Олигоклональность и субпопуляционный состав Т-клеток костного мозга у больных апластической анемией

Введение

Апластическая анемия (АА) — это редко встречающееся заболевание системы крови, характеризующееся тяжелой костномозговой недостаточностью с истощением пула гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Исследования, посвященные изучению АА, свидетельствуют об аутоиммунном механизме развития заболевания [1][2][3]. Главную роль в развитии аутоиммунных реакций при АА играют активированные цитотоксические T-клетки, распознающие аутоантигены, представленные на гемопоэтических стволовых клетках с помощью молекул HLA (Human Leukocyte Antigens) класса I [4][5]. Результаты исследований указывают на наличие антигенного стимула, который приводит к патологической активации и дисрегуляции CD4+ Т-клеток в костном мозге (КМ) и повышенной секреции провоспалительных цитокинов, основными из которых являются интерферон-γ (ИФН-γ) и фактор некроза опухоли-α [3][6][7]. Пусковой фактор активации иммунной системы неизвестен. Поэтому более детальное понимание иммунных механизмов развития болезни необходимо при разработке долгосрочного эффективного лечения.

ИФН-γ регулирует взаимодействие клеток, участвующих в иммунном ответе. Являясь продуктом Т-хелперов 1-го типа, он вместе с другими провоспалительными цитокинами активирует цитотоксические Т-лимфоциты (CD8+) и усиливает фагоцитарные и цитотоксические реакции в очаге воспаления, которым в данном случае является КМ [8]. В КМ больных AA выявляется выраженная качественная и количественная недостаточность регуляторных T-клеток (T-рег), которые в нормальных условиях подавляют аутореактивность других популяций T-клеток, в частности в отношении к ГСК [9][10]. Особую роль в иммунном ответе при АА играют T-хелперы, которые при активации начинают секретировать интерлейкин-2, что обеспечивает пролиферацию цитотоксических Т-лимфоцитов, которые, в свою очередь, являются источником продукции провоспалительных цитокинов [11].

Иммунный ответ и регуляцию активности Т-клеточного звена контролируют костимуляторные молекулы, которые в условиях активации Т-клеток способствуют ингибированию пролиферации, эффекторной функции (секреция цитокинов) и индукции апоптоза Т-клеток [12]. В нормальных условиях этот механизм ингибирования предотвращает чрезмерную активацию популяций Т-клеток, например нежелательные аутоиммунные реакции, поддерживая периферическую иммунную толерантность. Одной из таких костимуляторных молекул является PD-1 (Programmed cell death-1) — костимуляторный рецептор семейства CD28, который, взаимодействуя со своим лигандом PD-L1/PD-L2, ингибирует сигнальный путь, вовлеченный в активацию Т-клеток и тем самым способствует подавлению активности Т-клеток и индукции апоптоза [13]. Блокировка либо PD-1, либо его лигандов способствует развитию системных и органоспецифических аутоиммунных заболеваний, что подтверждено в экспериментах на животных [14]. Результаты немногочисленных исследований показали повышенную экспрессию PD-1-рецептора на поверхности Т-клеток больных АА, что, вероятно, связано с аберрантной регуляцией активации Т-клеток при данном заболевании [15][16]. Однако связь между высокой экспрессией PD-1 и AA не изучена.

Имеются данные о том, что у больных АА в КМ происходит пролиферация аутореактивных клонов цитотоксических Т-лимфоцитов. Этот процесс называют также олигоклональным обогащением (расширением) или экспансией Т-клеток [5][10].

Аутоантиген потенциально может быть распознан Т-клеткой с определенным вариантом Т-клеточного рецептора (ТКР). Взаимодействие ТКР с антигеном ведет к активации Т-лимфоцита и является ключевым событием в запуске иммунного ответа [17]. ТКР состоит из двух субъединиц — α и β либо γ и δ. В каждой субъединице расположены два домена — константный (С), который закрепляет рецептор в плазматической мембране Т-лимфоцита, и вариабельный (V), который непосредственно отвечает за распознавание антигена. Узнавание Т-клеточным рецептором обширного спектра разнообразных антигенов достигается путем перегруппировки и рекомбинации V(D)J (V — variable, D — diversity и J — joining) участков генов вариабельных частей α- и β-цепей ТКР. Наибольшая изменчивость ТКР сосредоточена в участке CDR3 (complementarity determining region, CDR), который и определяет связывание рецептора с антигеном [18]. Именно этот участок представляет основной интерес при исследовании репертуара ТКР. Анализ перестройки ТКР обычно используется в диагностике лимфоидных злокачественных новообразований и может быть важным инструментом в изучении Т-клеточных реакций на патогены, и в том числе при аутоиммунных заболеваниях [19][20].

При АА происходит нарушение иммунной регуляции и срыв толерантности к собственным антигенам, что приводит к пролиферации аутореактивных клонов Т-клеток [21][22][23]. Учитывая разнообразие спектра распознавания ТКР, идентификация иммунодоминантных клонов остается сложной задачей. Изучение Т-клеток и их клонального состава представляется актуальным в исследовании иммуноопосредованных гематологических заболеваний, так как может помочь в отслеживании активности заболевания, прогнозировании ответа на иммуносупрессивную терапию (ИСТ) и рецидива.

Известно несколько методических подходов к изучению клонального состава Т-клеток: определение клональности по реаранжировкам генов ТКР с помощью фрагментного анализа, секвенирование нового поколения или количественное определение Т-клеток с конкретным типом вариабельного домена β-цепи ТКР (репертуар ТКР-Vβ) методом проточной цитофлуориметрии. Существует 65 Vβ-сегментов в β-локусе ТКР, которые можно сгруппировать в 25 семейств (22 функциональных семейства), причем каждый член данного семейства имеет более 75 % гомологии на уровне нуклео­тидов по меньшей мере с одним из других членов того же семейства [24]. Созданы моноклональные антитела, специфично связывающиеся с ТКР, принадлежащим к определенному Vβ-семейству. Частота встречаемости различных ТКР-Vβ-семейств отличается между собой, изучена и известна у здоровых людей в периферической крови. Увеличение доли какого-либо из Vβ-семейств выше верхней границы нормы может свидетельствовать о наличии Т-клеточного клона в пределах данного семейства [25]. Многоцветная проточная цитометрия позволяет также изучать функциональные подгруппы Т-клеток и маркеры активации [26]. Данные подходы дают детальное представление о характере Т-клеточного ответа и могут быть использованы для изучения иммунного механизма развития АА.

Целью исследования было изучение субпопуляционного состава Т-клеток и репертуара Т-клеточного рецептора у больных АА.

Материалы и методы

В исследование были включены больные АА (n = 40), обследовавшиеся в ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России до начала ИСТ с 2018 по 2020 г. и подписавшие информированное согласие на включение в исследование. Соотношение мужчин и женщин составило 1 : 1,2, медиана возраста — 25 (17–60) лет. Диагноз АА устанавливался на основании следующих критериев: трехростковая цитопения, малоклеточный КМ, отсутствие мегакариоцитов по данным миелограммы, аплазия при гистологическом исследовании КМ, отсутствие цитогенетических аномалий. Больные были разделены на три группы в зависимости от степени тяжести: нетяжелая АА (НАА) (n = 23), тяжелая АА (ТАА) (n = 11) и сверхтяжелая АА (СТАА) (n = 6). Основным критерием тяжести АА являлось количество гранулоцитов в периферической крови в дебюте заболевания (нейтрофилы более 0,5 × 109/л — для НАА, 0,2–0,5 × 109/л — для ТАА и менее 0,2 × 109/л — для СТАА). Материал для исследования — первая порция аспирата КМ, полученная во время диагностических стернальных пункций. В качестве контрольной группы для определения субпопуляций T-клеток и экспансии клонов Vβ Т-клеток использовали КМ 23 здоровых доноров КМ, подписавших информированное согласие на включение в исследование. Медиана возраста доноров составила 31 (19–52) год.

Определение субпопуляционного состава T-лим­фо­цитов проводили с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Для этого была разработана панель моноклональных антител к антигенам дифференцировки человека, меченых различными флуорохромными красителями, представленная в таблице 1. Использование данной панели моноклональных антител позволяет определить относительное количество Т-клеточных субпопуляций, представленных в таблице 2.

Таблица 1. Моноклональные антитела к антигенам дифференцировки человека, использованные в исследовании
Table 1. Monoclonal antibodies to human differentiation antigens used in the study

Таблица 2. Основные Т-клеточные субпопуляции и фенотип клеток, определяемые в исследовании
Table 2. Main T-cell subpopulations and phenotypes defined in the study

Для анализа ТКР-Vβ-репертуара Т-лимфоцитов КМ больных (n = 39) (данные одного пациента были удалены из исследования вследствие ошибки подготовки пробы) был использован коммерческий набор IOTest Beta Mark ТКР-Vβ Repertoire (Beckman Coulter, Майами, Флорида, США), позволяющий оценить следующие семейства ТКР-Vβ: Vβ 1, Vβ 2, Vβ 3, Vβ 4, Vβ 5.1, Vβ 5.2, Vβ 5.3 , Vβ 7.1, Vβ 7.2, Vβ 8, Vβ 9, Vβ 11, Vβ 12, Vβ 13.1, Vβ 13.2, Vβ 13.6, Vβ 14, Vβ 16, Vβ 17, Vβ 18, Vβ 20, Vβ 21.3, Vβ 22 и Vβ 23. Данный набор включает 8 смесей моноклональных антител — каждая содержит антитела против 3 различных областей TКР-Vβ-семейств, охватывающих 24 антигена TКР-Vβ, что соответствует приблизительно 70 % нормального репертуара TКР-Vβ человека [27].

Изучали репертуар ТКР-Vβ для Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток отдельно. Система IOTest Beta Mark была адаптирована для исследования образцов КМ здоровых доноров и больных АА. Поскольку в литературе указаны референсные значения для ТКР-Vβ только в периферической крови, необходимо было уточнить референсные границы для ТКР-Vβ в КМ. Обогащенным считали семейство Vβ, если оно выходило за верхнюю границу уточненного референсного интервала. Если все значения ТКР-Vβ находились в пределах референсных интервалов доноров, то такие значения считали поликлональными. Олигоклональный результат определяли при наличии преобладания одного и более обогащенных Vβ-семейств, без поликлонального фона.

Статистическая обработка. Статистическая обработка выполнена с помощью R 3.6.3, GraphPad PRISM 8.0. Границы референсных интервалов для каждого из 24 клонов были рассчитаны на основании анализа КМ доноров и включали значения от 2,5 до 97,5 процентиля после исключения выбросов. Если у больного доля клеток с определенным семейством Vβ превышала референсное значение, то делали вывод о том, что у больного выявляется клон c данным ТКР-Vβ-семейством. Для определения соответствия распределения нормальному использовали критерий Шапиро — Уилка. Для определения отличий в долях различных субпопуляций T-клеток у больных и доноров использовали T-критерий Стьюдента, если данные были распределены нормально, и критерий Манна — Уитни — в случае ненормальных распределений. Сравнение субпопуляций T-клеток у больных АА с различной степенью тяжести и доноров осуществлялось с помощью критерия Краскела — Уоллиса с поправкой на множественные сравнения Данна. Для всех использованных критериев значимым был выбран уровень p < 0,05. Данные в таблицах представлены в виде среднего ± стандартной ошибки среднего.

Результаты

Субпопуляционный состав T-клеток костного мозга больных АА и доноров. При анализе субпопуляционного состава Т-клеток у больных АА выявлена достоверно (p < 0,05) большая доля CD4+ и CD8+ эффекторных клеток, СD4+ клеток «памяти», CD4+PD-1+ и CD8+PD-1+, а количество субпопуляций CD4+ и СD8+ наивных клеток, CD4+PD-L1+ было достоверно (p < 0,05) меньше по сравнению с аналогичными субпопуляциями доноров (рис. 1). Субпопуляции CD4+, CD8+, CD3+CD4+CD8+ (двойные позитивные Т-клетки), CD3+CD4-CD8- (двойные негативные Т-клетки), CD8+ клеток «памяти», регуляторных Т-клеток, активированных CD4+ и CD8+, CD8+PD-L1+ клеток больных достоверно не отличались от аналогичных субпопуляций доноров (табл. 3).

Рисунок 1. Субпопуляции Т-лимфоцитов у больных АА в сравнении с донорами и в зависимости от степени тяжести АА (Т-хелперы, цитотоксические клетки, наивные и Т-клетки «памяти», эффекторные Т-клетки, TNK-клетки, регуляторные Т-клетки, двойные позитивные и двойные негативные Т-клетки, доля PD-1- и PD-L1-позитивных клеток среди популяции Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток)
Figure 1. T-lymphocyte subpopulations in AA patients compared to donors and relative to AA severity (T-helper cells, cytotoxic cells, naive and memory T-cells, effector T-cells, TNK cells, regulatory T-cells, double positive and double negative T-cells, portions of PD-1 and PD-L1 positive cells in T-helper cells and cytotoxic T-cell populations)

Таблица 3. Относительное количество субпопуляций Т-клеток у больных АА и доноров КМ
Table 3. Relative T-cell subpopulation counts in AA patients and bone marrow donors

Примечание. * — достоверные различия между больными АА и здоровыми донорами (p < 0,05); ** — достоверные различия между больными АА в зависимости от степени тяжести заболевания (p < 0,05).
Note. * — significant differences in AA patients vs. healthy donors (p <0.05); ** — significant differences between AA patients relative to the disease severity (p < 0.05).

Субпопуляционный состав T-клеток костного мозга больных АА в зависимости от степени тяжести заболевания. При сравнении основных субпопуляций Т-клеток у больных в зависимости от степени тяжести АА достоверные отличия (p < 0,05) были получены только в популяции двойных негативных (CD3+CD4-CD8-) Т-клеток (табл. 3). Однако у больных СТАА количество цитотоксических Т-клеток, эффекторных CD4+ и CD8+ клеток было больше, а количество Т-хелперов, наивных CD4+ и CD8+ клеток, CD8+ клеток «памяти» и регуляторных Т-клеток меньше, чем у больных НАА и ТАА (рис. 1). Эти отличия не были достоверными, вероятно, вследствие малого числа больных.

Сравнение субпопуляционного состава T-клеток костного мозга доноров и больных АА в зависимости от степени тяжести заболевания. При сравнении каждой группы тяжести АА (НАА, ТАА, СТАА) с референсными значениями, полученными у доноров, были обнаружены достоверные отличия (р < 0,05) по следующим субпопуляциям Т-клеток: в группе НАА выявлено большее количество CD4+ клеток «памяти», эффекторных CD8+ клеток и меньшая доля наивных CD4+ и CD8+ клеток; в группе СТАА выявлено большее количество эффекторных CD4+ и CD8+ клеток, PD-1+CD4+ клеток и меньшее количество PD-L1+CD4+ и PD-L1+CD8+ клеток. Таким образом, более выраженные отличия субпопуляционного состава Т-клеток были получены у больных НАА и СТАА (рис. 1). Достоверных различий между остальными исследуемыми субпопуляциями не было выявлено, что может быть связано с небольшой выборкой больных в каждой группе.

Определение олигоклональности ТКР-Vβ-се­мейств у больных АА. При исследовании Т-клеточного репертуара Vβ-семейств Т-хелперов у больных АА величина определяемого клона не превышала 10 % по сравнению с референсными значениями доноров (рис. 2A). При анализе цитотоксических Т-клеток были определены клоны с преобладающими семействами, величина которых достигала 35 % по сравнению с референсными значениями (рис. 2Б).

В популяции Т-хелперов у больных наиболее часто встречались обогащенные семейства — Vβ 5.2 (n = 5), Vβ 16 (n = 5), Vβ 13.2 (n = 6), Vβ 8 (n = 8), Vβ 1 (n = 9), Vβ 20 (n = 12), Vβ 17 (n = 14). Четыре клона (Vβ 3, 5.3, 9, 23) из 24 Vβ-клонов не превышали референсных значений у всех больных АА. Только у 3 больных НАА не было выявлено клонов Vβ.

В популяции Т-хелперов был проведен анализ количества клонов Vβ в зависимости от степени тяжести АА. У 3 больных НАА не было выявлено расширения по ТКР-Vβ, а у 20 больных НАА количество обогащенных семейств Vβ варьировало от 1 до 6. У всех больных ТАА было обнаружено обогащение как минимум одного семейства Vβ. У всех больных СТАА были обнаружены клоны ТКР-Vβ, однако их количество не превышало трех (рис. 2В, табл. 4).

В популяции CD8+ Т-клеток у больных наиболее часто встречались клоны — Vβ 1 (n = 5), Vβ 23 (n = 5), Vβ 16 (n = 7), Vβ 18 (n = 7), Vβ 7.2 (n = 9), Vβ 11 (n = 10), Vβ 17 (n = 12). Два Vβ-семейства (Vβ 5.1, 5.3) не превышали референсных значений ни у одного больного. При анализе CD8+ Т-клеток у двоих больных НАА и ТАА не было выявлено обогащенных семейств Vβ. У больных СТАА выявлялись ТКР-Vβ-клоны, и их количество варьировало от 1 до 4 (рис. 2Г, табл. 4).

Рисунок 2. Распределения Vβ-семейств в популяциях СD3+CD8+ и СD3+CD4+ клеток больных АА (n = 39). А — все Vβ-семейства, экспрессируемые на СD3+CD4+ клетках больных АА. Б — все Vβ-семейства, экспрессируемые на СD3+CD8+ клетках больных АА. В — доля Vβ-семейств в популяции СD3+CD4+ клеток, превышающих референсные значения. Г — доля Vβ-семейств в популяции СD3+CD8+ клеток, превышающих референсные значения
Figure 2. Distribution of Vβ families in CD3+CD8+ and CD3+CD4+ populations in AA patients (n = 39). A — total CD3+CD4+-expressed Vβ families in AA patients. B — total CD3+CD8+-expressed Vβ families in AA patients. C — portion of CD3+CD4+-Vβ families exceeding reference values. D — portion of CD3+CD8+-Vβ families exceeding reference values

Таблица 4. Количественное обогащение семейств Vβ в общей группе больных АА, а также в зависимости от степени тяжести АА
Table 4. Quantitative enrichment of Vβ families in all patients and AA severity groups

Обсуждение

Настоящее исследование посвящено изучению субпопуляционного состава Т-клеток и исследованию репертуара Т-клеточного рецептора у больных АА с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Количества CD4+ и CD8+ Т-клеток достоверно не отличались у больных и доноров. При детальном исследовании субпопуляционного состава Т-клеток выявлено, что у больных АА наблюдался сдвиг в сторону терминальных эффекторных клеток. Субпопуляции Т-клеток памяти, обладающие эффекторной способностью, наряду с цитотоксическими клетками, могут быть источником продукции ИФН-γ при AA, который является негативным регулятором гемопоэза. Меньшая доля «наивных» СD4+ и CD8+ Т-клеток может свидетельствовать об истощении этих субпопуляций вследствие длительной антигенной стимуляции. Кроме того, у больных АА выявлена большая доля PD-1+ Т-клеток, а, как известно, PD-1-путь вовлечен в процесс активации Т-лимфоцитов, которые оказывают регуляторное воздействие на все этапы кроветворения [28].

Наиболее значительные различия были получены при анализе результатов в зависимости от степени тяжести АА. У больных ТАА и НАА все исследуемые субпопуляции Т-лимфоцитов были сопоставимы. У больных СТАА изменения субпопуляционного состава были наиболее выраженными. У этих больных была выявлена наименьшая доля двойных негативных Т-клеток (СD3+CD4-СD8-). Известно, что двойные негативные Т-клетки могут выступать в роли регуляторных клеток, предотвращая развитие аутоиммунных заболеваний [29]. Кроме того, у больных СТАА определялась наименьшая доля регуляторных Т-клеток, хотя эти отличия были недостоверными, что может быть связано с недостаточным числом больных. Считают, что T-рег играют ключевую роль в механизмах иммунной толерантности [30]. Основными функциями T-рег является их выраженная способность подавлять активацию Т-эффекторов или клеток «памяти», а также регулировать аутореактивность Т-клеток [31]. Уменьшенное количество T-рег не в состоянии подавить функцию активированных T-клеток, которые повреждают кроветворные клетки в КМ. Также можно предположить, что даже при «нормальном» количестве T-рег их функциональные свойства могут быть нарушены у больных АА. В работе S. Kordasti и соавт. [7] показано, что T-рег, выделенные у больных АА, крайне слабо подавляют секрецию ИФН-γ и фактора некроза опухоли-β, что является их функциональным дефектом.

Также обнаружено, что наибольшая доля PD-1-позитивных Т-клеток выявлялась у больных СТАА. В норме связывание PD-1 его лигандами PD-L1 и PD-L2 подавляет пролиферацию Т-клеток и продукцию цитокинов [14]. Аберрантная высокая экспрессия костимуляторных молекул, включая PD-1, возможно связана с постоянной активацией аутореактивных Т-клеток при АА. Повышенная экспрессия PD-1 на Т-клетках, обнаруженная в настоящем исследовании, по-видимому, не способствует подавлению функции Т-клеток. Однако механизм, лежащий в основе дисфункции PD-1, остается до сих пор неясным. Доля PD-1-позитивных Т-клеток может ассоциироваться со степенью тяжести АА. Таким образом, у больных СТАА определялся дефицит общего числа Т-хелперов и преобладание цитотоксических Т-клеток, значительное уменьшение количества регуляторных клеток, что согласуется с ранее опубликованными исследованиями [32][33][34].

Олигоклональная экспансия Т-клеток является ключевым событием в патогенезе АА. В многочисленных исследованиях показано обогащение Vβ-семейств в популяциях CD4+ и CD8+ Т-клеток. При этом изменения клонов Vβ в популяции Т-хелперов были значительно меньше, чем в популяции цитотоксических клеток [35][36][37]. Аналогичный результат получен в настоящем исследовании. При анализе репертуара ТКР-Vβ методом проточной цитофлуориметрии было обнаружено, что характер распределения семейств Vβ в T-хелперах поликлонален (рис. 2А). Несмотря на поликлональную картину, у 92,3 % больных АА среди CD4+ клеток выявлялось, как минимум, одно семейство Vβ, размер которого не превышал референсный интервал более чем на 10 % (рис. 2В), что не является значительным отклонением от референсных значений доноров.

В отличие от Т-хелперов в популяции цитотоксических Т-клеток размер выявляемых клонов ТКР-Vβ был более выраженным с максимальным значением обогащенного семейства у одного больного до 35 % (рис. 2Б). У 2 больных (5 %) не было выявлено увеличения Vβ-семейств в популяции цитотоксических клеток. Количество клонов у каждого больного варьировало от 1 до 6, но с большей частотой определялось 1, 2 или 3 клона. Наиболее часто встречалось обогащение семейств Vβ 11, Vβ 17, Vβ 20, причем количество Vβ 17 было увеличено как среди Т-хелперов, так и среди цитотоксических клеток.

Определение репертуара ТКР-Vβ с помощью метода проточной цитофлуориметрии доступнее, быстрее и имеет меньшую стоимость по сравнению с секвенированием нового поколения и может быть выполнено с использованием коммерческого набора. Однако, используя данную методику, можно выявить только расширение определенного Vβ-семейства, что не эквивалентно понятию «клон», принятому в молекулярной биологии. Выявленные с помощью проточной цитофлуориметрии обогащенные Vβ-семейства у больных с АА могут быть использованы для оценки ответа на ИСТ и активности заболевания.

Таким образом, в настоящем исследовании проведен анализ значительного количества характеристик Т-лимфоцитов у большой группы больных АА. Были выявлены наиболее характерные особенности Т-клеточных субпопуляций у всех больных АА: увеличение количества цитотоксических Т-клеток, эффекторных CD4+ и CD8+ клеток, CD4+ клеток «памяти», что может подтверждать наличие длительной антигенной стимуляции с последующей активацией этих субпопуляций клеток, в результате которой происходит гиперэкспрессия провоспалительных цитокинов. Уменьшение «наивных» CD4+ и CD8+ клеток, регуляторных Т-клеток, двойных негативных Т-клеток (СD3+CD4-СD8-) доказывает снижение контроля за цитокинпродуцирующими Т-клетками.

Была установлена связь между степенью тяжести АА и количеством эффекторных Т-клеток, Т-регуляторных клеток, двойных негативных Т-клеток и PD-1-позитивных Т-клеток: самое большое количество потенциально цитокинпродуцирующих Т-клеток и минимальное количество клеток, участвующих в регуляции Т-клеточной активности, было выявлено у больных СТАА.

Сравнительный анализ проведен с использованием образцов КМ. В большинстве исследований анализ клеточных популяций у больных АА проводится на образцах периферической крови, однако в данной работе исследование КМ позволило получить более детальную информацию об изменениях Т-клеточных субпопуляций [7][38][39]. При анализе репертуара ТКР-Vβ была обнаружена олигоклональная экспансия преимущественно в субпопуляции цитотоксических Т-клеток. Можно предположить, что обогащение семейств Vβ свидетельствует о наличии аутореактивного Т-клеточного клона и подтверждает иммунный патогенез АА.

Требуется дальнейшее изучение многочисленных клеточных субпопуляций, участвующих в аномальном иммунном ответе при АА, так как ни аутоантигены, ни причины развития аутореактивности при АА не установлены. Подробное исследование субпопуляционного состава Т-клеток при этом заболевании необходимо для лучшего понимания патофизиологии АА, а также для поиска оптимальных программ лечения. Динамическое исследование ТКР-Vβ-репертуара может быть предложено в качестве мониторинга течения заболевания, учитывая, что доминантные клоны, выявляемые в дебюте болезни, могут вновь определяться перед рецидивом, являясь предвестником возврата болезни [23, 35]. Метод проточной цитофлуориметрии помогает выявлять значимые биомаркеры для мониторинга клонов Т-клеток при АА с целью наиболее точной оценки активности патологического процесса при АА, но для этого необходимы большая когорта больных и исследования на разных этапах терапии АА.