 человека, или 20,2 %.

В настоящей работе разработан алгоритм диагно­стики дефицита FV, FVII, FXI, FXII.

При тяжелой форме дефицита FV (болезнь Оврена) у больных обнаруживают удлинение ПВ и АЧТВ. Уд­линение времени в обоих тестах связано с тем, что FV входит в состав протромбиназного комплекса общего пути свертывания, который катализирует превраще­ние тромбина из протромбина. Диапазон нормальных значений плазменной активности FVII составляет 70­120 % [22, 29, 30].

При дефиците FVII, или гипопроконвертинемии, спон­танные кровотечения встречаются редко. Заболевание у мужчин часто протекает бессимптомно, у женщин проявляется обильными менометроррагиями, гемор­рагический синдром может проявиться при травме или хирургических вмешательствах [29]. Диагностика основана на результатах определения плазменной ак­тивности FVII, диапазон нормальных значений кото­рой составляет 70-120 %. При гипопроконвертинемии выраженность клинических проявлений слабо корре­лирует с выраженностью дефицита FVII [31], а при про­ведении заместительной терапии rFVIIa лабораторные тесты (АЧТВ, ПВ, плазменная активность FVII) не кор­релируют с его гемостатическим эффектом [32].

При дефиците FVIII (гемофилии А) отмечается сниже­ние плазменной активности FVIII и удлинение АЧТВ при сохранении других показателей в пределах нор­мальных значений. Для тяжелой формы гемофилии А характерно снижение активности FVIII менее 1 %, для средней степени тяжести 1—5 %, для легкой степе­ни тяжести >5 % [23].

При дефиците FIХ (гемофилии В) отмечается сниже­ние плазменной активности FIX и удлинение АЧТВ. Диапазон нормальных значений плазменной актив­ности FK составляет 50—120 %. Для тяжелой формы гемофилии В характерно снижение активности FIX менее 1 %, для средней степени тяжести 1—5 %, для лег­кой степени тяжести >5 % [23].

При дефиците FXI (гемофилия С) геморрагический синдром редко возникает спонтанно, как правило, по­сле хирургических манипуляций, травм. Диапазон нормальных значений плазменной активности FXI составляет 70—120 %. Диагноз устанавливается на ос­новании удлинения АЧТВ и сниженной плазменной активности FXI [29].

FXII (фактор Хагемана) активирует FXI, который затем триггирует фактор IX и приводит к тромбин-опосредованному образованиюю фибрина [33]. Од­нако ведущая физиологическая роль FXII — участие в процессах фибринолиза. Поэтому дефицит FXII рассматривается как протромботическое состояние. В то время как геморрагические проявления случа­ются редко, обычно при инвазивных вмешательствах или операциях, нарушения гемостаза часто обнаружи­вают случайно при предоперационном скрининге. Ди­апазон нормальных значений плазменной активности FXI составляет 70—120 % [29]. Удлинение АЧТВ реги­стрируется при снижении активности FXII в плазме крови ниже 42,5 % [34].

В основу методов определения активности факторов свертывания крови положено проведение тестов (FII, FV, FVII, FX) и/или АЧТВ (FVIII, FIX, FXI, FXII)

в разбавленном исследуемом образце. При этом сниже­ние активности факторов свертывания компенсируют внесением в инкубационную среду субстратной плаз­мы, не содержащей соответствующего фактора, но име­ющей полноценную активность других факторов свер­тывания. Таким образом, активность анализируемых факторов в исследуемом образце оказывается единст­венной неизвестной величиной, определяющей скорость процесса свертывания. Количественное определение активности факторов проводят по калибровочному гра­фику разведений плазмы-калибратора с аттестованной активностью соответствующего фактора [35].

Распространенным способом определения дефицита факторов свертывания является одностадийный клоттинговый метод исследования с использованием суб­стратных (дефицитных) образцов плазмы, лишенных одного из факторов свертывания крови [36]. Прин­цип метода заключается в определении промежутка времени после добавления стартового реактива, за­пускающего каскад свертывания плазмы по внутрен­нему или внешнему пути, в смесь субстратной (дефи­цитной) плазмы, в которой отсутствует исследуемый фактор, и исследуемой плазмы больного. Степень кор­рекции зависит от активности исследуемого фактора свертывания, поскольку активность других факторов свертывания в этой системе в норме. Активность де­фицитного фактора в исследуемой плазме определяют по кривой разведения.

Двухстадийный клоттинговый метод определения активности факторов свертывания крови не требу­ет использования субстратной дефицитной плазмы и не зависит от наличия активированного фактора свертывания в исследуемом образце [37]

Хромогенный метод определения активности фак­торов свертывания крови рекомендуется использо­вать только как ориентировочный и предпочтитель­но для оценки концентратов факторов свертывания, а не с диагностическими целями [35].

Концентрация факторов может также определяться иммуноферментным методом.

С помощью линейной регрессии показано [24], что имеется сильная ассоциация между выраженно­стью геморрагического синдрома и сниженной актив­ностью FI и слабая ассоциация между выраженностью дефицита FV и FVII и клиническими проявлениями кровоточивости. Минимальная концентрация фак­торов, ниже которой у больных возникал геморра­гический синдром, составила для фибриногена 1 г/л, для FV — 12 ед/дл, FVII — 25 ед/дл, FXI — 26 ед/дл, FXII — 31 ед/дл, а концентрация факторов в плазме крови, которая соответствует выраженному геморра­гическому синдрому, составляет <10 ед/дл для FVII, <25 ед/дл для FХI, а для факторов свертывания FI, FV и FXII выраженный геморрагический синдром возни­кает, когда их концентрация в крови не определяется вообще [24].

Более того, ни один из вышеперечисленных методов нельзя отнести к методам point-of-care. Во многих ста­ционарах нет условий, оборудования и специалистов для исследования активности факторов свертывания. В результате при выявлении нарушений в системе ге­мостаза, особенно если до обследования не известен диагноз, отменяются или откладываются инвазивные вмешательства либо лечение проводится без установ­ленного диагноза и может оказаться неэффективным [38]. В то же время согласно приказу Министерства здравоохранения РФ от 15 ноября 2012 г. № 919н «Об утверждении Порядка оказания медицинской по­мощи взрослому населению по профилю “анестези­ология и реаниматология”» в стандарт оснащения отделения анестезиологии-реанимации с палатами ре­анимации и интенсивной терапии входит тромбоэластограф или тромбоэластометр. В литературе описаны попытки использовать глобальные тесты исследования гемостаза для диагностики дефицита отдельных факто­ров свертывания [30]. Но большинство из них относится к применению теста генерации тромбина [39—41] и лишь единичные — к применению тромбоэластометрии [42].

Белорусские исследователи [43] изучили параметры тромбоэластометрии во время операции транспланта­ции печени, при которых отмечались изменения в кро­ви содержания факторов свертывания (фибриногена, FII, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII). Авторы [43] отметили, что наибольшей диагностической эффек­тивностью обладали следующие параметры: ЕХТЕМ_СТ >80 с и КТЕМ_ст >240 с. Чувствительность изменения ЕХТЕМ_ст составила всего 19 %, т.е. по данным тром- боэластометрии восполнение дефицита факторов бу­дет проводиться лишь в каждом пятом случае, когда имеются показания согласно общепринятым рекомен­дациям (МНО >2,0). Чувствительность изменения КТЕМ_ст >составила 51 %. Однако авторы [43] не пы­тались по параметрам РОТЭМ дифференцировать де­фицит отдельных факторов крови, а лишь оценивали их изменения в совокупности. Кроме того, в этом ис­следовании дефицит факторов был невыраженный, минимально факторы снижались через 15 минут по­сле реперфузии (медианы FII 44 %, FV 17 %, FVII 29 %, FIX 59 %, FX 39 %, FXI 56 %, FXII 66 %), т.е. их содержание было значительно больше, чем у больных с врожденным дефицитом, чем можно объяснить низ­кую чувствительность тестов.

Оценить возможность использования РОТЭМ для диагностики дефицита FV попытались Т. Haas и соавт. [44]. Авторы смешивали плазму, дефицитную по FV, с нормальной человеческой плазмой (актив­ность FV 96 %) в разных пропорциях, чтобы получить плазму с активностью фактора 0, 10, 16, 25, 50 и 100 %. Затем исследовали каждое из разведений плазмы на Rotem, чтобы оценить влияние разного количест­ва фактора на СТ. Низкая активность FV ассоцииро­валась с удлинением СТ. Уменьшение активности FV со 100 до 25 % сопровождалось удлинением СТ лишь с 50 до 65 с, но при уменьшении активности FV менее 10 % период СТ удлинялся до 140 с и более.

Эти данные согласуются с результатами, получен­ными нами в настоящем исследовании: при смеши­вании цельной крови больного с дефицитом FV с де­фицитной по FV плазмой сохранялось удлинение СТ, а при смешивании с нормальной плазмой происходила нормализация СТ.

L. Spiezia и соавт. [42] исследовали возможность ис­пользования РОТЭМ для выявления нарушений гемо­стаза у 9 больных с дефицитом FV, используя для это­го их цельную кровь и бедную тромбоцитами плазму. При постановке тестов с цельной кровью они выявили значимое удлинение СТ в трех стандартных тестах (INTEM, EXT EM, FIBTEM), в то время как показа­тель CFT был удлинен только в тесте INTEM и был неизмеряемым в тесте FIBTEM. При исследованиях in vitro с плазмой больных с дефицитом FV, бедной тром­боцитами, авторы выявили удлинение СТ и укорочение MCF в тестах INTEM, EXTEM и FIBTEM по сравне­нию с аналогичными показателями, выполненными с бедной тромбоцитами плазмой здоровых людей. До­бавление при пробоподготовке к обоим образцам бед­ной тромбоцитами плазмы тромбоцитов больных либо тромбоцитов здоровых людей приводило к укорочению СТ, которое было более выражено при использовании тромбоцитов здоровых людей, причем СТ больше со­кращался в EXTEM, чем в INTEM. Полученный эф­фект связан с тем, что 20 % всего пула FV хранится в α-гранулах тромбоцитов в частично активированной форме [45]. Аналогичные изменения на РОТЭМ зафик­сировано было и в настоящей работе после трансфузии СЗП и концентрата тромбоцитов у больной с дефици­том фактора V при установке порт-системы.

Однако в работах по изучению влияния дефицита FV на показатели РОТЭМ исследователи не предла­гали непосредственно методику диагностики дефи­цита фактора на основе РОТЭМ и не использовали ее для оценки эффективности и безопасности терапии. Особенностью представленного в настоящей работе клинического примера лечения больной дефицитом FV являлось то, что у больной в анамнезе были эпизо­ды венозных тромбозов после трансфузии свежезамо­роженной плазмы. Поэтому основной задачей лечения было компенсировать гипокоагуляцию таким образом, чтобы избежать гиперкоагуляции, сохраняя умерен­ную гипокоагуляцию, которая позволила бы выпол­нить оперативное вмешательство.

В нашем исследовании РОТЭМ использовали для ди­агностики и контроля за гемостатической терапией rFVIIa во время оперативного вмешательства у боль­ной гипопроконвертинемией. В литературе мало со­общений об использовании вискоэластичных методов у больных гипопроконвертинемией. H.T.T. Tran и соавт. [46] обследовали с помощью модифицированных тестов РОТЭМ 12 больных с плазменной активностью FVII <1 %. Как и в нашем исследовании, они выявили двукратное удлинение СТ в тесте с тканевым факто­ром (аналог теста EXTEM) по сравнению со здоровым контролем, при этом параметр MCF между группами не различался.

Описаны изменения РОТЭМ у больных гемофилией А и В [47], причем изменения параметров INTEM кор­релируют с тяжестью гемофилии и выраженностью дефицита FVIII. Более того, отмечается, что использо­вание вискоэластичных методов позволяет подобрать индивидуально дозы дефицитных факторов [47].

Данные по влиянию дефицита FXI фактора на INTEM были получены D. Dirkmann и соавт. [48]. Авторы использовали ROTEM для оценки влияния дефицита FXI на коагуляцию у пятилетней девочки с врожденным тяжелым дефицитом FXI, у которой от­мечалось удлинение АЧТВ до 65-99 с, МНО состави­ло 0,98, концентрация фибриногена плазмы — 3,5 г/л, плазменная активность FXI — 2 %. При обследовании с помощью РОТЭМ у нее были нормальные значения EXTEM_ct и более чем в три раза увеличен показатель INTEM (776 c). При добавлении in vitro rFVIIa к про­бе крови в концентрациях от 0,25 до 1 мкг/мл, что соот­ветствует концентрации препарата в крови при внутри­венном введении в дозе 15-70 мкг/кг массы тела. Было показано, что доза концентрации в крови 0,5 мкг/мл (что соответствует внутривенному введению rFVIIa в дозе 30 мкг/кг массы тела) столь же эффективно нор­мализовала параметр INTEM_ct, как и концентрация 1 мкг/мл [49]. Имеется сообщение об использовании ROTEM для мониторинга терапии малыми дозами rFVIIa у больных с тяжелым дефицитом FXI при хи­рургических вмешательствах [49]. В нашем исследова­нии дефицит FXI проявлялся удлинением INTEM , которое компенсировалось при добавлении стандарт­ной плазмы в пробирку.

В литературе имеются лишь единичные сообще­ния о применении тромбоэластографии для диагно­стики изолированного дефицита FXII и мониторин­га проводимой терапии у людей [50, 51]и животных [52]. Помимо того что при этом заболевании выяв­ляется гипокоагуляция, дефицит FXII рассматрива­ется как протромботическое состояние, ввиду того что FXII участвует в процессах фибринолиза. Преи­мущество использования РОТЭМ заключается в том, что, не измеряя непосредственно активности факто­ров, метод позволяет не только диагностировать нару­шения гемостаза, но и контролировать эффективность и безопасность гемостатической терапии. Он позволя­ет дозировать гемостатическую терапию таким обра­зом, чтобы удерживаться в «терапевтическом окне», в котором достигается приемлемый гемостаз, и в то же время не возникает гиперкоагуляция. Переход из со­стояния гипокоагуляции в гиперкогуляцию не всегда соответствует концентрации фактора в плазме, и луч­ше оценивать его функционально, с помощью РОТЭМ.

Ограничения исследования. Одним из ограничений исследования является небольшая выборка больных, поскольку это редко встречающиеся нарушения свер­тывания крови.

Другим ограничением метода может явиться соче­танный дефицит нескольких факторов, и хотя он так­же встречается крайне редко, для его диагностики бу­дет необходимо усложнить алгоритм обследования.

Наконец, третьим ограничением может явиться на­личие ингибиторов к факторам свертывания, когда представленный алгоритм не будет работать, посколь­ку в этих условиях добавление стандартной плазмы не приведет к нормализации активности факторов свертывания.

Таким образом, с помощью РОТЭМ возможно опре­деление дефицита отдельных факторов свертывания крови. После выявления удлинения СТ в EXTEM и/или INTEM, исключения действия гепарина и гипофибриногенемии, необходимо выполнить смешивание исследуемой свежей цитратной крови в соотношении 2:1 со стандартной плазмой и с дефицитной по одно­му из исследуемых факторов плазмой. Нормализация показателей РОТЭМ в пробе со стандартной плазмой и сохранение гипокоагуляции в пробе с дефицитной по фактору плазмой позволяет подтвердить дефицит фактора свертывания крови.