Preview

Гематология и трансфузиология

Расширенный поиск

Олигоклональность и субпопуляционный состав Т-клеток костного мозга у больных апластической анемией

https://doi.org/10.35754/0234-5730-2020-65-4-417-430

Полный текст:

Аннотация

Ведение. Основным патогенетическим механизмом развития апластической анемии (АА) считается нарушение иммунной регуляции кроветворения.

Цель: изучить субпопуляционный состав Т-клеток и репертуар Т-клеточного рецептора у больных АА.

Методы. C 2018 по 2020 г. в исследование были включены больные АА (n = 40) до начала иммуносупрессивной терапии. Исследование субпопуляционного состава Т-клеток и олигоклональности Т-клеточного рецептора по семействам Vβ (ТКР-Vβ) образцов костного мозга проводили с помощью метода проточной цитометрии.

Результаты. Выявлены наиболее характерные особенности Т-клеточных субпопуляций у всех больных АА в образцах костного мозга: увеличение количества цитотоксических Т-клеток, эффекторных CD4+ и CD8+ клеток, CD4+ клеток памяти, что может подтверждать наличие длительной антигенной стимуляции с последующей активацией этих субпопуляций клеток, в результате которой происходит гиперэкспрессия провоспалительных цитокинов. Уменьшение наивных CD4+ и CD8+ клеток, регуляторных Т-клеток, двойных негативных Т-клеток может указывать на снижение контроля за цитокинпродуцирующими Т-клетками. Установлена связь между степенью тяжести АА и количеством эффекторных Т-клеток, Т-регуляторных клеток, двойных негативных Т-клеток и PD-1-позитивных Т-клеток. Самое большое количество потенциально цитокинпродуцирующих Т-клеток и минимальное количество клеток, участвующих в регуляции Т-клеточной активности, было выявлено у больных сверхтяжелой АА. При анализе репертуара ТКР-Vβ была обнаружена олигоклональная экспансия преимущественно в субпопуляции цитотоксических Т-клеток.

Заключение. Обогащение определенных семейств Vβ свидетельствует о наличии аутореактивного Т-клеточного клона и подтверждает иммунный механизм развития АА. Динамическое исследование TКР-Vβ-репертуара может быть предложено в качестве мониторинга течения заболевания. Метод проточной цитофлуориметрии помогает выявить значимые биомаркеры для мониторинга клонов Т-клеток при АА с целью наиболее точной оценки активности патологического процесса при АА.

Для цитирования:


Абрамова А.В., Гальцева И.В., Михайлова Е.А., Капранов Н.М., Давыдова Ю.О., Фидарова З.Т., Троицкая В.В., Паровичникова Е.Н., Савченко В.Г. Олигоклональность и субпопуляционный состав Т-клеток костного мозга у больных апластической анемией. Гематология и трансфузиология. 2020;65(4):417-430. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2020-65-4-417-430

For citation:


Abramova A.V., Galtseva I.V., Mikhailova E.A., Kapranov N.M., Davydova Yu.O., Fidarova Z.T., Troitskaya V.V., Parovichnikova E.N., Savchenko V.G. Oligoclonality and subpopulation structure of bone marrow T-cells in patients with aplastic anaemia. Russian journal of hematology and transfusiology. 2020;65(4):417-430. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/0234-5730-2020-65-4-417-430

Введение

Апластическая анемия (АА) — это редко встречающееся заболевание системы крови, характеризующееся тяжелой костномозговой недостаточностью с истощением пула гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Исследования, посвященные изучению АА, свидетельствуют об аутоиммунном механизме развития заболевания [1][2][3]. Главную роль в развитии аутоиммунных реакций при АА играют активированные цитотоксические T-клетки, распознающие аутоантигены, представленные на гемопоэтических стволовых клетках с помощью молекул HLA (Human Leukocyte Antigens) класса I [4][5]. Результаты исследований указывают на наличие антигенного стимула, который приводит к патологической активации и дисрегуляции CD4+ Т-клеток в костном мозге (КМ) и повышенной секреции провоспалительных цитокинов, основными из которых являются интерферон-γ (ИФН-γи фактор некроза опухоли-α [3][6][7]. Пусковой фактор активации иммунной системы неизвестен. Поэтому более детальное понимание иммунных механизмов развития болезни необходимо при разработке долгосрочного эффективного лечения.

ИФН-γ регулирует взаимодействие клеток, участвующих в иммунном ответе. Являясь продуктом Т-хелперов 1-го типа, он вместе с другими провоспалительными цитокинами активирует цитотоксические Т-лимфоциты (CD8+и усиливает фагоцитарные и цитотоксические реакции в очаге воспаления, которым в данном случае является КМ [8]. В КМ больных AA выявляется выраженная качественная и количественная недостаточность регуляторных T-клеток (T-рег), которые в нормальных условиях подавляют аутореактивность других популяций T-клеток, в частности в отношении к ГСК [9][10]. Особую роль в иммунном ответе при АА играют T-хелперы, которые при активации начинают секретировать интерлейкин-2, что обеспечивает пролиферацию цитотоксических Т-лимфоцитов, которые, в свою очередь, являются источником продукции провоспалительных цитокинов [11].

Иммунный ответ и регуляцию активности Т-клеточного звена контролируют костимуляторные молекулы, которые в условиях активации Т-клеток способствуют ингибированию пролиферации, эффекторной функции (секреция цитокинов) и индукции апоптоза Т-клеток [12]. В нормальных условиях этот механизм ингибирования предотвращает чрезмерную активацию популяций Т-клеток, например нежелательные аутоиммунные реакции, поддерживая периферическую иммунную толерантность. Одной из таких костимуляторных молекул является PD-1 (Programmed cell death-1) — костимуляторный рецептор семейства CD28, который, взаимодействуя со своим лигандом PD-L1/PD-L2, ингибирует сигнальный путь, вовлеченный в активацию Т-клеток и тем самым способствует подавлению активности Т-клеток и индукции апоптоза [13]. Блокировка либо PD-1, либо его лигандов способствует развитию системных и органоспецифических аутоиммунных заболеваний, что подтверждено в экспериментах на животных [14]. Результаты немногочисленных исследований показали повышенную экспрессию PD-1-рецептора на поверхности Т-клеток больных АА, что, вероятно, связано с аберрантной регуляцией активации Т-клеток при данном заболевании [15][16]. Однако связь между высокой экспрессией PD-1 и AA не изучена.

Имеются данные о том, что у больных АА в КМ происходит пролиферация аутореактивных клонов цитотоксических Т-лимфоцитов. Этот процесс называют также олигоклональным обогащением (расширением) или экспансией Т-клеток [5][10].

Аутоантиген потенциально может быть распознан Т-клеткой с определенным вариантом Т-клеточного рецептора (ТКР). Взаимодействие ТКР с антигеном ведет к активации Т-лимфоцита и является ключевым событием в запуске иммунного ответа [17]. ТКР состоит из двух субъединиц — α и β либо γ и δВ каждой субъединице расположены два домена — константный (С), который закрепляет рецептор в плазматической мембране Т-лимфоцита, и вариабельный (V), который непосредственно отвечает за распознавание антигена. Узнавание Т-клеточным рецептором обширного спектра разнообразных антигенов достигается путем перегруппировки и рекомбинации V(D)J (V — variable, D — diversity и J — joining) участков генов вариабельных частей αи β-цепей ТКР. Наибольшая изменчивость ТКР сосредоточена в участке CDR3 (complementarity determining region, CDR), который и определяет связывание рецептора с антигеном [18]. Именно этот участок представляет основной интерес при исследовании репертуара ТКР. Анализ перестройки ТКР обычно используется в диагностике лимфоидных злокачественных новообразований и может быть важным инструментом в изучении Т-клеточных реакций на патогены, и в том числе при аутоиммунных заболеваниях [19][20].

При АА происходит нарушение иммунной регуляции и срыв толерантности к собственным антигенам, что приводит к пролиферации аутореактивных клонов Т-клеток [21][22][23]. Учитывая разнообразие спектра распознавания ТКР, идентификация иммунодоминантных клонов остается сложной задачей. Изучение Т-клеток и их клонального состава представляется актуальным в исследовании иммуноопосредованных гематологических заболеваний, так как может помочь в отслеживании активности заболевания, прогнозировании ответа на иммуносупрессивную терапию (ИСТ) и рецидива.

Известно несколько методических подходов к изучению клонального состава Т-клеток: определение клональности по реаранжировкам генов ТКР с помощью фрагментного анализа, секвенирование нового поколения или количественное определение Т-клеток с конкретным типом вариабельного домена β-цепи ТКР (репертуар ТКР-Vβ) методом проточной цитофлуориметрии. Существует 65 Vβ-сегментов в β-локусе ТКР, которые можно сгруппировать в 25 семейств (22 функциональных семейства), причем каждый член данного семейства имеет более 75 % гомологии на уровне нуклео­тидов по меньшей мере с одним из других членов того же семейства [24]. Созданы моноклональные антитела, специфично связывающиеся с ТКР, принадлежащим к определенному Vβ-семейству. Частота встречаемости различных ТКР-Vβ-семейств отличается между собой, изучена и известна у здоровых людей в периферической крови. Увеличение доли какого-либо из Vβ-семейств выше верхней границы нормы может свидетельствовать о наличии Т-клеточного клона в пределах данного семейства [25]. Многоцветная проточная цитометрия позволяет также изучать функциональные подгруппы Т-клеток и маркеры активации [26]. Данные подходы дают детальное представление о характере Т-клеточного ответа и могут быть использованы для изучения иммунного механизма развития АА.

Целью исследования было изучение субпопуляционного состава Т-клеток и репертуара Т-клеточного рецептора у больных АА.

Материалы и методы

В исследование были включены больные АА (n = 40), обследовавшиеся в ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России до начала ИСТ с 2018 по 2020 г. и подписавшие информированное согласие на включение в исследование. Соотношение мужчин и женщин составило 1 : 1,2, медиана возраста — 25 (17–60) лет. Диагноз АА устанавливался на основании следующих критериев: трехростковая цитопения, малоклеточный КМ, отсутствие мегакариоцитов по данным миелограммы, аплазия при гистологическом исследовании КМ, отсутствие цитогенетических аномалий. Больные были разделены на три группы в зависимости от степени тяжести: нетяжелая АА (НАА) (n = 23), тяжелая АА (ТАА) (n = 11) и сверхтяжелая АА (СТАА) (n = 6). Основным критерием тяжести АА являлось количество гранулоцитов в периферической крови в дебюте заболевания (нейтрофилы более 0,5 × 109/л — для НАА, 0,2–0,5 × 109/л — для ТАА и менее 0,2 × 109/л — для СТАА). Материал для исследования — первая порция аспирата КМ, полученная во время диагностических стернальных пункций. В качестве контрольной группы для определения субпопуляций T-клеток и экспансии клонов Vβ Т-клеток использовали КМ 23 здоровых доноров КМ, подписавших информированное согласие на включение в исследование. Медиана возраста доноров составила 31 (19–52) год.

Определение субпопуляционного состава T-лим­фо­цитов проводили с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Для этого была разработана панель моноклональных антител к антигенам дифференцировки человека, меченых различными флуорохромными красителями, представленная в таблице 1. Использование данной панели моноклональных антител позволяет определить относительное количество Т-клеточных субпопуляций, представленных в таблице 2.

Таблица 1. Моноклональные антитела к антигенам дифференцировки человека, использованные в исследовании
Table 1Monoclonal antibodies to human differentiation antigens used in the study

Антигенная специфичность

Antigenic specificity

Флуорохром

Fluorochrome

Клон

Clone

1

CD3

FITC  флуоресцеин изотиоцианат

fluorescein isothiocyanate

SK7

2

CD4

APC-Cy7 — аллофикоцианин-цианин 7

allophycocyanin-cyanine 7

SK3

3

CD8

PerCP-Cy5.5 —перидинин-хлорофил протеин-цианин 5.5

peridinin-chlorophyll protein-cyanine 5.5

SK1

4

CD127

PE  фикоэритрин

phycoerythrin

A019D5

5

CD56

PE  фикоэритрин

phycoerythrin

MY31

6

CD25

FITC — флуоресцеин изотиоцианат

fluorescein isothiocyanate

2A3

7

CD95

PE-Cy7  фикоэритрин-цианин 7

phycoerythrin-cyanine 7

DX2

8

CD274 (PD-L1)

PE-Cy7 — фикоэритрин-цианин 7

phycoerythrin-cyanine 7

MIH1

9

CD28

APC  аллофикоцианин

allophycocyanin

CD28.2

10

CD279 (PD-1)

APC  аллофикоцианин

allophycocyanin

MIH4

Таблица 2. Основные Т-клеточные субпопуляции и фенотип клеток, определяемые в исследовании
Table 2Main T-cell subpopulations and phenotypes defined in the study

Т-клетки

T-cells

Фенотип клеток

Cell phenotype

Популяция Т-клеток, относительно которой определяли долю

Reference T-cells

Двойные негативные Т-клетки

Double-negative T-cells

CD3+CD4-CD8-

CD3+ клетки

CD3cells

Двойные позитивные Т-клетки

Double-positive T-cells

CD3+CD4+CD8+

CD3+ клетки

CD3cells

Т-хелперы

T-helper cells

CD3+CD4+

CD3+ клетки

CD3cells

Цитотоксические Т-клетки

Cytotoxic T-cells

CD3+CD8+

CD3+ клетки

CD3cells

TNK-клетки

TNK cells

CD3+CD56+

CD3+ клетки

CD3cells

В популяциях CD4+ и CD8+ клеток

CD4+ and CD8populations

Эффекторные Т-клетки

Effector T-cells

CD28-CD95+

CD28-CD95+

Активированные Т-клетки

Activated T-cells

CD25+

CD25+

Т-клетки «памяти»

Memory T-cells

CD28+CD95+

CD28+CD95+

Регуляторные Т-клетки

Regulatory T-cells

CD25+CD127-

PD-1-позитивные клетки

PD-1 positive cells

CD279+

CD279+

PD-L1-позитивные клетки

PD-L1 positive cells

CD274+

CD274+

Наивные Т-клетки

Naive T-cells

CD28+CD95-

CD28+CD95-

Для анализа ТКР-Vβ-репертуара Т-лимфоцитов КМ больных (n = 39) (данные одного пациента были удалены из исследования вследствие ошибки подготовки пробы) был использован коммерческий набор IOTest Beta Mark ТКР-Vβ Repertoire (Beckman Coulter, Майами, Флорида, США), позволяющий оценить следующие семейства ТКР-Vβ: Vβ 1, Vβ 2, Vβ 3, Vβ 4, Vβ 5.1, Vβ 5.2, Vβ 5.3 , Vβ 7.1, Vβ 7.2, Vβ 8, Vβ 9, Vβ 11, Vβ 12, Vβ 13.1, Vβ 13.2, Vβ 13.6, Vβ 14, Vβ 16, Vβ 17, Vβ 18, Vβ 20, Vβ 21.3, Vβ 22 и Vβ 23. Данный набор включает 8 смесей моноклональных антител — каждая содержит антитела против 3 различных областей TКР-Vβ-семейств, охватывающих 24 антигена TКР-Vβчто соответствует приблизительно 70 % нормального репертуара TКР-Vβ человека [27].

Изучали репертуар ТКР-Vβ для Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток отдельно. Система IOTest Beta Mark была адаптирована для исследования образцов КМ здоровых доноров и больных АА. Поскольку в литературе указаны референсные значения для ТКР-Vβ только в периферической крови, необходимо было уточнить референсные границы для ТКР-Vβ в КМ. Обогащенным считали семейство Vβ, если оно выходило за верхнюю границу уточненного референсного интервала. Если все значения ТКР-Vβ находились в пределах референсных интервалов доноров, то такие значения считали поликлональными. Олигоклональный результат определяли при наличии преобладания одного и более обогащенных Vβ-семейств, без поликлонального фона.

Статистическая обработкаСтатистическая обработка выполнена с помощью R 3.6.3, GraphPad PRISM 8.0. Границы референсных интервалов для каждого из 24 клонов были рассчитаны на основании анализа КМ доноров и включали значения от 2,5 до 97,5 процентиля после исключения выбросов. Если у больного доля клеток с определенным семейством Vβ превышала референсное значение, то делали вывод о том, что у больного выявляется клон c данным ТКР-Vβ-семейством. Для определения соответствия распределения нормальному использовали критерий Шапиро — Уилка. Для определения отличий в долях различных субпопуляций T-клеток у больных и доноров использовали T-критерий Стьюдента, если данные были распределены нормально, и критерий Манна — Уитни — в случае ненормальных распределений. Сравнение субпопуляций T-клеток у больных АА с различной степенью тяжести и доноров осуществлялось с помощью критерия Краскела — Уоллиса с поправкой на множественные сравнения Данна. Для всех использованных критериев значимым был выбран уровень p < 0,05. Данные в таблицах представлены в виде среднего ± стандартной ошибки среднего.

Результаты

Субпопуляционный состав T-клеток костного мозга больных АА и доноровПри анализе субпопуляционного состава Т-клеток у больных АА выявлена достоверно (p < 0,05) большая доля CD4+ и CD8+ эффекторных клеток, СD4+ клеток «памяти», CD4+PD-1+ и CD8+PD-1+а количество субпопуляций CD4и СD8+ наивных клеток, CD4+PD-L1было достоверно (p < 0,05) меньше по сравнению с аналогичными субпопуляциями доноров (рис. 1). Субпопуляции CD4+, CD8+, CD3+CD4+CD8(двойные позитивные Т-клетки), CD3+CD4-CD8- (двойные негативные Т-клетки), CD8+ клеток «памяти», регуляторных Т-клеток, активированных CD4+ и CD8+, CD8+PD-L1+ клеток больных достоверно не отличались от аналогичных субпопуляций доноров (табл. 3).


Рисунок 1
Субпопуляции Т-лимфоцитов у больных АА в сравнении с донорами и в зависимости от степени тяжести АА (Т-хелперы, цитотоксические клетки, наивные и Т-клетки «памяти», эффекторные Т-клетки, TNK-клетки, регуляторные Т-клетки, двойные позитивные и двойные негативные Т-клетки, доля PD-1- и PD-L1-позитивных клеток среди популяции Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток)
Figure 1T-lymphocyte subpopulations in AA patients compared to donors and relative to AA severity (T-helper cells, cytotoxic cells, naive and memory T-cells, effector T-cells, TNK cells, regulatory T-cells, double positive and double negative T-cells, portions of PD-1 and PD-L1 positive cells in T-helper cells and cytotoxic T-cell populations)

Таблица 3. Относительное количество субпопуляций Т-клеток у больных АА и доноров КМ
Table 3Relative T-cell subpopulation counts in AA patients and bone marrow donors

Субпопуляция лимфоцитов

Lymphocyte subpopulation

Доноры

Donors

Все случаи АА

All АА types

НАА

Non severe АА

ТАА

Severe АА

СТАА

Very severe АА

Т-хелперы, % (от лимфоцитов)

T-helper cells, % of lymphocytes

51,67 ± 2,1

47,03 ± 1,79

48,67 ± 2,41

46,66 ± 2,72

41,42 ± 5,67

Цитотоксические T-клетки, % (от лимфоцитов)

Cytotoxic T-cells, % of lymphocytes

42,36 ± 2,13

44,9 ± 1,55

43,97 ± 1,76

42,55 ± 2,64

52,73 ± 5,6

NKT-клетки, % (от лимфоцитов)

NKT-cells, % of lymphocytes

4,28 ± 0,58

5,04 ± 0,42

5,03 ± 0,6

5,5 ± 0,6

4,24 ± 1,25

CD3+CD4-CD8- клетки, % (от лимфоцитов)

CD3+CD4-CD8- cells, % of lymphocytes

5,18 ± 0,57

7,24 ± 0,92

6,53 ± 1,07

10,27 ± 2,22**

4,42 ± 0,87

CD3+CD4+CD8+ клетки, % (от лимфоцитов)

CD3+CD4+CD8+ cells, % of lymphocytes

0,79 ± 0,1

0,83 ± 0,13

0,83 ± 0,13

0,52 ± 0,09

1,43 ± 0,62

Эффекторные CD4+ клетки, % (от Т-хелперов)

Effector CD4cells, % of T-helper cells

1,04 ± 0,27

3,39 ± 0,71*

3,3 ± 1,05

2,88 ± 1,04

4,66 ± 1,7

Наивные CD4+ клетки, % (от Т-хелперов)

Naive CD4cells, % of T-helper cells

59,73 ± 2,41

47,56 ± 2,97*

45,65 ± 4,41

54,2 ± 2,87

42,72 ± 8,78

CD4+ клетки «памяти», % (от Т-хелперов)

Memory CD4cells, % of T-helper cells

37,99 ± 2,46

47,99 ± 2,71*

50,1 ± 3,86

41,83 ± 2,74

51,18 ± 9,15

Эффекторные CD8+ клетки, % (от Т-цитотоксических клеток)

Effector CD8cells, % of cytotoxic T-cells

23,78 ± 2,22

37,26 ± 2,61*

35,61 ± 3,22

33,98 ± 5,38

49,6 ± 6,09

Наивные CD8+ клетки, % (от Т-цитотоксических клеток)

Naive CD8cells, % of cytotoxic T-cells

28,8 ± 3,13

18,77 ± 1,91*

16,91 ± 2,32

25,09 ± 4,28

14,31 ± 3,34

CD8+ клетки «памяти», % (от Т-цитотоксических клеток)

Memory CD8cells, % of cytotoxic T-cells

41,92 ± 2,77

39,15 ± 2,41

42,5 ± 3,17

37,36 ± 4,79

29,61 ± 4,48

Регуляторные T-клетки, % (от Т-хелперов)

Regulatory T-cells, % of T-helper cells

9,36 ± 0,54

9,31 ± 0,59

9,28 ± 0,76

10,25 ± 1,37

7,84 ± 0,88

Активированные CD4+ клетки, % (от Т-хелперов)

Activated CD4+ cells, % of T-helper cells

17,44 ± 2,63

20,93 ± 2,07

21,97 ± 3,09

20,12 ± 3,39

18,33 ± 3,63

CD4+PD-1+ клетки, % (от Т-хелперов)

CD4+PD-1+ cells, % of T-helper cells

11,42 ± 1,45

14,03 ± 1,27*

13,59 ± 1,33

11,3 ± 1,42

20,54 ± 5,69

CD4+PD-L1+ клетки, % (от Т-хелперов)

CD4+PD-L1+ cells, % of T-helper cells

2,22 ± 0,48

1,52 ± 0,33*

1,91 ± 0,51

1,38 ± 0,39

0,27 ± 0,06

CD8+PD-1+ клетки, %

(от Т-цитотоксических клеток)

CD8+PD-1+ cells, of% cytotoxic T-cells

19,05 ± 2,22

25,73 ± 2,03*

27,27 ± 2,9

21,83 ± 3,31

27,48 ± 5,29

CD8+PD-L1+ клетки, %
(от Т-цитотоксических клеток)

CD8+PD-L1+ cells, of% cytotoxic T-cells

0,76 ± 0,21

0,76 ± 0,21

1,46 ± 0,53

0,81 ± 0,22

0,1 ± 0,04

Примечание. * — достоверные различия между больными АА и здоровыми донорами (p < 0,05); ** — достоверные различия между больными АА в зависимости от степени тяжести заболевания (p < 0,05).
Note. * — significant differences in AA patients vs. healthy donors (p <0.05); ** — significant differences between AA patients relative to the disease severity (p < 0.05).

Субпопуляционный состав T-клеток костного мозга больных АА в зависимости от степени тяжести заболеванияПри сравнении основных субпопуляций Т-клеток у больных в зависимости от степени тяжести АА достоверные отличия (p < 0,05) были получены только в популяции двойных негативных (CD3+CD4-CD8-) Т-клеток (табл. 3). Однако у больных СТАА количество цитотоксических Т-клеток, эффекторных CD4+ и CD8+ клеток было больше, а количество Т-хелперов, наивных CD4+ и CD8+ клеток, CD8+ клеток «памяти» и регуляторных Т-клеток меньше, чем у больных НАА и ТАА (рис. 1). Эти отличия не были достоверными, вероятно, вследствие малого числа больных.

Сравнение субпопуляционного состава T-клеток костного мозга доноров и больных АА в зависимости от степени тяжести заболеванияПри сравнении каждой группы тяжести АА (НАА, ТАА, СТАА) с референсными значениями, полученными у доноров, были обнаружены достоверные отличия (р < 0,05) по следующим субпопуляциям Т-клеток: в группе НАА выявлено большее количество CD4+ клеток «памяти», эффекторных CD8+ клеток и меньшая доля наивных CD4+ и CD8+ клеток; в группе СТАА выявлено большее количество эффекторных CD4+ и CD8+ клеток, PD-1+CD4+ клеток и меньшее количество PD-L1+CD4+ и PD-L1+CD8+ клеток. Таким образом, более выраженные отличия субпопуляционного состава Т-клеток были получены у больных НАА и СТАА (рис. 1). Достоверных различий между остальными исследуемыми субпопуляциями не было выявлено, что может быть связано с небольшой выборкой больных в каждой группе.

Определение олигоклональности ТКР-Vβ-се­мейств у больных ААПри исследовании Т-клеточного репертуара Vβ-семейств Т-хелперов у больных АА величина определяемого клона не превышала 10 % по сравнению с референсными значениями доноров (рис. 2A). При анализе цитотоксических Т-клеток были определены клоны с преобладающими семействами, величина которых достигала 35 % по сравнению с референсными значениями (рис. 2Б).

В популяции Т-хелперов у больных наиболее часто встречались обогащенные семейства — Vβ 5.2 (n = 5), Vβ 16 (n = 5), Vβ 13.2 (n = 6), Vβ 8 (n = 8), Vβ 1 (n = 9), Vβ 20 (n = 12), Vβ 17 (n = 14). Четыре клона (Vβ 3, 5.3, 9, 23) из 24 Vβ-клонов не превышали референсных значений у всех больных АА. Только у 3 больных НАА не было выявлено клонов Vβ.

В популяции Т-хелперов был проведен анализ количества клонов Vβ в зависимости от степени тяжести АА. У 3 больных НАА не было выявлено расширения по ТКР-Vβа у 20 больных НАА количество обогащенных семейств Vβ варьировало от до 6. У всех больных ТАА было обнаружено обогащение как минимум одного семейства VβУ всех больных СТАА были обнаружены клоны ТКР-Vβ, однако их количество не превышало трех (рис. 2В, табл. 4).

В популяции CD8Т-клеток у больных наиболее часто встречались клоны — Vβ 1 (n = 5), Vβ 23 (n = 5), Vβ 16 (n = 7), Vβ 18 (n = 7), Vβ 7.2 (n = 9), Vβ 11 (n = 10), Vβ 17 (n = 12). Два Vβ-семейства (Vβ 5.1, 5.3) не превышали референсных значений ни у одного больного. При анализе CD8Т-клеток у двоих больных НАА и ТАА не было выявлено обогащенных семейств VβУ больных СТАА выявлялись ТКР-Vβ-клоны, и их количество варьировало от до 4 (рис. 2Г, табл. 4).


Рисунок 2
.
 Распределения Vβ-семейств в популяциях СD3+CD8и СD3+CD4клеток больных АА (n = 39). А — все Vβ-семейства, экспрессируемые на СD3+CD4+ клетках больных АА. Б — все Vβ-семейства, экспрессируемые на СD3+CD8+ клетках больных АА. В — доля Vβ-семейств в популяции СD3+CD4клеток, превышающих референсные значения. Г — доля Vβ-семейств в популяции СD3+CD8клеток, превышающих референсные значения
Figure 2Distribution of Vβ families in CD3+CD8+ and CD3+CD4+ populations in AA patients (n = 39). A  total CD3+CD4+-expressed Vβ families in AA patients. B  total CD3+CD8+-expressed Vβ families in AA patients. C  portion of CD3+CD4+-Vβ families exceeding reference values. D  portion of CD3+CD8+-Vβ families exceeding reference values

Таблица 4. Количественное обогащение семейств Vβ в общей группе больных АА, а также в зависимости от степени тяжести АА
Table 4Quantitative enrichment of Vβ families in all patients and AA severity groups

Т-хелперы (CD4+ клетки)

T-helper cells (CD4+ cells)

Цитотоксические клетки (CD8+ клетки)

Cytotoxic T-cells (CD8+ cells)

количество обогащенных Vβ-семейств, превышающих референсные значения

number of enriched Vβ families exceeding reference values

ТАА

SAA

(n = 11)

НАА

Non SAA

(n = 22)

СТАА

Very SAA

(n = 6)

больные АА с обогащением Vβ семейств

number of AA patients with Vβ enrichment

ТАА

SAA

(n = 11)

НАА

Non SAA

(n = 22)

СТАА

Very SAA

(n = 6)

больные АА с обогащением Vβ-семейств

number of AA patients with Vβ enrichment

0

3

3

1

1

-

2

1

4

5

2

11

1

7

1

9

2

2

5

1

8

4

7

2

13

3

4

6

3

13

5

4

2

11

4

1

2

3

2

1

3

5

-

1

1

6

-

1

1

Обсуждение

Настоящее исследование посвящено изучению субпопуляционного состава Т-клеток и исследованию репертуара Т-клеточного рецептора у больных АА с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Количества CD4и CD8+ Т-клеток достоверно не отличались у больных и доноров. При детальном исследовании субпопуляционного состава Т-клеток выявлено, что у больных АА наблюдался сдвиг в сторону терминальных эффекторных клеток. Субпопуляции Т-клеток памяти, обладающие эффекторной способностью, наряду с цитотоксическими клетками, могут быть источником продукции ИФН-γ при AA, который является негативным регулятором гемопоэза. Меньшая доля «наивных» СD4+ и CD8+ Т-клеток может свидетельствовать об истощении этих субпопуляций вследствие длительной антигенной стимуляции. Кроме того, у больных АА выявлена большая доля PD-1+ Т-клеток, а, как известно, PD-1-путь вовлечен в процесс активации Т-лимфоцитов, которые оказывают регуляторное воздействие на все этапы кроветворения [28].

Наиболее значительные различия были получены при анализе результатов в зависимости от степени тяжести АА. У больных ТАА и НАА все исследуемые субпопуляции Т-лимфоцитов были сопоставимы. У больных СТАА изменения субпопуляционного состава были наиболее выраженными. У этих больных была выявлена наименьшая доля двойных негативных Т-клеток (СD3+CD4-СD8-). Известно, что двойные негативные Т-клетки могут выступать в роли регуляторных клеток, предотвращая развитие аутоиммунных заболеваний [29]. Кроме того, у больных СТАА определялась наименьшая доля регуляторных Т-клеток, хотя эти отличия были недостоверными, что может быть связано с недостаточным числом больных. Считают, что T-рег играют ключевую роль в механизмах иммунной толерантности [30]. Основными функциями T-рег является их выраженная способность подавлять активацию Т-эффекторов или клеток «памяти», а также регулировать аутореактивность Т-клеток [31]. Уменьшенное количество T-рег не в состоянии подавить функцию активированных T-клеток, которые повреждают кроветворные клетки в КМ. Также можно предположить, что даже при «нормальном» количестве T-рег их функциональные свойства могут быть нарушены у больных АА. В работе S. Kordasti и соавт. [7] показано, что T-рег, выделенные у больных АА, крайне слабо подавляют секрецию ИФН-γ и фактора некроза опухоли-βчто является их функциональным дефектом.

Также обнаружено, что наибольшая доля PD-1-позитивных Т-клеток выявлялась у больных СТАА. В норме связывание PD-1 его лигандами PD-L1 и PD-L2 подавляет пролиферацию Т-клеток и продукцию цитокинов [14]. Аберрантная высокая экспрессия костимуляторных молекул, включая PD-1, возможно связана с постоянной активацией аутореактивных Т-клеток при АА. Повышенная экспрессия PD-1 на Т-клетках, обнаруженная в настоящем исследовании, по-видимому, не способствует подавлению функции Т-клеток. Однако механизм, лежащий в основе дисфункции PD-1, остается до сих пор неясным. Доля PD-1-позитивных Т-клеток может ассоциироваться со степенью тяжести АА. Таким образом, у больных СТАА определялся дефицит общего числа Т-хелперов и преобладание цитотоксических Т-клеток, значительное уменьшение количества регуляторных клеток, что согласуется с ранее опубликованными исследованиями [32][33][34].

Олигоклональная экспансия Т-клеток является ключевым событием в патогенезе АА. В многочисленных исследованиях показано обогащение Vβ-семейств в популяциях CD4+ и CD8+ Т-клеток. При этом изменения клонов Vβ в популяции Т-хелперов были значительно меньше, чем в популяции цитотоксических клеток [35][36][37]. Аналогичный результат получен в настоящем исследовании. При анализе репертуара ТКР-Vβ методом проточной цитофлуориметрии было обнаружено, что характер распределения семейств Vβ в T-хелперах поликлонален (рис. 2А). Несмотря на поликлональную картину, у 92,3 % больных АА среди CD4+ клеток выявлялось, как минимум, одно семейство Vβ, размер которого не превышал референсный интервал более чем на 10 % (рис. 2В), что не является значительным отклонением от референсных значений доноров.

В отличие от Т-хелперов в популяции цитотоксических Т-клеток размер выявляемых клонов ТКР-Vβ был более выраженным с максимальным значением обогащенного семейства у одного больного до 35 % (рис. 2Б). У 2 больных (5 %) не было выявлено увеличения Vβ-семейств в популяции цитотоксических клеток. Количество клонов у каждого больного варьировало от до 6, но с большей частотой определялось 1, 2 или 3 клона. Наиболее часто встречалось обогащение семейств Vβ 11, Vβ 17, Vβ 20, причем количество Vβ 17 было увеличено как среди Т-хелперов, так и среди цитотоксических клеток.

Определение репертуара ТКР-Vβ с помощью метода проточной цитофлуориметрии доступнее, быстрее и имеет меньшую стоимость по сравнению с секвенированием нового поколения и может быть выполнено с использованием коммерческого набора. Однако, используя данную методику, можно выявить только расширение определенного Vβ-семейства, что не эквивалентно понятию «клон», принятому в молекулярной биологии. Выявленные с помощью проточной цитофлуориметрии обогащенные Vβ-семейства у больных с АА могут быть использованы для оценки ответа на ИСТ и активности заболевания.

Таким образом, в настоящем исследовании проведен анализ значительного количества характеристик Т-лимфоцитов у большой группы больных АА. Были выявлены наиболее характерные особенности Т-клеточных субпопуляций у всех больных АА: увеличение количества цитотоксических Т-клеток, эффекторных CD4+ и CD8+ клеток, CD4+ клеток «памяти», что может подтверждать наличие длительной антигенной стимуляции с последующей активацией этих субпопуляций клеток, в результате которой происходит гиперэкспрессия провоспалительных цитокинов. Уменьшение «наивных» CD4+ и CD8+ клеток, регуляторных Т-клеток, двойных негативных Т-клеток (СD3+CD4-СD8-) доказывает снижение контроля за цитокинпродуцирующими Т-клетками.

Была установлена связь между степенью тяжести АА и количеством эффекторных Т-клеток, Т-регуляторных клеток, двойных негативных Т-клеток и PD-1-позитивных Т-клеток: самое большое количество потенциально цитокинпродуцирующих Т-клеток и минимальное количество клеток, участвующих в регуляции Т-клеточной активности, было выявлено у больных СТАА.

Сравнительный анализ проведен с использованием образцов КМ. В большинстве исследований анализ клеточных популяций у больных АА проводится на образцах периферической крови, однако в данной работе исследование КМ позволило получить более детальную информацию об изменениях Т-клеточных субпопуляций [7][38][39]. При анализе репертуара ТКР-Vβ была обнаружена олигоклональная экспансия преимущественно в субпопуляции цитотоксических Т-клеток. Можно предположить, что обогащение семейств Vβ свидетельствует о наличии аутореактивного Т-клеточного клона и подтверждает иммунный патогенез АА.

Требуется дальнейшее изучение многочисленных клеточных субпопуляций, участвующих в аномальном иммунном ответе при АА, так как ни аутоантигены, ни причины развития аутореактивности при АА не установлены. Подробное исследование субпопуляционного состава Т-клеток при этом заболевании необходимо для лучшего понимания патофизиологии АА, а также для поиска оптимальных программ лечения. Динамическое исследование ТКР-Vβ-репертуара может быть предложено в качестве мониторинга течения заболевания, учитывая, что доминантные клоны, выявляемые в дебюте болезни, могут вновь определяться перед рецидивом, являясь предвестником возврата болезни [23, 35]. Метод проточной цитофлуориметрии помогает выявлять значимые биомаркеры для мониторинга клонов Т-клеток при АА с целью наиболее точной оценки активности патологического процесса при АА, но для этого необходимы большая когорта больных и исследования на разных этапах терапии АА.

Список литературы

1. Михайлова Е.А., Фидарова З.Т., Устинова Е.Н. и др. Комбинированная иммуносупрессивная терапия больных апластической анемией: эффективность повторных курсов антитимоцитарного глобулина. Гематология и трансфузиология. 2014; 50(7): 11–8.

2. Kulagin A., Lisukov I., Ivanova M. et al. Prognostic value of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria clone presence in aplastic anaemia patients treated with combined immunosuppression: Results of two-centre prospective study. Br J Haematol. 2014; 164(4): 546–54. DOI: 10.1111/bjh.12661.

3. Young N.S., Calado R.T., Scheinberg P. Current concepts in the pathophysiology and treatment of aplastic anemia. Blood. 2006; 108(8): 2509–19. DOI: 10.1182/blood-2006-03-010777.

4. Chen J., Ellison F.M., Eckhaus M.A. et al. Minor antigen H60-mediated aplastic anemia is ameliorated by immunosuppression and the infusion of regulatory T-cells. J Immunol. 2007; 178(7): 4159–68. DOI: 10.4049/jimmunol.178.7.4159.

5. Risitano A.M., Maciejewski J.P., Green S. et al. In vivo dominant immune responses in aplastic anaemia: Molecular tracking of putatively pathogenetic T-cell clones by TCR β-CDR3 sequencing. Lancet. 2004; 364(9431): 355–64. DOI: 10.1016/S0140-6736(04)16724-X.

6. Zeng W., Kajigaya S., Chen G. et al. Transcript profile of CD4 + and CD8+ T-cells from the bone marrow of acquired aplastic anemia patients. Exp Hematol. 2004; 32(9): 806–14. DOI: 10.1016/j.exphem.2004.06.004.

7. Kordasti S., Marsh J., Al-Khan S. et al. Functional characterization of CD4+ T-cells in aplastic anemia. Blood. 2012; 119(9): 2033–43. DOI: 10.1182/blood-2011-08-368308.

8. Tau G., Rothman P. Biologic functions of the IFN-gamma receptors. Allergy. 1999; 54(12): 1233–51. DOI: 10.1034/j.1398-9995.1999.00099.x.

9. Solomou E.E., Rezvani K., Mielke S. et al. Deficient CD4+ CD25 + FOXP3+ T-regulatory cells in acquired aplastic anemia. Blood. 2007; 110(5): 1603–6. DOI: 10.1182/blood-2007-01-066258.

10. Shi J., Ge M., Lu S. et al. Intrinsic impairment of CD4+ CD25 + regulatory T-cells in acquired aplastic anemia. Blood. 2012; 120(8): 1624–32. DOI: 10.1182/blood-2011-11-390708.

11. Zoumbos N.C., Ferris W.O., Hsu S.‐M. et al. Analysis of lymphocyte subsets in patients with aplastic anaemia. Br J Haematol. 1984; 58(1): 95–105. DOI: 10.1111/j.1365-2141.1984.tb06063.x.

12. Ishida Y., Agata Y., Shibahara K. et al. Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. EMBO J. 1992; 11(11): 3887–95. DOI: 10.1002/j.1460-2075.1992.tb05481.x.

13. Keir M.E., Liang S.C., Guleria I. et al. Tissue expression of PD-L1 mediates peripheral T-cell tolerance. J Exp Med. 2006; 203(4): 883–95. DOI: 10.1084/jem.20051776.

14. Fife B.T., Pauken K.E. The role of the PD-1 pathway in autoimmunity and peripheral tolerance. Ann N Y Acad Sci. 2011; 1217(1): 45–59. DOI: 10.1111/j.17496632.2010.05919.x.

15. Zhao W., Zhang Y., Zhang P. et al. High programmed death 1 expression on T-cells in aplastic anemia. Immunol Lett. 2017; 183: 44–51. DOI: 10.1016/j.imlet.2017.01.016.

16. Wu H., Miao M., Zhang G. et al. Soluble PD-1 is associated with aberrant regulation of T-cells activation in aplastic anemia. Immunol Invest. 2009; 38(5): 408–21. DOI: 10.1080/08820130902912332.

17. Choo S.Y. The HLA system: genetics, immunology, clinical testing, and clinical implications. Yonsei Med J. 2007; 48(1): 11–23. DOI: 10.3349/ymj.2007.48.1.11.

18. Rudolph M.G., Stanfield R.L., Wilson I.A. How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors. Annu Rev Immunol. 2006; 24(1): 419–66. DOI: 10.1146/annurev.immunol.23.021704.115658.

19. Attygalle A., Al-Jehani R., Diss T.C. et al. Neoplastic T-cells in angioimmunoblastic T-cell lymphoma express CD10. Blood. 2002; 99(2): 627–33. DOI: 10.1182/blood.V99.2.627.

20. Cui J.H., Lin K.R., Yuan S.H. et al. TCR repertoire as a novel indicator for immune monitoring and prognosis assessment of patients with cervical cancer. Front Immunol. 2018; 9: 2729. DOI: 10.3389/fimmu.2018.02729.

21. Lundell R., Hartung L., Hill S. et al. T-cell large granular lymphocyte leukemias have multiple phenotypic abnormalities involving pan-T-cell antigens and receptors for MHC molecules. Am J Clin Pathol. 2005; 124(6): 937–46. DOI: 10.1309/PH7X78HF4FW4PRKW.

22. Kook H., Risitano A.M., Zeng W. et al. Changes in T-cell receptor VB repertoire in aplastic anemia: Effects of different immunosuppressive regimens. Blood. 2002; 99(10): 3668–75. DOI: 10.1182/blood.V99.10.3668.

23. Risitano A.M., Kook H., Zeng W. et al. Oligoclonal and polyclonal CD4 and CD8 lymphocytes in aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria measured by Vβ CDR3 spectratyping and flow cytometry. Blood. 2002; 100(1): 178–83. DOI: 10.1182/blood-2002-01-0236.

24. Rowen L., Koop B.F., Hood L. The complete 685-kilobase DNA sequence of the human β T-cell receptor locus. Science. 1996; 272(5269): 1755–62. DOI: 10.1126/science.272.5269.1755.

25. Tembhare P., Yuan C.M., Morris J.C. et al. Flow cytometric immunophenotypic assessment of T-cell clonality by Vβ repertoire analysis in fine-needle aspirates and cerebrospinal fluid. Am J Clin Pathol. 2012;137(2): 220–6. DOI: 10.1309/AJCPPT93VZMAREHK.

26. Cossarizza A., Chang H.D., Radbruch A. et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019; 49(10): 1457–973. DOI: 10.1002/eji.201970107.

27. Tembhare P., Yuan C.M., Xi L. et al. Flow cytometric immunophenotypic assessment of T-cell clonality by Vβ repertoire analysis: Detection of T-cell clonality at diagnosis and monitoring of minimal residual disease following therapy. Am J Clin Pathol. 2011; 135(6): 890–900. DOI: 10.1309/AJCPV2D1DDSGJDBW.

28. Cheng X., Veverka V., Radhakrishnan A. et al. Structure and interactions of the human programmed cell death 1 receptor. J Biol Chem. 2013; 288(17): 11771–85. DOI: 10.1074/jbc.M112.448126.

29. Juvet S.C., Zhang L. Double negative regulatory T-cells in transplantation and autoimmunity: Recent progress and future directions. J Mol Cell Biol. 2012; 4(1): 48–58. DOI: 10.1093/jmcb/mjr043.

30. Hall B.M. T-cells: Soldiers and spies — the surveillance and control of effector T-cells by regulatory T-cells. Clin J Am Soc Nephrol. 2015; 10(11): 2050–64. DOI: 10.2215/CJN.06620714.

31. Okada R., Kondo T., Matsuki F. et al. Phenotypic classification of human CD4+ T-cell subsets and their differentiation. Int Immunol. 2008; 20(9): 1189–99. DOI: 10.1093/intimm/dxn075.

32. Young N.S., Scheinberg P., Calado R.T. Aplastic anemia. Curr Opin Hematol. 2008; 15(3): 162–8. DOI: 10.1097/MOH.0b013e3282fa7470.

33. Qi W., Ren Y., Fu R. et al. Detection and significance of CD4+ CD25+ CD127dim regulatory T-cells in individuals with severe aplastic anemia. Turkish J Hematol. 2015; 32(3): 220–7. DOI: 10.4274/tjh.2013.0410.

34. Yan L., Fu R., Liu H. et al. Abnormal quantity and function of regulatory T-cells in peripheral blood of patients with severe aplastic anemia. Cell Immunol. 2015; 296(2): 95–105. DOI: 10.1016/j.cellimm.2015.04.001.

35. Giudice V., Feng X., Lin Z. et al. Deep sequencing and flow cytometric characterization of expanded effector memory CD8+ CD57 + T-cells frequently reveals T-cell receptor Vβ oligoclonality and CDR3 homology in acquired aplastic anemia. Haematologica. 2018; 103(5): 759–69. DOI: 10.3324/haematol.2017.176701.

36. Guan J., Sun Y., Fu R. et al. A cohort study of immune and hematopoietic functionality changes in severe aplastic anemia patients treated with immunosuppressive therapy. Medicine. 2019; 98(3): e14149. DOI: 10.1097/MD.0000000000014149.

37. Maciejewski J.P., Risitano A., Kook H. et al. Immune pathophysiology of aplastic anemia. Int J Hematol. 2002; 76 Suppl 1: 207–14. DOI: 10.1007/BF03165246.

38. Appay V., Van Lier R.A.W., Sallusto F. et al. Phenotype and function of human T lymphocyte subsets: Consensus and issues. Cytom Part A. 2008; 73(11): 975–83. DOI: 10.1002/cyto.a.20643.

39. Zhang H.F., Huang Z.D., Wu X.R. et al. Comparison of T lymphocyte subsets in aplastic anemia and hypoplastic myelodysplastic syndromes. Life Sci. 2017; 189: 71–5. DOI: 10.1016/j.lfs.2017.09.020.


Об авторах

А. В. Абрамова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Абрамова Анастасия Владимировна, врач отделения высокодозной интенсивной химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения с круглосуточным стационаром

125167, Москва



И. В. Гальцева
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Гальцева Ирина Владимировна, кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга

125167, Москва



Е. А. Михайлова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Михайлова Елена Алексеевна, доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник отделения высокодозной интенсивной химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения с круглосуточным стационаром

125167, Москва



Н. М. Капранов
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Капранов Николай Михайлович, медицинский физик лаборатории иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга

125167, Москва



Ю. О. Давыдова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Давыдова Юлия Олеговна, врач клинической лабораторной диагностики лаборатории иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга

125167, Москва



З. Т. Фидарова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Фидарова Залина Таймуразовна, кандидат медицинских наук, заведующая отделением химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения с дневным стационаром

125167, Москва



В. В. Троицкая
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Троицкая Вера Витальевна, кандидат медицинских наук, заведующая отделением интенсивной высокодозной химиотерапии гемобластозов и депрессий кроветворения с круглосуточным стационаром; заместитель генерального директора по лечебной работе

125167, Москва



Е. Н. Паровичникова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Паровичникова Елена Николаевна, доктор медицинских наук, руководитель отдела химиотерапии гемобластозов, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга

125167, Москва



В. Г. Савченко
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Россия

Савченко Валерий Григорьевич, доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, генеральный директор

125167, Москва



Для цитирования:


Абрамова А.В., Гальцева И.В., Михайлова Е.А., Капранов Н.М., Давыдова Ю.О., Фидарова З.Т., Троицкая В.В., Паровичникова Е.Н., Савченко В.Г. Олигоклональность и субпопуляционный состав Т-клеток костного мозга у больных апластической анемией. Гематология и трансфузиология. 2020;65(4):417-430. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2020-65-4-417-430

For citation:


Abramova A.V., Galtseva I.V., Mikhailova E.A., Kapranov N.M., Davydova Yu.O., Fidarova Z.T., Troitskaya V.V., Parovichnikova E.N., Savchenko V.G. Oligoclonality and subpopulation structure of bone marrow T-cells in patients with aplastic anaemia. Russian journal of hematology and transfusiology. 2020;65(4):417-430. (In Russ.) https://doi.org/10.35754/0234-5730-2020-65-4-417-430

Просмотров: 63


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0234-5730 (Print)
ISSN 2411-3042 (Online)